Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [R35-GM128625 a J.I.F.B.].

1. preparati
<ol><li>
Piastre di SC −U −H (150mm di Petri) Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la coltivazione i ceppi di lievito DNA-esca.<ol>
<li>Sciogliere il drop-out mix, lievito azoto base (YNB), adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 920 mL di acqua e pH 5.9 con 5 M NaOH (circa 1 mL per litro di media; si veda tabella 2 per la composizione). Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.</li>
		<li>In un secondo pallon...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

L'approccio di screening degli amori robotici eY1H descritto qui notevolmente aumenta il throughput per identificare l'insieme di TFs che si legano ad una regione di DNA di interesse, rispetto al precedente screening libreria o screening allinearono approcci basati sulla trasformazione. Inoltre, le interazioni di TF-DNA rilevate da eY1H le analisi sono altamente riproducibili come il 90% delle interazioni rilevate sono testati positivi per tutte le quattro colonie in TF e 90% delle interazioni verificare nuovamente in un...

Un problema centrale in campo biomedico consiste nel determinare i meccanismi con cui viene regolato ogni gene umano. Trascrizione è il primo passo nel controllo dei livelli di espressione genica, ed è regolato da un insieme di fattori di trascrizione (TFs) che sono unici per ogni gene. Dato che gli esseri umani codificano per > 1.500 TFs1,2, identificando il set completo di TFs che controllano l'espressione di ogni gene rimane una sfida aperta.
Due tipi di metodi possono essere utilizzati per mappare le interazioni TF-DNA: Metodi TF-centrato e DNA-centrato3 (Figura 1A). Nei metodi TF-centrato, è sondato un TF di interesse per l'associazione a regioni del DNA genomiche o per determinare la specificità di legame del DNA. Questi metodi includono l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da sequenziamento ad alta produttività, microarrays della proteina vincolante e SELEX4,5,6. Nei metodi del DNA-centrato, una sequenza di DNA di interesse è sondata per determinare l'insieme di TFs che si legano alla sequenza di DNA. Il più ampiamente applicata di tali metodi è saggi di lievito monoibrido (Y1H), nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando reporter geni7,8,9.
Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per reporter gene attivazione9,10 (Figura 1B). Il DNA-esca è clonato a Monte di due reporter geni (LacZ e HIS3) e due costrutti di DNA-bait::reporter sono integrati nel genoma del lievito per generare cromatinici 'DNA-esca ceppi.' La TF-preda, codificata in un plasmide che esprime un TF fuso per il dominio di attivazione (AD) del lievito Gal4 TF, è stato introdotto nel ceppo di DNA-esca per i pesci per le interazioni di TF-DNA. Se la TF-preda si lega alla sequenza di DNA-esca, quindi l'annuncio presente nella TF-preda porterà all'attivazione di entrambi i geni reporter. Di conseguenza, cellule con un'interazione positiva possono essere selezionate per la crescita sulle piastre carente istidina, come pure di superare un inibitore competitivo, 3-ammino-1,2,4-triazolo (3-AT) e visualizzate come colonie blu in presenza di X-gal. Perché il potente lievito Gal4 è utilizzato AD, saggi di Y1H in grado di rilevare le interazioni che coinvolgono attivatori trascrizionali come repressori. Inoltre, dato che TF-prede sono espressi da un promotore forte lievito (ADH1), interazioni possono essere rilevati anche per TFs che hanno livelli di bassa espressione endogena, che sono difficili da rilevare da ChIP11,12.
Più i protocolli pubblicati per eseguire dosaggi Y1H si basano sull'introduzione di TF-prede nei ceppi di lievito DNA-esca trasformando in pool librerie di TF-preda seguite da selezione, Colonia raccogliendo e sequenziamento per identificare il TF interagenti, o da trasformazione di singoli cloni8,9. Si tratta di protocolli che richiede tempo, limitando il numero di sequenze di DNA che può essere testato per ricercatore. Un recente miglioramento delle analisi Y1H, chiamato enhanced Y1H (eY1H), ha aumentato drammaticamente il throughput screening utilizzando una piattaforma robotica di matrice (HDA) ad alta densità di accoppiarsi ceppi di lievito DNA-esca con una collezione di ceppi di lievito ognuno esprimendo un diverso TF-preda10,13 (Figura 1). Questi schermi utilizzano un formato di 1.536 Colonia che permette di testare più umano TFs in quadruplice copia utilizzando solo tre piastre. Inoltre, dato che interazioni TF-DNA sono testati in maniera pairwise, questo approccio consente per confrontare le interazioni tra DNA-esche (ad esempio, due varianti non codificanti singolo nucleotide) e tra diversi TFs o TF varianti11,12 ,14.
Facendo uso delle analisi di eY1H, abbiamo delineato l'umano più grande e Caenorhabditis elegans TF-DNA DNA-centrato interazioni reti a-data. In particolare, abbiamo identificato 2.230 interazioni tra 246 rinforzatori inerente allo sviluppo umani e 283 TFs12. Ulteriormente, abbiamo impiegato le analisi eY1H per scoprire associazione TF alterata a 109 varianti non codificante di singolo nucleotide associate a malattie genetiche come la malformazione inerente allo sviluppo, il cancro e disturbi neurologici. Più recentemente, abbiamo usato eY1H per delineare una rete formata da 21.714 interazioni tra 2.576 promotori di geni di c. elegans e 366 TFs11. Questa rete è stato determinante per scoprire il ruolo funzionale di decine di c. elegans TFs.
I protocolli per generare macchie di DNA-esca e valutare i livelli di attività del reporter di sfondo sono state segnalate altrove15,16,17. Qui, descriviamo una pipeline di eY1H che può essere utilizzata per qualsiasi regione di DNA genomico umano contro una matrice di 1.086 TFs umano a schermo. Una volta che viene generato un DNA-esca ceppo di lievito e una matrice di TF-preda è macchiata sulle piastre corrispondente, l'intero protocollo può essere eseguita in due settimane (tabella 1). Ancora più importante, il protocollo può essere parallelizzato in modo che un singolo ricercatore può schermo 60 sequenze di DNA-esca simultaneamente. Per illustrare il protocollo, abbiamo proiettato i promotori di due geni di citochine CCL15 e IL17F. Inoltre, mostreremo risultati dalla fallita schermate per illustrare i tipi di problemi che possono sorgere durante l'esecuzione di analisi di eY1H e come risolverli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

