Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35-GM128625 å J.I.F.B.].

1. forberedelser
<ol><li>
SC −U −H plater (150 mm Petri retter) Merk: Disse platene brukes for voksende DNA-agn gjær påkjenningen.<ol>
<li>Oppløse den frafallet blanding, gjær nitrogen base (YNB), adenine hemisulfate og ammonium sulfate i 920 mL vann, og pH til 5,9 med 5 M NaOH (ca 1 mL per liter medier, se tabell 2 for sammensetning). Hell i en 2 L kolbe og legge rør bar.</li>
		<li>I en andre 2 L bolle, Legg agar til 950 mL vann (ikke legge rør bar da de...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

Robot eY1H parring screening tilnærming beskrevet her sterkt øker for å identifisere settet med TFs som binder til et DNA område av interesse, sammenlignet med tidligere biblioteket screening eller plassert screening tilnærminger basert på transformasjon. Videre, de TF-DNA interaksjonene oppdaget av eY1H analyser er svært reproduserbare som 90% av interaksjoner oppdaget er positivt for alle fire kolonier testet per TF og 90% av interaksjoner Omtest i en uavhengig skjerm av samme gjær DNA-agn belastning<sup class=...

Et sentralt problem innen biomedisinsk bestemmer mekanismer som hver menneskelig genet er regulert. Transkripsjon er første skritt i å kontrollere gene expression nivåer, og det er regulert av sett med transkripsjonsfaktorer (TFs) som er unike for hver genet. Gitt at mennesker kode > 1500 TFs1,2, identifisere det fullstendige sett av TFs som kontrollerer uttrykk for hver genet er fortsatt et åpent utfordring.
To typer metoder kan brukes til TF-DNA interaksjoner: TF-sentrert og DNA-sentrert3 (figur 1A). I TF-sentrert metoder, er en TF rundt undersøkt for bindingen genomisk DNA regioner eller bestemme sin DNA bindende spesifisitet. Disse metodene omfatter chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming sekvensering, protein bindende microarrays og SELEX4,5,6. I DNA-sentrert metoder, er en DNA sekvens av interesse analysert for å fastslå hvilke TFs som binder til DNA sekvensen. Den mest brukte av slike metoder er gjær en-hybrid (Y1H) analyser, i hvilken interaksjoner mellom TFs og DNA områder er testet i miljøet gjær kjernen bruker reporter gener7,8,9.
Y1H analyser omfatter to komponenter: en 'DNA-agn' (f.eks arrangører, enhancers, lyddempere, etc.) og en 'TF-byttedyr,"som kan bli vist for reporter genet aktivisering9,10 (figur 1B). DNA-agn er klonet oppstrøms av to reporter gener (LacZ og HIS3) og begge DNA-bait::reporter konstruksjoner er integrert i gjær genomet til å generere chromatinized 'DNA-agn stammer." TF-byttet, kodet i en plasmider som uttrykker en TF smeltet aktivisering domenet (AD) av gjær Gal4 TF, er introdusert i DNA-agn belastningen fiske for TF-DNA interaksjoner. Hvis TF-byttet binder til DNA-agn sekvensen, vil Annonsen i TF-byttet føre til aktivering av både reporter gener. Celler med en positiv vekselvirkningen kan derfor valgt for vekst på platene mangler histidin, i tillegg til å overvinne en konkurransedyktig inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), og visualisert som blå kolonier i nærvær av X-gal. Fordi potente gjær Gal4 AD brukes, Y1H analyser kan oppdage samhandlinger med transcriptional aktivator samt repressors. Gitt at TF-preys uttrykkes fra en sterk gjær promoter (ADH1), kan i tillegg interaksjoner oppdages for TFs som har lav endogene uttrykk nivåer som er vanskelig for å oppdage ved ChIP11,12.
Mest publiserte protokoller for å utføre Y1H analyser er basert på presenterer TF-preys i gjær DNA-agn påkjenningen av transformere gruppert TF-byttedyr biblioteker etterfulgt av valg og kolonien plukke sekvensering å identifisere samspill TF, eller ved transformere personlige kloner8,9. Dette er tidkrevende protokoller, begrense antall DNA-sekvenser som kan testes per forsker. En siste forbedring av Y1H analyser, kalt utvidet Y1H (eY1H), har dramatisk økt screening gjennomstrømningen ved hjelp av en høy tetthet matrise (HDA) robot plattform for å mate DNA-agn gjærstammer med en samling av gjær påkjenningen hver uttrykker en annen TF-byttedyr10,13 (figur 1 c). Disse skjermene ansette en 1536 kolonien format tillater å teste de fleste mennesker TFs i quadruplicate bruker bare tre plater. Videre, gitt at TF-DNA interaksjoner er testet på en parvis måte, dette gir sammenligne interaksjoner mellom DNA-agn (for eksempel to noncoding single nukleotid varianter) og mellom ulike TFs eller TF varianter11,12 ,14.
Bruker eY1H analyser, har vi vært største menneskelige og Caenorhabditis elegans DNA-sentrert TF-DNA interaksjoner nettverk hittil. Spesielt har vi identifisert 2.230 vekselsvirkningene mellom 246 menneskelige utviklingsmessige enhancers og 283 TFs12. Videre har vi ansatt eY1H analyser å avdekke endret TF binding til 109 single nukleotid noncoding varianter knyttet til genetiske sykdommer som utviklingsmessige misdannelse, kreft og nevrologiske lidelser. Nylig brukte vi eY1H til å avgrense et nettverk bestående av 21,714 vekselsvirkningene mellom 2576 C. elegans genet arrangører og 366 TFs11. Dette nettverket var å avdekke funksjonelle rolle dusinvis av C. elegans TFs.
Protokollene å generere DNA-agn flekker og evaluere nivåer av bakgrunnen reporter aktivitet har vært rapportert andre steder15,16,17. Her beskriver vi en eY1H rørledning som kan brukes til skjermen noen menneskelige genomisk DNA regionen mot en rekke 1,086 menneskelige TFs. Når en gjær DNA-agn belastning genereres og en TF-byttedyr matrise er oppdaget på de tilsvarende platene, kan hele protokollen utføres i to uker (tabell 1). Enda viktigere, kan protokollen være parallelized slik at en enkelt forsker kan skjermen 60 DNA-agn sekvenser samtidig. For å demonstrere protokollen, vist vi arrangørene av to cytokin gener CCL15 og IL17F. I tillegg, viser vi resultater fra mislykkede skjermer for å illustrere hvilke typer problemer som kan oppstå når eY1H analyser og feilsøke dem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

Identifisere settene med transkripsjonsfaktorer (TFs) som regulerer hver menneskelig genet er en skremmende oppgave som krever integrere mange eksperimentelle og computational tilnærminger. En slik metode er gjær en-hybrid (Y1H) analysen, i hvilken interaksjoner mellom TFs og DNA områder er testet i miljøet gjær kjernen bruker reporter gener. Y1H analyser omfatter to komponenter: en 'DNA-agn' (f.eks., arrangører, enhancers, lyddempere, etc.) og en 'TF-byttedyr,"som kan bli vist for reporter genet aktivisering. Mest publiserte protokoller for å utføre Y1H skjermer er basert på transformere TF-byttedyr biblioteker eller matriser til DNA-agn gjær påkjenningen. Her beskriver vi en rørledning, kalt utvidet Y1H (eY1H) søk, hvor TF-DNA interaksjoner er avhørt av parring DNA-agn stammer med en plassert samling av TF-byttedyr stammer med en høy tetthet matrise (HDA) robot plattform som gjør at screening i en 1,536 kolonien format. Dette gir en dramatisk økning i ytelse (60 DNA-agn sekvenser mot > 1000 TFs tar to uker per forsker) og reproduserbarhet. Vi illustrerer ulike forventede resultater av tester menneskelig promoter sekvenser mot en rekke 1,086 menneskelige TFs, samt eksempler på problemer som kan oppstå under skjermer og feilsøke dem.

Tre hovedfaktorer bør vurderes når analysere resultatene fra eY1H analyser: bakgrunn reporter aktiviteten til DNA-agn belastningen, styrke reporter aktiviteten tilsvarer TF-DNA interaksjoner, og antall positive kolonier. Bakgrunn reporter aktiviteten (dvs. autoactivity) av DNA-agn belastningen refererer til den generelle vekst og fargen på gjær koloniene i avlesning plate, selv i fravær av en TF-byttedyr. Ideelt sett ikke-autoactive stammer Vis en bakgrunn hvit eller lys brun farge, med kolonier for positive interak...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Her presenterer vi en forbedret gjær ett-hybrid screening protokoll for å identifisere transkripsjonsfaktorer (TFs) som kan binde til et menneskelig DNA område av interesse. Denne metoden bruker en høy gjennomstrømming screening rørledningen som kan forhøre binding av > 1000 TFs i et enkelt eksperiment.

Forbedret gjær ett-hybrid-skjermer å identifisere transkripsjon faktor Binding til menneskelig DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Målet med forbedret gjær en-hybrid analyser er identifisere settet av transkripsjon faktorer som binder seg til en DNA-sekvens av interesse. Fordelen med denne teknikken er at forbedret gjær en-hybrid analyser kan evaluere mer enn 1000 transkripsjon faktorer i et enkelt eksperiment. Omvendt evaluerer kromatinimmunoprecipitation bare én transkripsjonsfaktor om gangen.Denne metoden utgjør et viktig verktøy for funksjonell genomikk for å identifisere repertoaret av transkripsjonsfaktorer som binder seg til genarrangører og enhancers og for å identifisere endret transkripsjonsfaktorbinding til ikke-kodingsvarianter. Å demonstrere prosedyren vil være Dr.Xing Liu en postdoktor fra laboratoriet mitt. Tin gjærglyserol lagerplater med TF byttedyr array på is.Resuspend gjær ved hjelp av en 12 kanals pipette og fortsett til neste trinn innen 1 til 3 minutter. For å få øye på gjæren i Sc minus tryptofan rektangulære plater, bruk en høy tetthet array robot for å velge multiwell 96 plater som kilde, 96 agar plater som mål, og 96 lange pin pads. Pin pads kan ikke brukes om igjen og skal kastes.Velg Spot Many-programmet for å lage to kopier per 96 brønnplate. Ikke bruk alternativene for resirkulering eller gå tilbake for å unngå tilbakekontaminering av de frosne bestandene. Velg også alternativet for å virvle opp og ned i kilden for å blande gjæren.Følg instruksjonene for hvor og når du skal plassere platene og la roboten oppdage gjæren i Sc minus tryptofan rektangulære plater. Bag flekkete array og inkubere den agar side opp på 30 grader Celsius i 2 til 3 dager. Hvis du vil generere 384 koloniarrayer i Sc minus tryptofan rektangulære plater, velger du 96 agarplater som kilde, 384 agarplate som mål og 96 korte pin pads.Velg deretter 1:4 array enkelt kilde program. På denne måten vil fire 96 koloniplater bli konsolidert i en 384 koloniplate. Ikke bruk alternativene for resirkulering eller gå tilbake for å unngå kontaminering mellom forskjellige plater.Bag platene og inkubere den flekkete 384 koloni array agar side opp på 30 grader Celsius i 2 dager. Hvis du vil generere 1536 koloniarrayer i Sc minus tryptofan rektangulære plater, velger du 384 agarplater som kilde, 1536 agarplater som mål og 384 korte pin pads. Velg deretter 1:4 analyse enkelt kilde program.Målet er å kopiere hver koloni til fire kolonier for å få quadruplicates. Bruk resirkulering og revisit alternativer som dette innebærer å kopiere hver koloni 4 ganger. Følg robotens instruksjoner og la roboten få øye på gjæren i platene før du pakker og inkuberer den flekkede 1536 koloniarrayen side opp ved 30 grader Celsius i 3 dager.For å forsterke 1536 koloniarrayet i Sc minus tryptofan rektangulære plater, velg 1536 agarplater som kilde, 1536 agarplater som mål og 1536 korte pin pads. Velg repliker mange programmet for å replikere 3 til 4 kopier. Bruk alternativet for resirkulering og gå tilbake, men kast ut puten når du bytter til en annen plate på matrisen for å unngå krysskontaminering.La roboten forsterke 1536 koloniarrayet i Sc minus tryptofan rektangulære plater. Til slutt, bag platene og inkubere den flekkete 1536 koloni array agar side opp på 30 grader Celsius i 3 dager for å bruke for parring trinn. For å forberede DNA agn belastning plener for parring, spot DNA gjær agn stammer på en Sc minus uracil og histidin plate og vokse i 3 dager ved 30 grader Celsius.Strek gjæren inn i en 15 centimeter Sc minus uracil og histidinplate ved hjelp av en steril tannpirker slik at hver plate passer 12 til 16 forskjellige stammer. Inkuber platen en dag ved 30 grader Celsius. Neste dag, strek gjæren inn i en 15 centimeter Sc minus uracil og histidinplate ved hjelp av en steril tannpirker slik at hver plate passer 4 forskjellige stammer.Inkuber platen for en dag ved 30 grader Celsius. Etter inkubasjon, skrap gjæren ved hjelp av en steril tannpirker, og pass på at du ikke skraper noen agar. Tilsett gjæren i et 1,5 milliliter rør med 500 mikroliter sterilt vann.Legg nå til 10 til 15 sterile glassperler og gjærsuspensjonen på en YAPD rektangulær plate. Rist grundig i alle retninger i ett minutt for å sikre at gjæren spres over hele platen. Inverter platen umiddelbart, og trykk slik at perlene går til lokket.Fjern og resirkuler perlene. Bag platene og inkuber dem agar side ned i 1 til 2 dager ved 30 grader Celsius. Deretter går du videre til parringstrinnet.For å parre gjær DNA agn og TF array stammer, overføre TF array til en YAPD rektangulær plate med roboten. Velg 1536 agar plate som kilde og mål, og 1536 kort pin pad. Velg repliker mange-programmet.Velg 4 kildeplater og alternativene for resirkulering og tilbake til nytt. Hver TF-arrayplate kan brukes til å overføre 3 til 4 YAPD-plater. TF-arrayplatene som brukes til parring må være 2 til 3 dager gamle, men ikke mer som parring kan være ineffektiv.Hvis du vil overføre plenen til en DNA-agnstamme til YAPD-platene som allerede inneholder TF-arrayet, velger du 1536 agarplaten som kilde og mål og den korte pin-puten på 1536. Velg repliker mange-programmet. Bruk en tilfeldig forskyvning i kilden med en radius på ca. 0,6 millimeter for å unngå å ta gjær fra samme sted og velg Bland på mål for å lette kontakten mellom gjærstammer.Bruk plenen som inneholder DNA agn stammer som kilde, og YAPD plater som inneholder flekket TF array som mål før bagging platene og inkubere dem agar side opp på 30 grader Celsius for en dag. For valg av diploid gjær, velg 1536 agar plate som kilde og mål, og velg 1536 kort pin pad. Velg Repliker programmet.Velg Bland ved kilde og på Mål. La roboten overføre parret gjær fra YAPD-platene til Sc minus uracil og tryptofanplater før du pakker platene og inkuberer dem agar side opp på 30 grader Celsius i 2 til 3 dager. Nå velger du 1536 agarplater som kilde og mål og 1536 kort pin pad.Velg Repliker programmet. Overfør diploid gjær fra Sc minus uracil og tryptofan plater til avlesning rektangulære 3-AT og X-gal inneholder plater ved hjelp av roboten. Bag platene og inkuber dem agar side opp på 30 grader Celsius i opptil 7 dager.For DNA agn stammer med høy bakgrunn reporter aktivitet, ta bilder på dag 2, 3 og 4. Ellers ta bilder på dag 4 og 7. Hold TF-arrayplatene ved romtemperatur og kopier igjen etter 7 dager for en ny runde med screening.For å illustrere hvilken type resultater som kan oppnås ved hjelp av forbedrede gjær en-hybrid analyser, promotor regioner av CCL15 og IL17F gener ble screenet mot en rekke 1086 menneskelige TFs. CCL15-arrangøren er et eksempel på en ikke-autoaktiv DNA-agn, hvor interaksjoner, selv svake, lett kan oppdages. IL17F-arrangøren er et eksempel på en autoaktiv DNA-agn med ujevn bakgrunnsreporteraktivitet der noen interaksjoner kan oppdages, mens det for flere TFer er usikkert om reporteraktiviteten er høyere enn bakgrunnen.Det er flere problemer som kan oppstå når du utfører forbedret gjær en-hybrid analyser. I dette tilfellet er koloniene for små og klarte ikke å overføre. Vanligvis viser ca 95% av TF byttedyr kolonier normal vekst.I dette eksemplet er det ingen gjærvekst i en del av platen. Dette problemet er vanligvis relatert til en feil i parring trinn hvis 1536 pin pad ikke klarer å få kontakt med gjær i DNA agn belastning plenen, i TF array, eller i parring plate. I disse to eksemplene oppdages ingen interaksjoner.Dette problemet er ofte relatert til enten utilsiktede inaktiverende mutasjoner i reportergenene, spesielt LacZ, eller for høy autoaktivitet som maskerer interaksjoner. I dette tilfellet presenterer platen tilfeldige blå flekker som ofte er relatert til bakteriell forurensning. Det viktigste å vurdere er riktig plate forberedelse.Pass på at alle komponenter legges til, og at agarhøyden er ensartet, da alle påfølgende trinn avhenger av dette. Selv om de fleste reagenser ikke er farlige, er det viktig å bruke hansker til enhver tid for å unngå forurensning av prøvene og platene. Som med enhver DNA bindende analyse, er det viktig å validere interaksjonene identifisert ved hjelp av funksjonelle analyser som reporteranalyser, transkripsjonsfaktor knockdown eller knockout, etterfulgt av måling av uttrykk for målgenet.Denne metoden har tillatt identifisering av transkripsjonsfaktorer som regulerer gener involvert i spesielle biologiske prosesser, samt transkripsjonsfaktorer med alternativ binding til ikke-koding sykdomsrelaterte varianter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA rullegardinmenyen prosedyre å identifisere RNA mål av en lenge ikke-koding

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene målrettede tilfeldig mutagenese Velg Heterochromatin-destabilisere Proteasome mutanter fisjon gjær

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse av sekvens Data fra satsvis gjær 2-Hybrid-skjermer

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bestemme 3-Termini og sekvenser av begynnende Single-strandet virus-DNA molekyler i HIV-1 reversere transkripsjon i infiserte celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforske sekvens plass til å identifisere bindende områder for regulatoriske RNA-binding proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genetisk Screen å identifisere Novel nervecellene gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserte genetiske skjermer i pattedyrceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...