Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [R35-GM128625 de J.I.F.B.].

1. preparações
<ol><li>
Placas −H de −U de SC (pratos de Petri 150 mm) Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo de cepas de leveduras a DNA-isca.<ol>
<li>Dissolva a mistura de abandono, base de nitrogênio levedura (YNB), adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de mídia; ver tabela 2 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.</li>
		...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

A abordagem eY1H robótico acasalamento triagem descrita aqui grandemente aumenta o throughput para identificar o conjunto de TFs que se ligam a uma região de DNA de interesse, em comparação com o anterior rastreio de biblioteca ou triagem matriz abordagens baseadas na transformação. Além disso, as interações de TF-DNA detectadas pelo eY1H ensaios são altamente reprodutíveis como 90% das interações detectadas são positivos para todos os quatro colônias testado por TF, e 90% das interações reteste em uma t...

Um problema central no campo biomédico é determinar os mecanismos pelo qual cada gene humano é regulamentado. Transcrição é o primeiro passo para controlar os níveis de expressão do gene, e ela é regulada por conjuntos de fatores de transcrição (TFs) que são exclusivos para cada gene. Dado que os seres humanos codificam para > 1.500 TFs1,2, identificando o conjunto completo do TFs que controlam a expressão de cada gene permanece um desafio aberto.
Dois tipos de métodos podem ser usados para mapear interações TF-DNA: TF-centrado e centrada no DNA métodos3 (figura 1A). Em métodos TF-centrado, um TF de interesse é sondada para ligação para regiões de DNA genômicas ou para determinar a sua especificidade de ligação do DNA. Estes métodos incluem imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida por sequenciamento de alta produtividade, microarrays de ligação da proteína e SELEX4,5,6. Em métodos centrado no DNA, uma sequência de DNA de interesse é analisada para determinar o conjunto de TFs que ligam para a sequência do DNA. A mais amplamente aplicada de tais métodos é fermento um híbrido (Y1H) os ensaios, no quais as interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando o repórter genes7,8,9.
Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (por exemplo, promotores, melhoradores, silenciadores, etc) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para repórter gene ativação9,10 (figura 1B). A isca de ADN clonada montante de repórter dois genes (LacZ e HIS3) e ambas as construções do DNA-bait::reporter estão integradas no genoma da levedura para gerar chromatinized 'linhagens de DNA-isca'. A TF-presa, codificada em um plasmídeo que expressa um TF fundido-se ao domínio de ativação (AD) da levedura Gal4 TF, é introduzida a estirpe de DNA-isca para pescar interações TF-DNA. Se o TF-rapina vincula-se à sequência de DNA-isca, o anúncio presente na rapina TF levará para a ativação de ambos os genes repórter. Como resultado, as células com uma interação positiva podem ser selecionadas para o crescimento em placas faltando histidina, bem como a superação de um inibidor competitivo, 3-Amino-1, 2,4-triazole (3-a) e visualizadas como colônias azuis na presença de X-gal. Porque o fermento potente Gal4 AD é usado, os ensaios de Y1H podem detectar interações envolvendo ativadores transcricionais, bem como repressores. Além disso, dado que TF-presas são expressos de um promotor forte de fermento (ADH1), interações podem ser detectadas mesmo para TFs com níveis de baixa expressão endógena, que são um desafio para detectar por ChIP11,12.
Mais protocolos publicados para a realização de ensaios de Y1H são baseados em introduzir as cepas de leveduras DNA-isca TF-presas, transformando-se em pool TF-rapina bibliotecas, seguidas por seleção, colônia escolhendo e sequenciamento para identificar o TF interagindo, ou por transformação individual clones8,9. Estes são protocolos demorados, limitando o número de sequências de DNA que podem ser testados por pesquisador. Uma recente melhoria dos ensaios de Y1H, chamado enhanced Y1H (eY1H), aumentou drasticamente a taxa de transferência de rastreio usando uma plataforma robótica de matriz (HDA) de alta densidade para acasalar cepas de leveduras DNA-isca com uma coleção de cepas de leveduras, cada uma expressando uma diferente TF-rapina10,13 (Figura 1). Estas telas empregam uma 1.536 colônia formato permitindo testar TFs mais humano em quadriplicado usando apenas três pratos. Além disso, dado que as interações TF-DNA são testadas de forma emparelhada, esta abordagem permite comparando interações entre DNA-iscas (como duas variantes de nucleotídeo único não-codificante) e entre diferente TFs ou variantes TF11,12 ,14.
Utilizando ensaios de eY1H, foram delineados os humanos maiores e Caenorhabditis elegans TF centrado no DNA-DNA interações redes até à data. Em particular, nós identificamos 2.230 interações entre 246 potenciadores do desenvolvimento humanos e 283 TFs12. Além disso, nós empregamos eY1H ensaios para descobrir a ligação de TF alterada para 109 variantes não-codificante de nucleotídeo único associados a doenças genéticas como a malformação do desenvolvimento, câncer e doenças neurológicas. Mais recentemente, nós costumávamos eY1H delinear uma rede composta por 21.714 interações entre 2.576 promotores de genes de c. elegans e 366 TFs11. Esta rede foi fundamental para desvendar o papel funcional de dezenas de c. elegans TFs.
Os protocolos para gerar manchas de DNA-isca e avaliar os níveis de atividade de repórter de fundo tem sido relatado em outro lugar15,16,17. Aqui, descrevemos um pipeline de eY1H que pode ser usado para qualquer região de DNA genômico humano contra uma matriz de 1.086 TFs humana de tela. Uma vez que uma estirpe de DNA-isca de levedura é gerada e uma matriz de TF-presa está manchado nas chapas de correspondente, o protocolo inteiro pode ser executado em duas semanas (tabela 1). Mais importante, o protocolo pode ser colocado em paralelo para que um único pesquisador pode tela 60 sequências de DNA-isca simultaneamente. Para demonstrar o protocolo, nós selecionados promotores do cytokine os genes CCL15 e IL17F. Além disso, mostramos resultados de falhadas telas para ilustrar os tipos de problemas que possam surgir durante a execução de ensaios de eY1H e como solucioná-los.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

