Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
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この作品は、健康の国民の協会 [J.I.F.B. に R35-GM128625] によって支えられました。

1. 準備
<ol><li>
Sc −U アリルメ プレート (150 mm ペトリ皿) 注:これらのプレートは、DNA 餌酵母菌の成長のために使用されます。<ol>
<li>ドロップ アウト ミックス、イースト窒素ベース (YNB)、アデニン hemisulfate 920 mL の水、5.9 (メディアのリットル当たり 1 mL; 構成の表 2を参照してください約) 5 M NaOH で pH のアンモニウムの硫酸塩を溶解します。2 L フラス?...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

ここで大きく説明ロボット eY1H 交尾スクリーニング アプローチは、以前のライブラリ スクリーニングと比較して興味や変換に基づく配列スクリーニング アプローチの DNA 領域にバインド TFs のセットを識別するためにスループットを向上します。アッセイは、TF ごとにテストしたすべての 4 つの植民地のために積極的、相互作用の 90% は同じ酵母 DNA 餌ひずみ10の独立した画...

バイオメディカル分野で中心的な問題は、各人間の遺伝子を調整するメカニズムを決定します。転写は遺伝子発現を制御する最初のステップと対象の各遺伝子は、転写因子 (TFs) の規制を受けます。人間はエンコードのことを考える > 1,500 TFs1、2、各遺伝子の発現を制御する TFs の完全なセットを識別する開かれた挑戦に残る。
TF DNA の相互作用をマップする 2 種類の方法を使用できます: TF 中心と DNA の方法3 (図 1 a)。TF を中心とした方法でまたは DNA 結合特異性を決定するゲノム DNA 領域にバインドするための関心の TF がプローブされます。これらのメソッドには、クロマチン免疫沈降 (チップ) 続いて高スループット シーケンス、タンパク質結合マイクロ アレイと SELEX4,5,6が含まれます。DNA を中心とした方法では、DNA 配列に結合する TFs のセットを決定する興味の DNA シーケンスがプローブされます。このようなメソッドの中で最も広く応用イースト 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の地域、レポーター遺伝子7,8,9を使用して酵母核の環境でテスト済みです。
Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子活性化9,10 (図 1 b) を上映することができます。DNA の餌は上流のクローン作成 2 つのレポーターの遺伝子 (LacZおよびHIS3) および両方の DNA bait::reporter 構造、chromatinized 'DNA 餌系統 ' を生成する酵母ゲノムに統合されて。TF DNA の相互作用のために採取する DNA 餌ひずみに TF 獲物、Gal4 TF、酵母の活性化ドメイン (AD) 融合した TF を表現するプラスミッドで符号化を導入します。TF 獲物は餌 DNA シーケンスにバインドされた場合 TF 獲物で存在の広告は、この両方のレポーターの遺伝子の活性化に します。その結果、肯定的な相互作用を持つ細胞をプレート 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3 AT)、競争の阻害剤を克服し同様、ヒスチジンに欠けている成長のための選択および X gal の存在下で青いコロニーとして視覚化できます。強力な酵母 Gal4 AD を使用すると、Y1H のアッセイは、リプレッサーと同様に、転写活性化因子の相互作用を検出できます。さらに、TF-犠牲が強い酵母プロモーター (ADH1) から出されることを考えるは、TFs 低内因性発現レベルが、チップ11,12の検出に挑戦しているのも相互作用を検出できます。
Y1H アッセイを行うため最も公開プロトコル選択、ピッキング、コロニーおよび相互作用の TF を識別するために配列することによって続いてプールの TF 獲物ライブラリを変換することによって酵母 DNA 餌に TF-犠牲を導入することに基づいています。個々 の変換8,9のクローンを作成します。これらは、時間のかかるプロトコル、研究員あたりテストすることができます DNA シーケンスの数を制限することです。呼ばれる、Y1H のアッセイの最近の改善強化 Y1H (eY1H) が DNA 餌酵母酵母のコレクションにそれぞれ異なる表現をチームメイトに高密度配列 (HDA の) ロボット プラットフォームを用いたスクリーニングのスループットを大幅に増加TF 獲物10,13 (図 1)。これらの画面は、唯一の 3 つのプレートを使用して 4 連で最も人間 TFs をテストするを許可する 1,536 コロニー形式を採用しています。さらに、TF DNA の相互作用は一対にテスト、ことを考えるこのアプローチ (2 つの非翻訳一塩変形) など DNA 餌とは別の TFs の間の相互作用を比較することができますまたは TF バリエーション11,12。 ,14。
EY1H の試金を使用して、最大の人間と DNA を中心とした TF DNA 相互作用ネットワークに日の線虫を線引きが。特に、246 人間発生エンハンサーと 283 の TFs122,230 相互作用を同定しました。さらに、109 単一のヌクレオチド非コード バリエーション発達奇形、がん、神経疾患などの遺伝病に関連付けられている変更した TF バインディングを明らかにする eY1H のアッセイを採用しました。もっと最近、2,576 c. の elegans遺伝子プロモーターと 366 の TFs1121,714 相互作用で構成されるネットワークを記述する eY1H を使用しました。このネットワークはc. の elegans TFs の数十の機能的役割を明らかにするため尽力しました。
DNA の餌の汚れを生成、バック グラウンド レポーターの活動のレベルを評価するプロトコルがされている15,16,17は別途報告します。ここでは、1,086 人間 TFs の配列に対して任意の人間ゲノム DNA の領域を画面に使用することができます eY1H パイプラインについて述べる。一度酵母 DNA 餌ひずみが生成され、対応するプレートの上に TF 獲物配列を発見、プロトコル全体は 2 週間 (表 1) で実行できます。もっと重要なは、単一の研究者は同時に 60 餌 DNA シーケンスを選別できるようにプロトコルを並列化できます。プロトコルを示すためには、我々 は CCL15 と IL17F の 2 つのサイトカイン遺伝子のプロモーターを上映しました。さらに、eY1H 試金およびそれらの解決方法を実行する場合に発生する可能性のある問題の種類を説明するために失敗した画面からの結果を示す.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