Identificare i set di fattori di trascrizione (TFs) che regolano ogni gene umano è un compito arduo che richiede l'integrazione di numerosi approcci sperimentali e computazionali. Uno di questi metodi è il lievito monoibrido (Y1H) test, nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando geni reporter. Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es.., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per l'attivazione del gene reporter. Più i protocolli pubblicati per l'esecuzione di Y1H schermi si basano sulla trasformazione TF-preda librerie o matrici in ceppi di lievito DNA-esca. Qui, descriviamo una pipeline, chiamato Y1H avanzata (eY1H) assays, dove interazioni TF-DNA sono interrogati dall'accoppiamento del DNA-esca ceppi con una collezione di serie di TF-preda ceppi utilizzando una matrice ad alta densità piattaforma robotica (HDA) che permette la proiezione in un 1.536 formato di Colonia. Questo permette un notevole aumento della velocità effettiva (60 sequenze di DNA-esca contro > 1.000 TFs richiede due settimane per ricercatore) e riproducibilità. Illustriamo i diversi tipi di risultati attesi dalla prova sequenze promotore umano contro una matrice di 1.086 umano TFs, nonché esempi di problemi che possono sorgere durante gli schermi e come risolverli.

Tre fattori principali da considerare quando analizzando i risultati dalle analisi eY1H: l'attività del reporter sfondo del ceppo del DNA-esca, la forza dell'attività di giornalista corrispondente a interazioni TF-DNA e il numero di colonie positive. L'attività del reporter sfondo (cioè, autoactivity) del ceppo del DNA-esca si riferisce al colore delle colonie di lievito nella piastra di lettura, anche in assenza di un TF-preda e alla crescita complessiva. Idealmente, non autoactive ceppi mostrano un sfondo bianco o ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Qui, presentiamo un lievito avanzato monoibrido protocollo per identificare i fattori di trascrizione (TFs) che possono essere associato ad una regione di DNA umana di interesse di screening. Questo metodo utilizza una pipeline di screening ad alta resa che può interrogare il legame di > 1.000 TFs in un singolo esperimento.