Identificar os conjuntos de factores de transcrição (TFs) que regulam cada gene humano é uma tarefa difícil que requer a integração de diversas abordagens experimentais e computacionais. Um tal método é o ensaio (Y1H) um híbrido do fermento, em qual dessas interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando genes repórter. Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (ex.., promotores, melhoradores, silenciadores, etc.) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para ativação do gene repórter. Mais protocolos publicados para a realização de telas Y1H são baseados em transformar bibliotecas TF-presa ou matrizes em cepas de leveduras de DNA-isca. Aqui, descrevemos um pipeline, chamado Y1H reforçada (eY1H) os ensaios, onde interações TF-DNA são interrogadas por linhagens de DNA-isca com uma coleção de matriz de cepas de TF-presas usando uma matriz de alta densidade de acasalamento plataforma de robótica (HDA) que permite o rastreio em um 1.536 formato de colônia. Isto permite um aumento dramático na taxa de transferência (60 sequências de DNA-isca contra > 1.000 TFs leva duas semanas por pesquisador) e reprodutibilidade. Ilustraremos os diferentes tipos de resultados esperados através do teste de sequências de promotor humano contra uma matriz de 1.086 TFs humano, bem como exemplos de problemas que podem surgir durante as telas e como solucioná-los.

Três fatores principais devem ser considerados ao analisar resultados de ensaios de eY1H: a atividade de repórter de plano de fundo da estirpe DNA-isca, a força da atividade repórter correspondente a interações TF-DNA e o número de colônias positivas. A atividade de repórter de fundo (i.e., autoactivity) da estirpe DNA-isca refere-se ao crescimento global e cor das colônias na placa de leitura, mesmo na ausência de um TF-rapina fermento. Idealmente, as estirpes não-autoactive mostram uma fundo branco ou claro...