各人間の遺伝子を調節する転写因子 (TFs) のセットを識別するは、多数の実験と計算のアプローチの統合を必要とする困難な作業です。このような 1 つの方法は、酵母 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の領域、レポーター遺伝子を用いた酵母核の環境でテストします。Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば.、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子の活性化のため上映することができます。Y1H 画面を実行する最も公開されたプロトコルは DNA 餌酵母に TF 獲物ライブラリまたは配列の変換に基づいています。ここでは、パイプラインについて述べる、強化された Y1H と呼ばれる (eY1H) 試金、TF 獲物系統高密度配列を使用して配列コレクションを持つ DNA 餌株を交配による TF DNA の相互作用を尋問するところ、1,536 のスクリーニングができる (HDA) ロボットプラット フォームコロニーの形式です。これにより、スループットが劇的に増加 (60 DNA 餌系列 > 1,000 TFs 研究員あたり 2 週間はかかる) と再現性。画面とそれらの解決方法の中に発生する問題の例と同様、1,086 人間 TFs の配列に対してヒトプロモーター配列をテストすることによって期待される結果の種類を示しています。

EY1H 試金から結果の分析と 3 つの主な要因を考慮すべき: DNA 餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動、TF DNA の相互作用、および肯定的なコロニーの数に対応するレポーターの活動の強さ。DNA の餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動 (すなわち、autoactivity) は、全体的な成長と TF 獲物がない場合でも、読み出しプレートの酵母コロニーの色を指します。理想的には、非 autoacti...

