Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R35-GM128625 כדי J.I.F.B.].

1. תכשירים
<ol><li>
Sc-−U-−H-צלחות (צלחות פטרי 150 מ מ) הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול זני שמרים את הדנ א-פיתיון.<ol>
<li>להמיס את הנשירה תערובת בסיס חנקן שמרים (YNB), hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH M 5 (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה; ראה בטבלה 2 עבור הרכב). שופכים ?...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

EY1H רובוטית ההזדווגות ההקרנה הגישה המתוארת כאן במידה רבה מגדילה את התפוקה כדי לזהות את קבוצת TFs לאגד לאזור ה-DNA של עניין, לעומת ההקרנה ספריה הקודמים או הקרנה ערוכים גישות המבוסס על שינוי. יתר על כן, את האינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H מבחני הם מאוד לשחזור, כמו 90% של אינטראקציות שזוהו הן חיובית ...

בעיה מרכזית בתחום הביו-רפואי הוא בקביעת המנגנון שבאמצעותו מוסדר כל הגן האנושי. תמלול היא הצעד הראשון בשליטה על רמות ביטוי גנים, זה מוסדר על ידי קבוצות של גורמי שעתוק (TFs) ייחודיים לכל הגנים. נתון כי בני אדם קידוד עבור > 1,500 TFs1,2, המזהה את הערכה המלאה של TFs השולטים הביטוי של כל הגן נותר אתגר פתוח.
שני סוגים של שיטות יכול לשמש כדי למפות TF-DNA אינטראקציות: שיטות ממורכז TF וממורכז הדנ א3 (איור 1 א'). בשיטות TF ממורכז, TF עניין הוא נחקר עבור איגוד לאזורים דנ א גנומי או כדי לקבוע שלה ירידה לפרטים איגוד ה-DNA. שיטות אלה כוללות immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ואחריו רצף תפוקה גבוהה, מיקרו-מערכים מחייב חלבון ו- SELEX4,5,6. בשיטות ממורכז דנ א, רצף ה-DNA של עניין הוא נחקר כדי לקבוע את קבוצת שר זה לאגד רצף ה-DNA. אפלייד נרחב ביותר של שיטות כאלה היא מבחני שמרים אחד-היברידית (Y1H), באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב הגנים7,8,9.
מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן כתב ג'ין הפעלה9,10 (איור 1B). דנ א-הפיתיון שוכפל במעלה הזרם של כתב שני גנים (LacZ ו HIS3) וקבועים DNA-bait::reporter שני משולבים לתוך הגנום שמרים ליצירת chromatinized 'DNA-פיתיון זנים.' TF-הטרף, המקודדת על פלסמיד המבטאת של TF התמזגו לתחום הפעלה (AD) של השמרים Gal4 TF, מוחדרים המתח DNA-פיתיון לדוג עבור אינטראקציות TF-DNA. אם TF-הטרף נקשר רצף ה-DNA-פיתיון, ואז המודעה נוכח TF-הטרף יוביל להפעלת שתי גנים כתב. כתוצאה מכך, תאים עם השפעה חיובית הדדית יכול להיות שנבחר עבור הצמיחה על צלחות חסר היסטידין, כמו גם התגברות על מעכב תחרותי, 3-אמינו-1,2,4-triazole (3-AT), דמיינו כמו מושבות כחול בנוכחות X-גל. כי חזק שמרים Gal4 לספירה משמש, מבחני Y1H יכול לזהות אינטראקציות מעורבים activators תעתיק וכן repressors. בנוסף, לאור העובדה TF-הטרף באים לידי ביטוי של מקדם חזק שמרים (ADH1), ניתן להבחין אינטראקציות אפילו בשביל TFs בעלי רמות ביטוי אנדוגני נמוכה, אשר הם מאתגרים לזהות על-ידי שבב11,12.
ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מבחני Y1H מבוססים על ידביקו TF-הטרף זנים DNA-פיתיון שמרים בהפיכת ספריות TF-טרף במאגר עקב בחירה, המושבה איסוף, ורצף כדי לזהות את TF אינטראקציה, או על ידי שינוי צורה של הפרט שיבוטים8,9. אלה הם פרוטוקולי גוזלת זמן, הגבלת מספר רצפי דנ א יכול להיבדק לכל חוקר. שיפור האחרונות של מבחני Y1H, שנקרא משופרת Y1H (eY1H), גדל באופן דרמטי את התפוקה הקרנה באמצעות פלטפורמה רובוטית של המערך (HDA) צפיפות גבוהה להזדווג זני שמרים DNA-הפיתיון עם אוסף של זני שמרים כל ביטוי שונה TF-טרף10,13 (איור 1C). המסכים הבאים מעסיקים של המושבה 1,536 פורמט המאפשר מבחן TFs האנושי ביותר באמצעות לוחות רק שלוש ארבע פעמים. עוד יותר, בהתחשב בעובדה TF-DNA אינטראקציות נבדקים באופן pairwise, גישה זו מאפשרת להשוואת אינטראקציות בין DNA-פיתיונות (כגון שתי גרסאות noncoding נוקלאוטיד יחיד) ובין שר אחר או TF גרסאות11,12 ,14.
באמצעות מבחני eY1H, לנו יש מאפשרת את האדם הגדול ואת Caenorhabditis elegans ממורכז DNA TF-DNA אינטראקציות רשתות עד היום. בפרט, זיהינו 2,230 אינטראקציות בין 246 משפרי התפתחותית האנושי 283 TFs12. יתר על כן, יש לנו עובדים eY1H מבחני לחשוף מחייב TF שינו 109 נוקלאוטיד יחיד noncoding משתנים הקשורים עם מחלות גנטיות כגון מום התפתחותית, סרטן, הפרעות נוירולוגיות. לאחרונה, השתמשנו eY1H על רשת הכוללת 21,714 אינטראקציות בין היזמים ג'ין C. elegans 2,576 366 TFs11. רשת זו הייתה לחשוף את תפקיד פונקציונלי של עשרות TFs C. elegans .
הפרוטוקולים להפיק DNA-פיתיון כתמי ולהעריך את הרמות של פעילות עיתונאית הרקע היה דיווח במקום אחר15,16,17. כאן, אנו מתארים של צינור eY1H יכול לשמש למסך בכל אזור דנ א גנומי האנושי נגד מערך של 1,086 TFs אנושי. ברגע שמרים DNA-פיתיון המתח נוצר מערך TF-טרף ניצפית על גבי הלוחות המתאימים, ניתן לבצע פרוטוקול כולו בעוד שבועיים (טבלה 1). וחשוב מכך, יכול להיות parallelized הפרוטוקול כך חוקר יחיד. באפשרותך לסנן רצפי DNA-פיתיון 60 בו זמנית. כדי להדגים את הפרוטוקול, הוקרנו היזמים של שני גנים ציטוקינים CCL15 ו- IL17F. בנוסף, אנו מראים תוצאות המסכים שנכשלו להמחשת סוגי הבעיות שעלולות להתעורר בעת ביצוע מבחני eY1H וכיצד לפתור אותם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

זיהוי קבוצות גורמי שעתוק (TFs) המסדירים כל הגן האנושי היא משימה מרתיעה הדורש שילוב של גישות ניסוייות וחישוביות רבים. שיטה אחת כזו היא וזמינותו (Y1H) אחד-היברידית שמרים, באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב גנים. מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל., היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן על הפעלת גנים כתב. ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מסכי Y1H מבוססים על להפוך ספריות TF-טרף או מערכים זני שמרים DNA-פיתיון. כאן, אנו מתארים צינור, שנקרא Y1H משופרת (eY1H) מבחני, איפה TF-DNA אינטראקציות הם שנחקרו על-ידי הזדווגות זנים DNA-הפיתיון עם אוסף ערוכים של זנים TF-טרף באמצעות מערך צפיפות גבוהה פלטפורמה רובוטית (HDA) המאפשר הקרנה ב- 1536 תבנית של המושבה. דבר זה מאפשר עלייה דרמטית בערך תפוקה (רצפי DNA-פיתיון 60 נגד > 1,000 TFs לוקח שבועיים לכל חוקר) ו הפארמצבטית. אנו מדגימים סוגים שונים של התוצאות הצפויות על-ידי בדיקת יזם האנושי רצפים נגד מערך של 1,086 TFs האנושית, כמו גם דוגמאות של בעיות שעשויות להתרחש במהלך מסכי וכיצד לפתור אותם.