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

L'obiettivo dei test uni ibridi del lievito potenziato è identificare l'insieme dei fattori di trascrizione che si legano a una sequenza di interesse del DNA. Il vantaggio di questa tecnica è che i test uni ibridi di lievito potenziati possono valutare più di 1000 fattori di trascrizione in un singolo esperimento. Al contrario, l'immunoprecipitazione della cromatina valuta un solo fattore di trascrizione alla volta.Questo metodo costituisce uno strumento chiave per la genomica funzionale per identificare il repertorio dei fattori di trascrizione che si legano ai promotori e agli esaltatori genico e per identificare il legame alterato del fattore di trascrizione con varianti non codificanti. A dimostrare la procedura sarà il Dottor Xing Liu un postdoc del mio laboratorio. Scongelare le piastre stock di glicerolo di lievito con l'array di prede TF sul ghiaccio.Resuspendare il lievito utilizzando una pipetta a 12 canali e procedere al passaggio successivo entro 1 o 3 minuti. Per individuare il lievito in piastre rettangolari Sc meno triptofano, utilizzare un robot array ad alta densità per selezionare più piastre 96 come sorgente, 96 piastre di agar come bersaglio e 96 cuscinetti lunghi perno. I pin pad non sono riutilizzabili e devono essere scartati.Selezionare il programma Spot Many per fare due copie per piastra di pozzo 96. Non utilizzare le opzioni di riciclo o rivisitazione per evitare la retrointaminazione delle scorte congelate. Inoltre, selezionare l'opzione per ruotare su e giù nella sorgente per mescolare il lievito.Seguire le istruzioni su dove e quando posizionare le piastre e consentire al robot di individuare il lievito in piastre rettangolari Sc meno triptofano. Insacca l'array maculato e incubalo lato agar a 30 gradi Celsius per 2-3 giorni. Per generare 384 array di colonie in placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 96 piastre di agar come fonte, 384 piastre di agar come bersaglio e 96 cuscinetti a spillo corti.Quindi selezionare il programma single source array 1:4. In questo modo, quattro 96 tavole di colonia saranno consolidate in una piastra di colonia 384. Non utilizzare le opzioni di riciclo o rivisitazione per evitare la contaminazione tra diverse piastre.Insacca le piastre e incuba il lato agar maculato a 384 colonie a 30 gradi Celsius per 2 giorni. Per generare 1536 array di colonie in placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 384 piastre di agar come fonte, le piastre di agar 1536 come bersaglio e 384 cuscinetti a spillo corti. Quindi selezionare il programma di origine singola del saggio 1:4.L'obiettivo è quello di copiare ogni colonia in quattro colonie per ottenere quadruplicati. Usa le opzioni di riciclo e rivisitazione in quanto ciò comporta la copia di ogni colonia 4 volte. Segui le istruzioni del robot e consenti al robot di individuare il lievito nelle piastre prima di insaccarlo e incubare il lato agar maculato di 1536 colonie a 30 gradi Celsius per 3 giorni.Per amplificare l'array di colonie del 1536 in Placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 1536 piastre di agar come fonte, 1536 piastre di agar come bersaglio e 1536 cuscinetti a spillo corti. Selezionare il programma Replica molti per replicare da 3 a 4 copie. Utilizzare l'opzione di riciclo e rivisitazione, ma gettare il pad quando si passa a una piastra diversa dell'array per evitare la contaminazione incrociata.Permettete al robot di amplificare l'array di colonie 1536 in Sc meno piastre rettangolari di triptofano. Infine, insacca le piastre e incuba il lato agar maculato di 1536 colonie a 30 gradi Celsius per 3 giorni da utilizzare per i passaggi di accoppiamento. Per preparare i prati del ceppo di esche di DNA per l'accoppiamento, individuare i ceppi di esche di lievito di DNA su un piatto sc meno uracile e istidina e crescere per 3 giorni a 30 gradi Celsius.Striare il lievito in una piastra di 15 centimetri Sc meno uracile e istidina utilizzando uno stuzzicadenti sterile in modo che ogni piastra si adatti a 12-16 ceppi diversi. Incubare il piatto un giorno a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, striare il lievito in una piastra di 15 centimetri Sc meno uracile e istidina utilizzando uno stuzzicadenti sterile in modo che ogni piastra si adatti a 4 ceppi diversi.Incubare il piatto per un giorno a 30 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raschiare il lievito usando uno stuzzicadenti sterile, assicurandosi di non raschiare alcun agar. Aggiungere il lievito in un tubo da 1,5 millilitri con 500 microlitri di acqua sterile.Ora aggiungi da 10 a 15 perline di vetro sterili e la sospensione del lievito su una piastra rettangolare YAPD. Agitare accuratamente in tutte le direzioni per un minuto per assicurarsi che il lievito si diffonda in tutto il piatto. Invertire immediatamente la piastra e toccare in modo che le perline vadano al coperchio.Rimuovere e riciclare le perline. Insacca i piatti e incubali lato agar verso il basso