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Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して > 単一の実験で 1,000 TFs。

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

強化された酵母ワンハイブリッドアッセイの目的は、目的のDNA配列に結合する転写因子のセットを特定することです。この技術の利点は、強化された酵母ワンハイブリッドアッセイが1回の実験で1000以上の転写因子を評価できることである。逆に、クロマチン免疫沈降は一度に1つの転写因子のみを評価する。この方法は、遺伝子プロモーターおよびエンハンサーに結合する転写因子のレパートリーを同定し、非コード変異体に結合する転写因子を同定するための機能的ゲノミクスのための重要なツールを構成する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクです。氷の上にTF獲物配列で酵母グリセロールストックプレートを解凍します。12チャネルピペットを使用して酵母を再懸濁し、1〜3分以内に次のステップに進みます。酵母をScマイナストリプトファン長方形プレートにスポットするには、高密度アレイロボットを使用してマルチウェル96プレートをソースとして、96枚の寒天プレートをターゲットに、96個のロングピンパッドを選択します。ピンパッドは再利用可能ではなく、廃棄する必要があります。96ウェルプレートごとに2つのコピーを作成するには、スポット多プログラムを選択します。冷凍在庫の逆汚染を避けるために、リサイクルまたは再訪オプションを使用しないでください。また、酵母を混合するためにソースで上下に旋回するオプションを選択します。プレートを配置する場所とタイミングの指示に従い、ロボットが酵母をScマイナストリプトファンの長方形プレートに見つけることができます。斑点のあるアレイを袋に入れ、摂氏30度で寒天側を2〜3日間インキュベートします。Scからトリプトファンの長方形プレートを引いた384コロニーアレイを生成するには、ソースとして96寒天プレート、ターゲットとして384寒天プレート、および96の短いピンパッドを選択します。次に、1:4 配列の単一ソース・プログラムを選択します。このようにして、4つの96コロニープレートが1つの384コロニープレートに統合されます。異なるプレート間の汚染を避けるために、リサイクルまたは再訪オプションを使用しないでください。プレートを袋に入れ、斑点のある384コロニーアレイ寒天側を摂氏30度で2日間インキュベートします。Scからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを生成するには、ソースとして384寒天プレート、ターゲットとして1536寒天プレート、および384の短いピンパッドを選択します。次に、1:4アッセイ単一ソースプログラムを選択します。目標は、4倍を得るために4つのコロニーに各コロニーをコピーすることです。リサイクルと再訪のオプションは、コロニーごとに4回コピーする必要があります。ロボットの指示に従い、ロボットがプレートに酵母を見つけてから、発見された1536コロニーアレイ寒天側を30°Cで30°Cで30°Cでインキュベートします。Scからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを増幅するには、ソースとして1536寒天プレート、ターゲットとして1536寒天プレート、および1536短いピンパッドを選択します。3 ~ 4 個のコピーをレプリケートするには、[多を複製] プログラムを選択します。リサイクルと再訪のオプションを使用しますが、クロスコンタミネーションを避けるためにアレイの別のプレートに切り替えるときにパッドを投げ出します。ロボットがScからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを増幅することを可能にする。最後に、プレートを袋に入れ、斑点のある1536コロニーアレイ寒天側を摂氏30度で30日間インキュベートし、交配ステップに使用します。交配のためのDNAベイト株芝生を準備するには、ScマイナスウラシルとヒスチジンプレートにDNA酵母餌株を見つけ、摂氏30度で3日間成長させます。各プレートが12〜16種類の異なる株に収まるように、滅菌爪楊枝を使用して15センチメートルScマイナスウラシルとヒスチジンプレートに酵母をストリーク。1日30度でプレートをインキュベートします。翌日、各プレートが4つの異なる株に収まるように、滅菌爪楊枝を使用して15センチメートルScマイナスウラシルとヒスチジンプレートに酵母をストリーク。30°Cで1日プレートをインキュベートします。インキュベーションに続いて、無菌爪楊枝を使用して酵母を削り取り、寒天を削らないようにします。500マイクロリットルの無菌水で1.5ミリリットルのチューブに酵母を加えます。