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Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de > 1.000 TFs em uma única experiência.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

O objetivo de ensaios de leveduras um híbrido aprimorados é identificar o conjunto de fatores de transcrição que se ligam a uma sequência de DNA de interesse. A vantagem desta técnica é que ensaios de leveduras um híbrido aprimorados podem avaliar mais de 1000 fatores de transcrição em um único experimento. Por outro lado, a imunoprecipitação de cromatina avalia apenas um fator de transcrição por vez.Este método constitui uma ferramenta-chave para a genômica funcional para identificar o repertório de fatores de transcrição que se ligam a promotores e intensificadores genéticos e identificar fator de transcrição alterado vinculando-se a variantes não codificadoras. Demonstrando o procedimento será o Dr. Xing Liu um pós-doutor do meu laboratório. Descongele as placas de estoque de glicerol de levedura com a matriz de presas TF no gelo.Resuspenha a levedura usando uma pipeta de 12 canais e prossiga para o próximo passo dentro de 1 a 3 minutos. Para detectar o fermento em placas retangulares de sc menos triptofano, use um robô de matriz de alta densidade para selecionar placas multiwell 96 como a fonte, 96 placas de ágar como o alvo e 96 almofadas de pinos longos. As almofadas de pinos não são reutilizáveis e devem ser descartadas.Selecione o programa Spot Many para fazer duas cópias por placa de 96 poços. Não use as opções de reciclagem ou revisitar para evitar a contaminação dos estoques congelados. Além disso, selecione a opção de girar para cima e para baixo na fonte para misturar o fermento.Siga as instruções de onde e quando colocar as placas e deixe que o robô localmente a levedura em Sc menos placas retangulares do triptofano. Ensace a matriz manchada e incuba-a lateral de ágar até 30 graus Celsius por 2 a 3 dias. Para gerar 384 matrizes de colônia em Sc menos placas retangulares do triptofano, selecione 96 placas de ágar como fonte, 384 placas de ágar como alvo e 96 almofadas de pinos curtos.Em seguida, selecione o programa de 1:4 array single source. Desta forma, quatro 96 placas de colônia serão consolidadas em uma placa de 384 colônias. Não use as opções de reciclagem ou revisitar para evitar contaminação entre diferentes placas.Ensace as placas e incuba o conjunto de ágar 384 colônias a 30 graus Celsius por 2 dias. Para gerar 1536 matrizes de colônias em Sc menos placas retangulares do triptofano, selecione 384 placas de ágar como fonte, as placas de ágar 1536 como alvo e 384 almofadas de pinos curtos. Em seguida, selecione o programa de 1:4 ensaio único de origem.O objetivo é copiar cada colônia em quatro colônias para obter quadruplicatos. Use as opções de reciclagem e revisitar, pois isso envolve copiar cada colônia 4 vezes. Siga as instruções do robô e permita que o robô localmente o fermento nas placas antes de ensacar e incubar o lado ágar da matriz de 1536 colônias a 30 graus Celsius por 3 dias.Para amplificar a matriz de 1536 colônias em Sc menos placas retangulares triptofano, selecione 1536 placas de ágar como fonte, 1536 placas de ágar como alvo e 1536 almofadas de pinos curtos. Selecione o programa Replicar Muitos para replicar de 3 a 4 cópias. Use a opção reciclar e revisitar, mas jogue fora a almofada ao mudar para uma placa diferente da matriz para evitar contaminação cruzada.Permita que o robô amplie a matriz de 1536 colônias em Sc menos placas retangulares do triptofano. Finalmente, ensace as placas e incuba o agar da matriz de 1536 avistados até 30 graus Celsius durante 3 dias para usar em etapas de acasalamento. Para preparar os gramados da isca de DNA para acasalamento, localmente as iscas de levedura de DNA