per 1-2 giorni a 30 gradi Celsius. Quindi, procedere al passaggio di accoppiamento.Per accoppiare l'esca di DNA del lievito e i ceppi di array TF, trasferire l'array TF su una piastra rettangolare YAPD con il robot. Selezionare la piastra di agar 1536 come sorgente e il bersaglio e il pin pad corto 1536. Selezionare il programma Replica molti.Seleziona 4 piastre sorgente e le opzioni di riciclo e rivisitazione. Ogni piastra array TF può essere utilizzata per trasferire da 3 a 4 piastre YAPD. Le piastre array TF utilizzate per l'accoppiamento devono avere dai 2 ai 3 giorni, ma non più perché l'accoppiamento può essere inefficiente.Per trasferire il prato di un ceppo di esche di DNA alle piastre YAPD che già contengono l'array TF, selezionare la piastra di agar 1536 come fonte e il bersaglio e il cuscinetto a spillo corto 1536. Selezionare il programma Replica molti. Utilizzare un offset casuale nella sorgente con un raggio di circa 0,6 millimetri per evitare di prendere lievito dallo stesso punto e selezionare Mix on Target per facilitare il contatto tra ceppi di lievito.Usa il prato contenente i ceppi di esche di DNA come fonte e le piastre YAPD contenenti l'array TF maculato come bersaglio prima di insaccare le piastre e incubarle lato agar a 30 gradi Celsius per un giorno. Per la selezione del lievito diploide, selezionare la piastra di agar 1536 come fonte e il bersaglio e selezionare il pad a spillo corto 1536. Selezionare il programma Replica.Selezionare Mix on Source e su Target. Lasciare che il robot trasferisca il lievito accoppiato dalle piastre YAPD alle piastre Sc meno uracile e triptofano prima di insaccarle e incubarle lato agar a 30 gradi Celsius per 2-3 giorni. Ora, seleziona le piastre di agar 1536 come fonte e il bersaglio e il pad a spillo corto 1536.Selezionare il programma Replica. Trasferire il lievito diploide dalle piastre Sc meno uracile e triptofano alle piastre rettangolari rettangolari 3-AT e X-gal contenenti il robot. Insacca i piatti e incubali lato agar a 30 gradi Celsius per un massimo di 7 giorni.Per i ceppi di esche di DNA con attività di reporter di alto background, scatta foto nei giorni 2, 3 e 4. Altrimenti, scatta foto ai giorni 4 e 7. Mantenere le piastre array TF a temperatura ambiente e copiare di nuovo dopo 7 giorni per un nuovo ciclo di screening.Per illustrare il tipo di risultati che possono essere ottenuti utilizzando test uni ibridi di lievito potenziati, le regioni promotrici dei geni CCL15 e IL17F sono state schermate su una serie di 1086 TF umani. Il promotore CCL15 è un esempio di esca di DNA non autoattiva, dove le interazioni, anche deboli, possono essere facilmente rilevate. Il promotore IL17F è un esempio di esca di DNA autoattiva con attività irregolare del reporter di sfondo in cui è possibile rilevare alcune interazioni, mentre per diversi TF, non è chiaro se l'attività del reporter sia superiore allo sfondo.Ci sono diversi problemi che possono verificarsi quando si eseguono test uni ibridi di lievito migliorati. In questo caso, le colonie sono troppo piccole e non sono riuscite a trasferirsi. In genere, circa il 95% delle colonie di prede TF mostra una crescita normale.In questo esempio, non c'è crescita di lievito in una porzione del piatto. Questo problema è generalmente correlato a un guasto nella fase di accoppiamento se il cuscinetto a spillo 1536 non riesce a entrare in contatto con il lievito nel prato del ceppo di esche di DNA, nell'array TF o nella piastra di accoppiamento. In questi due esempi, non vengono rilevate interazioni.Questo problema è spesso correlato a mutazioni inattivanti involontarie nei geni reporter, in particolare la LacZ, o a un'autoattività troppo elevata che maschera le interazioni. In questo caso, la piastra presenta macchie blu casuali che sono spesso correlate alla contaminazione batterica. La cosa più importante da considerare è una corretta preparazione della piastra.Assicurarsi che tutti i componenti siano aggiunti e che l'altezza dell'agar sia uniforme poiché tutti i passaggi successivi dipendono da questo. Sebbene la maggior parte dei reagenti non sia pericolosa, è importante indossare i guanti in ogni momento per evitare la contaminazione dei campioni e delle piastre. Come per qualsiasi saggio di legame del DNA, è importante convalidare le interazioni identificate utilizzando saggi funzionali come test dei reporter, knockdown del fattore di trascrizione o knockout, seguiti dalla misurazione dell'espressione del gene bersaglio.Questo metodo ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione che regolano i geni coinvolti in particolari processi biologici e fattori di trascrizione con legame alternativo a varianti associate a malattie non codificanti.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Ricerca

Genetica

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Esplorare lo spazio di sequenza per identificare i siti di legame per le proteine di legame dell'RNA regolamentare

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...