YAPDの長方形の板に10から15の無菌ガラスビーズおよび酵母懸濁液を加える。酵母がプレート全体に広がるように、すべての方向に1分間徹底的に振ります。すぐにプレートを反転し、ビーズが蓋に行くようにタップします。ビーズを取り外してリサイクルします。プレートを袋に入れ、寒天側を摂氏30度で1〜2日間インキュベートします。次に、交配ステップに進みます。酵母DNAベイトとTFアレイ株を交尾するには、TFアレイをロボットと一緒にYAPD長方形プレートに移します。ソースとターゲットとして1536寒天プレート、および1536短いピンパッドを選択します。[多回複製] プログラムを選択します。4つのソースプレートとリサイクルと再訪のオプションを選択します。各TFアレイプレートは、3〜4 YAPDプレートを転送するために使用することができます。交配に使用されるTFアレイプレートは2〜3日前でなければなりませんが、交配が非効率的である可能性があるため、それ以上はできません。DNA餌株の芝生を既にTFアレイを含むYAPDプレートに移す場合は、ソースとして1536寒天プレートを選択し、ターゲットと1536短いピンパッドを選択します。[多回複製] プログラムを選択します。同じ場所から酵母を取らないように半径約0.6ミリメートルのソースでランダムなオフセットを使用し、酵母株間の接触を容易にするためにターゲット上のミックスを選択します。DNA餌株を含む芝生をソースとして使用し、プレートを袋詰めして寒天側を摂氏30度で1日インキュベートする前に、斑点のあるTFアレイを含むYAPDプレートをターゲットとして使用します。二倍酵母の選択のために、ソースとターゲットとして1536寒天プレートを選択し、1536短いピンパッドを選択します。[レプリケート]プログラムを選択します。[ソースとターゲットでミックス]を選択します。ロボットがYAPDプレートからScマイナスウラシルとトリプトファンプレートに交尾酵母を移してから、プレートを袋詰めし、寒天側を摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。次に、ソースとして1536寒天プレートとターゲットと1536短いピンパッドを選択します。[レプリケート]プログラムを選択します。ロボットを使用して、Scからウラシルとトリプトファンプレートから読み出し長方形の3-ATおよびX-gal含有プレートにディプロイド酵母を移します。プレートを袋に入れ、寒天側を摂氏30度で最大7日間インキュベートします。バックグラウンドレポーター活性の高いDNA餌株については、2日目、3日目、4日目に写真を撮ります。それ以外の場合は、4 日目と 7 日目に写真を撮ります。TFアレイプレートを室温に保ち、7日後に再びコピーして新しいスクリーニングを行います。強化された酵母ワンハイブリッドアッセイを用いて得ることができる結果の種類を例示するために、CCL15およびIL17F遺伝子のプロモーター領域を、1086個のヒトTFの配列に対してスクリーニングした。CCL15プロモーターは、非自己活性DNA餌の一例であり、そこでは、弱いものであっても、相互作用を容易に検出することができる。IL17Fプロモーターは、一部の相互作用を検出できる不均一なバックグラウンドレポーター活性を有する自己活性DNA餌の一例であり、いくつかのTFについては、レポーター活性がバックグラウンドよりも高いかどうかは不明である。強化された酵母ワンハイブリッドアッセイを行う際に発生する可能性のあるいくつかの問題があります。この場合、コロニーが小さすぎて、転送に失敗しました。典型的には、TFの約95%の捕食コロニーが正常な成長を示す。この例では、プレートの一部に酵母の増殖はない。この問題は、一般的に、1536ピンパッドがDNAベイト株芝生、TFアレイ、または交配プレート内の酵母と接触しなかった場合の交配ステップの障害に関連する。これら 2 つの例では、相互作用は検出されません。この問題は、レポーター遺伝子の意図しない不活性化突然変異、特にLacZ、または相互作用を隠す自己活性が高すぎるかに関連していることが多い。この場合、プレートは、細菌汚染にしばしば関連するランダムな青色の斑点を提示する。考慮すべき最も重要なことは、適切なプレートの準備です。すべてのコンポーネントが追加され、その後のすべての手順がこれに依存するので、寒天の高さが均一であることを確認します。ほとんどの試薬は危険ではありませんが、サンプルやプレートの汚染を避けるために常に手袋を着用することが重要です。DNA結合アッセイと同様に、レポーターアッセイ、転写因子のノックダウン、ノックアウトなどの機能アッセイを使用して同定された相互作用を検証し、その後に標的遺伝子の発現を測定することが重要です。この方法により、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子を調節する転写因子と、非コード性疾患関連変異体に対する代替結合を有する転写因子を同定することができた。

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッドスクリーン