Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

이 작품은 건강의 국가 학회 [R35-GM128625 J.I.F.B.]에 의해 지원 되었다.

1입니다. 준비
<ol><li>
Sc −U −H 플레이트 (150 mm 페 트리 접시) 참고: 이 접시는 성장 DNA 미끼 효 모 종자에 대 한 사용 됩니다.<ol>
<li>드롭 아웃 믹스, 효 모 질소 기지 (YNB), 아데닌 hemisulfate와 물, 그리고 pH 5 M NaOH (약 미디어의 리터 당 1 mL, 구성에 대 한 표 2 참조)와 5.9의 920 mL에 황산 암모늄을 디졸브. 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.</li>
		<li>두 번째 2 L...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

로봇 eY1H 짝짓기 심사 방법은 크게 여기에 설명 된 이전 라이브러리 심사에 비해 관심의 기준점과 심사 방식 변화에 따라 DNA 영역에 바인딩되는 TFs의 집합을 식별 하려면 처리량을 증가 시킵니다. 또한, TF DNA 상호 작용 상호 작용의 90%가 감지 당 TF, 모든 4 개의 식민지에 대 한 긍정적인 테스트 및 상호 작용의 90%는 동일한 DNA 미끼 효 모 스트레인10 의 독립적인 화면에서 다시 테스...

생물 의학 분야에서 주요 문제는 각 인간의 유전자는 규제 메커니즘을 결정 하 고. 전사 유전자 식 수준을 제어 하는 첫 번째 단계 이며 고유한 각 유전자 녹음 방송 요인 (TFs)의 세트에 의해 통제 된다. 그 인 간에 대 한 인코딩 > 1500 TFs1,2, 각 유전자의 표현을 제어 하는 TFs의 완전 한 세트를 식별 오픈 도전 남아 있다.
두 가지 유형의 방법 TF DNA 상호 작용 지도를 사용할 수 있습니다: TF를 중심으로 하 고 DNA를 중심으로 방법3 (그림 1A). TF를 중심으로 방법에 관심의 TF genomic DNA 영역 또는 그것의 DNA 의무적인 특이성을 결정 하는 바인딩에 대 한 조사입니다. 이 방법은 높은 처리량 시퀀싱, 단백질 바인딩 microarrays 그리고 SELEX4,,56다음 chromatin immunoprecipitation (칩)를 포함 합니다. DNA 중심 방법에 관심사의 DNA 순서 DNA 시퀀스에 바인딩할 TFs의 세트를 결정 하기 위해 시험 되 다. 이러한 방법 중 가장 널리 적용 되는 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 실험, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자7,,89를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트.
두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예를 들면, 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화9,10 (그림 1B)에 상영 될 수 있는. DNA-미끼를 업스트림 복제 두 기자의 유전자 (LacZ HIS3)와 두 DNA bait::reporter 구조는 chromatinized 'DNA-미끼 긴장'을 생성 하는 효 모 게놈으로 통합 TF-먹이, TF Gal4 TF, 효 모의 활성화 도메인 (AD) 융합을 표현 하는 플라스 미드에 인코딩된 TF DNA 상호 작용에 대 한 물고기 미끼 DNA 스트레인에 소개 된다. TF-먹이 미끼 DNA 시퀀스에 바인딩하는 경우 TF 먹이 광고 두 리포터 유전자의 활성화로 끌 것입니다. 결과적으로 긍정적인 상호 작용으로 세포 성장 판 히스티딘, 부족으로 극복 하 고 경쟁력 있는 억제제, 3-아미노-1,2,4-triazole (3-AT)에 대해 선택 하 고 X-여자의 블루 식민지로 시각 수 수 있습니다. 때문에 강력한 효 모 Gal4 광고 사용, Y1H 분석 transcriptional 활성 제 뿐만 아니라 repressors를 포함 하는 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 더하여, TF 먹이 강한 효 모 발기인 (ADH1)에서 표현, 그 상호 작용 수치가 낮은 생 식, 도전 칩11,12로 감지 하는 TFs에도 감지할 수 있습니다.
Y1H 분석 실험을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 다음 선택, 식민지, 및 상호 작용 TF를 식별 하는 시퀀스 또는 풀링된 TF 먹이 라이브러리를 변환 하 여 효 모 DNA 미끼 종자에 TF-먹이 도입 기반 개별 변형 복제8,9. 이들은 시간이 걸리는 프로토콜, 연구원 당 테스트할 수 있는 DNA 시퀀스의 수를 제한 합니다. Y1H 분석 실험, 이라는의 최근 개선 향상 Y1H (eY1H), 극적으로 각각 표현 하는 다른 효 모 종자의 컬렉션으로 효 모 DNA 미끼 종자 짝 고밀도 배열 (HDA) 로봇 플랫폼을 사용 하 여 심사 처리량을 증가 했다 TF-먹이10,13 (그림 1C). 이 화면만 세 접시를 사용 하 여 quadruplicate에서 가장 인간의 TFs를 테스트 수 있도록 1,536 식민지 형식을 사용 합니다. 또한, TF DNA 상호 작용 없음을 방식 테스트는이 이렇게 상호 작용 (예: 2 개의 noncoding 단일 뉴클레오티드 이체) DNA 미끼 및 다른 TFs 비교에 대 한 허용 또는 TF 변종11,12 ,14.
EY1H 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 구분 된 큰 인간, 꼬마 선 충 DNA를 중심으로 TF-DNA 상호 작용 네트워크 최신. 특히, 우리는 246 인간의 발달 강화 및 283 TFs12사이의 2230 상호 작용을 확인 했습니다. 또한, 우리 eY1H 분석 실험 변경된 TF 바인딩을 109 단일 뉴클레오티드 noncoding 변종 발달 기형, 암, 신경 질환 등 유전 질병와 관련 된 폭로를 고용 했다. 더 최근에, 사용 eY1H을 2576 C. 선 충 유전자 발기인 및 366 TFs11사이 21,714 상호 작용으로 구성 된 네트워크를 나타냅니다. 이 네트워크는 수십 선 충 C. TFs의 기능 역할을 밝히기 위해 쓸모 있었다.
DNA-미끼 얼룩을 생성 하 고 배경 기자 활동의 수준을 평가 프로토콜 되었습니다 다른15,,1617보고. 여기는 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 모든 인간 게놈 DNA 영역을 화면에 사용할 수 있는 eY1H 파이프라인에 설명 합니다. 효 모 DNA 미끼 변형 생성 되 고 TF 먹이 배열의 해당 접시에 발견, 일단 전체 프로토콜 2 주 (표 1)에서 수행할 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 프로토콜 단일 연구원 60 DNA 미끼 시퀀스를 동시에 화면 수 있도록 병렬화 할 수 있습니다. 프로토콜을 설명 하기 위해 우리는 CCL15와 IL17F 두 cytokine 유전자의 발기인 상영. 또한, 우리는 종류의 eY1H 분석 실험 및 그들을 해결 하는 방법을 수행할 때 발생할 수 있는 문제를 설명 하기 위해 실패 한 화면에서 결과 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

각 인간의 유전자를 조절 하는 전사 인자 (TFs)의 집합을 확인 하는 것은 수많은 실험과 전산 접근을 통합 발굴 작업입니다. 하나 이러한 방법은 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 결과, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트 합니다. 두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예., 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화에 대 한 상영 될 수 있는. Y1H 스크린을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 DNA 미끼 효 모 종자로 TF 먹이 라이브러리 또는 배열 변환 기반으로 합니다. 여기, 우리는 파이프라인 기술, 향상 된 Y1H 이라고 (eY1H) 분석 실험, TF DNA 상호 작용 고밀도 어레이 사용 하 여 TF 먹이 긴장의 기준점과 컬렉션으로 DNA 미끼 긴장 짝짓기에 의해 심문 하는 1536에서 심사를 허용 (HDA) 로봇 플랫폼 식민지 형식입니다. 이로써 처리량의 극적인 증가 (60 DNA 미끼 시퀀스에 대 한 > 1000 TFs 연구원 당 2 주 소요) 및 재현성. 우리는 스크린 및 그들을 해결 하는 방법 하는 동안 발생할 수 있는 문제의 예제로 서 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 인간의 발기인 시퀀스를 테스트 하 여 예상된 결과의 종류를 설명 합니다.

때 eY1H 분석 실험에서 결과 분석 세 가지 주요 요소를 고려 한다: DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동, TF DNA 상호 작용, 및 긍정적인 식민지의 수에 해당 하는 기자 활동의 강도. DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동 (즉, autoactivity) 전반적인 성장 및 판독 접시 TF 먹이의 부재에도 효 모 식민지의 색상을 말합니다. 이상적으로, 비 autoactive 긴장 표시 배경 흰색 또는 밝은 갈색 색상, 긍정적인 상호 작용에 대 한 ?...

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Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 > 1000 TFs 단일 실험에서.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

향상된 효모 1 하이브리드 소의 목표는 관심의 DNA 순서에 결합하는 전사 요인의 집합을 확인하는 것입니다. 이 기술의 장점은 향상된 효모 원 하이브리드 아사약이 단일 실험에서 1000개 이상의 전사 인자를 평가할 수 있다는 것입니다. 반대로, 크로마틴 면역 침전은 한 번에 하나의 전사 인자를 평가합니다.이 방법은 기능적 유전체학이 유전자 프로모터 및 강화제에 결합하는 전사 인자의 레퍼토리를 식별하고 비코딩 이체에 결합하는 변경된 전사 인자를 식별하는 핵심 도구를 구성합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 Xing Liu 포스트 독이 될 것입니다. 얼음에 TF 먹이 배열로 효모 글리세롤 스톡 플레이트를 해동.12 채널 파이펫을 사용하여 효모를 다시 중단하고 1~ 3분 이내에 다음 단계로 진행합니다. Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트로 효모를 발견하려면 고밀도 어레이 로봇을 사용하여 멀티웰 96 플레이트를 소스로, 96개의 한천판을 대상으로, 96개의 긴 핀 패드를 선택합니다. 핀 패드는 재사용이 가능하지 않으며 폐기해야 합니다.스팟 많은 프로그램을 선택하여 96웰 플레이트당 두 개의 복사본을 만듭니다. 냉동 주식의 백 오염을 피하기 위해 재활용 또는 재방문 옵션을 사용하지 마십시오. 또한, 효모를 혼합하는 소스에서 위아래로 소용돌이 옵션을 선택합니다.플레이트를 어디에 배치하고 로봇이 트립토판 직사각형 플레이트를 뺀 Sc로 효모를 발견할 수 있도록 하는 장소와 장소에 대한 지침을 따르십시오. 점박이 배열을 가방에 넣고 2~3일 동안 섭씨 30도에서 한천 쪽을 배양합니다. Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트에서 384개의 콜로니 어레이를 생성하려면 96개의 한천판을 소스로, 384개의 한마판과 96개의 짧은 핀 패드를 선택한다.그런 다음 1:4 배열 단일 소스 프로그램을 선택합니다. 이런 식으로, 4 개의 96 식민지 플레이트는 하나의 384 식민지 판으로 통합됩니다. 다른 플레이트 간의 오염을 피하기 위해 재활용 또는 재방문 옵션을 사용하지 마십시오.플레이트를 가방에 넣고 2 일 동안 30섭씨30도에서 발견 된 384 콜로니 어레이 천을 배양하십시오. Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트에서 1536개의 콜로니 어레이를 생성하려면 384개의 한천판을 소스로, 1536개의 한천판을 대상으로, 384개의 짧은 핀 패드를 선택한다. 그런 다음 1:4 분석 단일 소스 프로그램을 선택합니다.목표는 각 식민지를 네 개의 식민지로 복사하여 네 배의 식민지를 얻는 것입니다. 각 식민지를 4번 복사하는 것과 관련이 있기 때문에 재활용 및 재방문 옵션을 사용합니다. 로봇의 지시에 따라 로봇이 3일 동안 섭씨 30도에서 발견된 1536콜로니 어레이 천을 배양하고 배양하기 전에 효모를 접시에 집어 넣을 수 있도록 하십시오.Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트의 1536 콜로니 어레이를 증폭하려면 1536개의 한천 판을 소스로, 1536개의 한천판을 대상으로, 1536개의 짧은 핀 패드를 선택한다. 복제 많은 프로그램을 선택하여 3~4개의 복사본을 복제합니다. 재활용 및 재방문 옵션을 사용하지만 교차 오염을 방지하기 위해 어레이의 다른 플레이트로 전환 할 때 패드를 던져.로봇이 트립토판 직사각형 플레이트를 뺀 Sc의 1536 콜로니 어레이를 증폭할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 접시를 가방에 넣고 3 일 동안 30섭씨에서 발견 된 1536 콜로니 어레이 화창 측을 배양하여 짝짓기 단계에 사용합니다. 짝짓기를위한 DNA 미끼 변형 잔디를 준비하려면 Sc 마이너스 우라실과 히스티딘 플레이트에 DNA 효모 미끼 균주를 발견하고 섭씨 30도에서 3 일 동안 성장하십시오.효모를 15센티미터 Sc로 줄이면 멸균 이쑤시개를 사용하여 우라실과 히스티딘 플레이트를 사용하여 각 플레이트가 12~16가지 균주에 맞도록 합니다. 어느 날 섭씨 30도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 효모를 15센티미터 Sc로 줄이며, 각 플레이트가 4가지 균주에 맞을 수 있도록 멸균 이쑤시개를 사용하여 우라실과 히스티딘 플레이트를 빼고 있습니다.섭씨 30도에서 하루 동안 접시를 배양하십시오. 인큐베이션후 멸균 이쑤시개를 사용하여 효모를 긁어 내고 한천을 긁지 않도록하십시오. 효모를 멸균 수분 500마이크로리터가 있는 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.이제 10~15개의 멸균 유리 구슬과 효모 서스펜션을 YAPD 직사각형 플레이트에 넣습니다. 효모가 접시 전체에 퍼지도록 1 분 동안 모든 방향으로 완전히 흔들어줍니다. 접시를 즉시 반전시키고 비드가 뚜껑으로 이동하도록 누릅니다.구슬을 제거하고 재활용합니다. 접시를 가방에 넣고 섭씨 30도에서 1~2일 동안 한천 쪽을 배양합니다. 그런 다음 짝짓기 단계로 진행합니다.효모 DNA 미끼 및 TF 어레이 균주를 결합하려면 TF 어레이를 로봇과 YAPD 직사각형 플레이트로 옮기습니다. 1536 개의 한천판을 소스와 대상으로 선택하고 1536 개의 짧은 핀 패드를 선택합니다. 많은 복제 프로그램을 선택합니다.4개의 소스 플레이트와 재활용 및 재방문 옵션을 선택합니다. 각 TF 어레이 플레이트는 3 ~4 개의 YAPD 플레이트를 전송하는 데 사용할 수 있습니다. 짝짓기에 사용되는 TF 어레이 플레이트는 2~3일 이어야 하지만 짝짓기가 비효율적이기 때문에 더 이상 그렇지 않습니다.DNA 미끼 균주의 잔디를 이미 TF 어레이가 들어 있는 YAPD 플레이트로 옮기려면 1536개의 한마판을 소스와 표적및 1536개의 짧은 핀 패드로 선택한다. 많은 복제 프로그램을 선택합니다. 반경이 약 0.6밀리미터인 소스에서 임의 오프셋을 사용하여 동일한 지점에서 효모를 복용하지 않도록 하고 대상에 혼합을 선택하여 효모 균주 간의 접촉을 용이하게 합니다.DNA 미끼 균주를 포함하는 잔디를 소스로 사용하고, 접시를 포장하고 하루 동안 30섭씨에서 그들을 식기 측을 배양하기 전에 대상으로 발견 된 TF 배열을 포함하는 YAPD 플레이트. 디플로이드 효모의 선택을 위해, 1536 개의 한마판을 소스와 대상으로 선택하고 1536 개의 짧은 핀 패드를 선택합니다. 복제 프로그램을 선택합니다.소스와 대상에서 믹스를 선택합니다. 로봇이 TAPD 플레이트에서 Sc 마이너스 우라실 및 트립토판 플레이트로 메이트 효모를 전송한 후 접시를 포장하고 2~3일 동안 섭씨 30도에서 식기 쪽을 배양할 수 있도록 합니다. 이제 1536개의 한고판을 소스와 대상 및 1536 개의 짧은 핀 패드로 선택합니다.복제 프로그램을 선택합니다. Sc 마이너스 우라실및 트립토판 플레이트에서 디플로이드 효모를 로봇을 사용하여 플레이트를 포함하는 레딩 아웃 직사각형 3-AT 및 X-gal으로 옮깁니다. 접시를 가방에 넣고 최대 7일 동안 섭씨 30도까지 한천 쪽을 배양합니다.배경 기자 활동이 높은 DNA 미끼 균주의 경우 2 일, 3 및 4 일에 사진을 찍습니다. 그렇지 않으면 4 일과 7 일에 사진을 찍습니다. TF 어레이 플레이트를 실온에서 유지하고 7일 후에 다시 복사하여 새로운 스크리닝을 할 수 있습니다.향상된 효모 원 하이브리드 분석서를 사용하여 얻을 수 있는 결과의 유형을 설명하기 위해 CCL15 및 IL17F 유전자의 발기인 영역은 1086개의 인간 TFs배열에 대해 선별되었다. CCL15 프로모터는 상호 작용, 심지어 약한 것들조차 쉽게 검출될 수 있는 비 자동 활성 DNA 미끼의 예입니다. IL17F 프로모터는 일부 상호 작용을 감지할 수 있는 고르지 않은 배경 리포터 활동을 가진 자동 활성 DNA 미끼의 예이며, 여러 TF의 경우 리포터 활동이 배경보다 높은지 확실하지 않습니다.향상된 효모 한 하이브리드 어필을 수행할 때 발생할 수 있는 몇 가지 문제가 있습니다. 이 경우 식민지가 너무 작고 양도하지 못했습니다. 일반적으로 TF 먹이 식민지의 약 95%가 정상적인 성장을 나타낸다.이 예에서는, 플레이트의 일부에 효모 성장이 없다. 이 문제는 일반적으로 1536 핀 패드가 DNA 미끼 변형 잔디, TF 어레이 또는 짝짓기 플레이트에서 효모와 접촉하지 못하는 경우 짝짓기 단계에서의 실패와 관련이 있다. 이 두 예제에서는 상호 작용이 검색되지 않습니다.이 문제는 종종 리포터 유전자, 특히 LacZ, 또는 상호 작용을 마스크 너무 높은 자동 활성에 의도하지 않은 돌연변이를 활성화하는 것과 관련이 있습니다. 이 경우 플레이트는 세균 오염과 관련된 무작위 파란색 반점을 제공합니다. 고려해야 할 가장 중요한 것은 적절한 플레이트 준비입니다.모든 후속 단계가 이에 따라 달라지기 때문에 모든 구성 요소가 추가되고 한천 높이가 균일하게 되는지 확인합니다. 대부분의 시약은 위험하지 않지만 샘플과 플레이트의 오염을 피하기 위해 항상 장갑을 착용하는 것이 중요합니다. 임의의 DNA 결합 분석과 마찬가지로, 기자 분석, 전사 인자 녹다운 또는 녹아웃과 같은 기능적 분석을 사용하여 확인된 상호 작용을 검증한 다음 표적 유전자의 발현을 측정하는 것이 중요하다.이 방법은 비코딩 질병 관련 이체에 대체 결합을 가진 전사 인자뿐만 아니라 특정 생물학적 과정에 관련된 유전자를 조절하는 전사 인자의 식별을 허용했습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...