שלושה גורמים עיקריים יש לשקול בעת ניתוח תוצאות מבחני eY1H: הפעילות העיתונאית רקע של המתח DNA-פיתיון, עוצמת הפעילות העיתונאית המתאים TF-DNA אינטראקציות, ואת מספר מושבות חיובי. הפעילות העיתונאית רקע (קרי: autoactivity) של המתח DNA-פיתיון מתייחס הצמיחה הכללי ואת הצבע של המושבות שמרים בצלוחית readout, אפילו בהי...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של > 1,000 TFs בניסוי יחיד.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

המטרה של בדיקות שמרים חד-היברידיות משופרות היא לזהות את קבוצת גורמי התמלול הנקשרים לרצף DNA של עניין. היתרון של טכניקה זו הוא כי שמרים משופרים אחד היברידית assays יכול להעריך יותר מ 1000 גורמי שעתוק בניסוי אחד. לעומת זאת, אימונופרציפציה כרומטין מעריך רק גורם שעתוק אחד בכל פעם.שיטה זו מהווה כלי מפתח עבור גנומיקה תפקודית כדי לזהות את הרפרטואר של גורמי שעתוק הנקשרים מקדמי גנים משפרי ולזהות גורם שעתוק שונה מחייב וריאנטים שאינם קידוד. הדגמת ההליך תהיה ד"ר שינג ליו פוסט-דוק מהמעבדה שלי. להפשיר את צלחות מלאי גליצרול שמרים עם מערך טרף TF על קרח.השתמשו מחדש בשמרים באמצעות פיפטה של 12 ערוצים והמשיכו לשלב הבא תוך 1 עד 3 דקות. כדי לזהות את השמרים ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, השתמש ברובוט מערך בצפיפות גבוהה כדי לבחור 96 צלחות multiwell כמקור, 96 צלחות אגר כמטרה, ו 96 רפידות סיכה ארוכות. רפידות סיכה אינן ניתנות לשימוש חוזר ויש להשליך אותן.בחר את התוכנית ספוט רבים כדי ליצור שני עותקים לכל 96 גם צלחת. אין להשתמש באפשרויות המיחזור או לבקר שוב כדי למנוע זיהום אחורי של המניות הקפואות. כמו כן, בחר את האפשרות להסתחרר למעלה ולמטה במקור כדי לערבב את השמרים.בצע את ההוראות איפה ומתי למקם את הצלחות ולאפשר לרובוט לזהות את השמרים לתוך Sc מינוס טריפטופן צלחות מלבניות. לארוז את המערך המנוקד ולהדגירה אותו בצד אגר עד 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. כדי ליצור 384 מערכי מושבה ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 96 צלחות אגר כמקור, 384 צלחת אגר כמטרה, ו 96 רפידות סיכה קצרות.לאחר מכן בחר את תוכנית המקור היחיד של המערך 1:4. בדרך זו, ארבעה 96 לוחות מושבה יתאחדו לצלחת מושבה אחת 384. אין להשתמש באפשרויות המיחזור או לבקר שוב כדי למנוע זיהום בין צלחות שונות.לארוז את הצלחות ותדגר את הצד המנוקד של מערך 384 המושבות אגר ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. כדי ליצור 1536 מערכי מושבה ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 384 צלחות אגר כמקור, את צלחות אגר 1536 כיעד, ו 384 רפידות סיכה קצרות. לאחר מכן בחר בתוכנית המקור הבודדת של 1:4.המטרה היא להעתיק כל מושבה לארבע מושבות כדי להשיג פי ארבעה. השתמש באפשרויות המיחזור והבקרה מחדש מכיוון שזה כרוך בהעתקת כל מושבה 4 פעמים. בצע את ההוראות של הרובוט ולאפשר לרובוט לזהות את השמרים לתוך הצלחות לפני אריזה ודגירה של צד מערך המושבה המנוקד 1536 אגר למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.כדי להגביר את מערך המושבה 1536 ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 1536 צלחות אגר כמקור, 1536 צלחות אגר כמטרה, ו 1536 רפידות סיכה קצרות. בחר בתוכנית 'שכפל רבים' כדי לשכפל 3 עד 4 עותקים. השתמש באפשרות מיחזור ובקר שוב אבל לזרוק את הפנקס בעת מעבר לצלחת אחרת של המערך, כדי למנוע זיהום צולב.אפשר לרובוט להגביר את מערך המושבה 1536 ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן. לבסוף, שקית הצלחות הדגירה הבחין 1536 המושבה מערך אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים כדי להשתמש עבור מדרגות הזדווגות. כדי להכין את מדשאות זן פיתיון DNA להזדווגות, לזהות את זני פיתיון שמרי DNA על צלחת Sc מינוס uracil והיסטידין ולגדול במשך 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.רצף את השמרים לתוך 15 ס"מ Sc מינוס uracil וצלחת היסטידין באמצעות קיסם סטרילי, כך שכל צלחת מתאימה 12 עד 16 זנים שונים. דגירה הצלחת יום אחד ב 30 מעלות צלזיוס. למחרת, רצף את השמרים לתוך 15 ס"מ Sc מינוס uracil וצלחת היסטידין באמצעות קיסם סטרילי, כך שכל צלחת מתאימה 4 זנים שונים.דגירה את הצלחת ליום אחד ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מגרדים את השמרים באמצעות קיסם סטרילי, ומוודאים לא לגרד אגר. מוסיפים את השמרים לצינור 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של מים סטריליים.עכשיו להוסיף 10 עד 15 קדילי זכוכית ותליית שמרים על צלחת מלבנית YAPD. לנער ביסודיות לכל הכיוונים במשך דקה אחת כדי להבטיח את השמרים מתפשטים לאורך הצלחת. הפוך את הצלחת מיד, והקש כך חרוזים ללכת למכסה.מוציאים וממחזרים את חרוזים. שקית הצלחות דגירה אותם בצד אגר למטה במשך 1 עד 2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המשיכו לשלב ההזדווגות.כדי להזדווג עם פיתיון הדנ"א של השמרים וזנים במערך TF, העבר את מערך ה- TF לצלחת מלבנית YAPD עם הרובוט. בחר את צלחת אגר 1536 כמקור ואת היעד, ואת כרית סיכה קצרה 1536. בחר בתוכנית 'שכפל רבים'.בחרו 4 לוחות מקור ואת אפשרויות המיחזור והבחינה מחדש. ניתן להשתמש בכל לוחית מערך TF להעברת 3 עד 4 לוחות YAPD. לוחות מערך TF המשמשים להזדווגות חייבים להיות בני יומיים עד שלושה ימים, אך לא יותר מכיוון שהזדווגות עשויה להיות לא יעילה.כדי להעביר את הדשא של זן פיתיון DNA לצלחות YAPD שכבר מכילות את מערך ה- TF, בחר את צלחת הגר 1536 כמקור ואת המטרה ואת כרית הסיכה הקצרה 1536. בחר בתוכנית 'שכפל רבים'. השתמש בהיסט אקראי במקור עם רדיוס של כ 0.6 מילימטרים כדי למנוע נטילת שמרים מאותה נקודה ובחר לערבב על היעד כדי להקל על מגע בין זני שמרים.השתמש במדשאה המכילה את זני פיתיון ה- DNA כמקור, ואת לוחות YAPD המכילים את מערך TF המנוקד כמטרה לפני אריזת הצלחות ודגירה אותם בצד אגר עד ב 30 מעלות צלזיוס ליום אחד. לבחירת שמרים דיפלואידים, בחרו את צלחת הגר 1536 כמקור ואת המטרה, ובחרו את כרית הסיכה הקצרה 1536. בחר את התוכנית שכפול.בחר ערבב במקור ובמטרה. אפשר לרובוט להעביר את השמרים המוארים מצלחות YAPD ל- Sc מינוס uracil וצלחות טריפטופן לפני אריזת הצלחות ודגירה בצד אגר למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. עכשיו, בחר את צלחות אגר 1536 כמקור ואת היעד ואת כרית סיכה קצרה 1536.בחר את התוכנית שכפול. מעבירים את שמרי הדיפלואידים מ-Sc מינוס uracil וצלחות טריפטופן ל-3-AT ו-X-gal המלבניים המכילים צלחות באמצעות הרובוט. לארוז את הצלחות דגירה אותם בצד אגר עד 30 מעלות צלזיוס עד 7 ימים.עבור זני פיתיון DNA עם פעילות כתב רקע גבוה, לצלם בימים 2, 3, ו 4. אחרת, צלם בימים 4 ו-7. שמור את לוחות מערך TF בטמפרטורת החדר והעתק שוב לאחר 7 ימים לסיבוב הקרנה חדש.כדי להמחיש את סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות מראות שמרים חד-היברידיים משופרים, אזורי האמרגן של הגנים CCL15 ו- IL17F הוסנו מול מערך של 1086 TFs אנושיים. מקדם CCL15 הוא דוגמה לפיתיון דנ"א לא אוטומטי, שבו ניתן לזהות בקלות אינטראקציות, אפילו חלשות. מקדם IL17F הוא דוגמה לפיתיון דנ"א אוטואקטיבי עם פעילות כתב רקע לא אחידה שבה ניתן לזהות אינטראקציות מסוימות, בעוד עבור מספר TFs, לא ברור אם פעילות הכתב גבוהה מהרקע.ישנן מספר בעיות שעלולות להתרחש בעת ביצוע בדיקות משופרות שמרים היברידית אחת. במקרה זה, המושבות קטנות מדי ולא הצליחו לעבור. בדרך כלל, כ-95% מהמושבות לטרף TF מציגות צמיחה תקינה.בדוגמה זו, אין צמיחה שמרים בחלק של הצלחת. בעיה זו קשורה בדרך כלל לכישלון בשלב ההזדווגות אם כרית סיכה 1536 אינו מצליח ליצור קשר עם השמרים במדשאת זן פיתיון DNA, במערך TF, או בצלחת ההזדווגות. בשתי דוגמאות אלה, לא מזוהות אינטראקציות.בעיה זו קשורה לעתים קרובות או מוטציות לא מכוונות בגנים הכתב, בפרט LacZ, או autoactivity גבוה מדי כי להסוות אינטראקציות. במקרה זה, הצלחת מציגה כתמים כחולים אקראיים אשר קשורה לעתים קרובות לזיהום חיידקי. הדבר החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון הוא הכנת צלחת נכונה.ודא כי כל הרכיבים מתווספים כי גובה אגר הוא אחיד כמו כל השלבים הבאים תלויים בכך. למרות שרוב reagents אינם מסוכנים, חשוב ללבוש כפפות בכל עת, כדי למנוע זיהום של דגימות וצלחות. כמו בכל בדיקת איגוד DNA, חשוב לאמת את האינטראקציות שזוהו באמצעות בדיקות תפקודיות כגון בדיקות עיתונאיות, הפלת גורם שעתוק או נוקאאוט, ואחריו מדידת ביטוי של גן היעד.שיטה זו אפשרה זיהוי של גורמי שעתוק המווסתים גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים מסוימים, כמו גם גורמי שעתוק עם קשירה חלופית לגרסאות הקשורות למחלות שאינן קידוד.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...