em uma placa sc menos uracil e histidina e crescer por 3 dias a 30 graus Celsius.Coloque a levedura em uma placa sc de 15 centímetros menos uracil e histidina usando um palito estéril para que cada placa se encaixe de 12 a 16 cepas diferentes. Incubar a placa um dia a 30 graus Celsius. No dia seguinte, coloque a levedura em uma placa sc de 15 centímetros menos uracil e histidina usando um palito estéril para que cada placa se encaixe em 4 cepas diferentes.Incubar a placa por um dia a 30 graus Celsius. Após a incubação, raspe a levedura usando um palito estéril, certificando-se de não raspar nenhum ágar. Adicione o fermento em um tubo de 1,5 mililitro com 500 microliters de água estéril.Agora adicione 10 a 15 contas de vidro estéreis e a suspensão da levedura em uma placa retangular YAPD. Agite bem em todas as direções por um minuto para garantir que o fermento esteja espalhado por toda a placa. Inverta a placa imediatamente, e bata para que as contas vão para a tampa.Remova e recicle as contas. Ensace as placas e incuba-as lado do ágar para baixo por 1 a 2 dias a 30 graus Celsius. Então, vá para a etapa de acasalamento.Para acasalar a isca de DNA de levedura e as cepas de matriz TF, transfira a matriz TF para uma placa retangular YAPD com o robô. Selecione a placa de ágar 1536 como a fonte e o alvo, e a almofada de pino curto de 1536. Selecione o programa Replicar Muitos.Selecione 4 placas de origem e as opções de reciclagem e revisite. Cada placa de matriz TF pode ser usada para transferir de 3 a 4 placas YAPD. As placas de matriz TF usadas para acasalar devem ter de 2 a 3 dias, mas não mais, pois o acasalamento pode ser ineficiente.Para transferir o gramado de uma isca de DNA para as placas yapd já contendo o array TF, selecione a placa de ágar 1536 como a fonte e o alvo e a almofada de pino curto 1536. Selecione o programa Replicar Muitos. Use um deslocamento aleatório na fonte com um raio de aproximadamente 0,6 milímetros para evitar tomar levedura do mesmo local e selecione Mix no Alvo para facilitar o contato entre as cepas de leveduras.Use o gramado contendo as iscas de DNA como fonte, e as placas yapd contendo a matriz TF manchada como o alvo antes de ensacar as placas e incubar-as lado ágar até 30 graus Celsius por um dia. Para seleção de levedura diploide, selecione a placa de 1536 ágar como a fonte e o alvo e selecione a almofada de pino curto 1536. Selecione o programa Replicar.Selecione Mix na Fonte e no Alvo. Permita que o robô transfira o fermento acasalado das placas yapd para as placas sc menos uracil e triptofano antes de ensacar as placas e incubar-as do lado ágar até 30 graus Celsius por 2 a 3 dias. Agora, selecione as placas de 1536 ágar como a fonte e o alvo e a almofada de pino curto 1536.Selecione o programa Replicar. Transfira a levedura diploide das placas Sc menos uracil e triptofano para a leitura retangular 3-AT e X-gal contendo placas usando o robô. Ensace as placas e incuba-as lateral até 30 graus Celsius por até 7 dias.Para iscas de DNA com atividade de repórter de fundo alto, tire fotos nos dias 2, 3 e 4. Caso contrário, tire fotos nos dias 4 e 7. Mantenha as placas de matriz TF em temperatura ambiente e copie novamente após 7 dias para uma nova rodada de triagem.Para ilustrar o tipo de resultados que podem ser obtidos usando ensaios de leveduras uni-híbridos aprimorados, as regiões promotoras dos genes CCL15 e IL17F foram rastreadas contra uma matriz de 1086 TFs humanos. O promotor CCL15 é um exemplo de uma isca de DNA não autoativa, onde as interações, mesmo as fracas, podem ser facilmente detectadas. O promotor do IL17F é um exemplo de uma isca de DNA autoativa com atividade de repórter de fundo desigual onde algumas interações podem ser detectadas, enquanto para vários TFs, é incerto se a atividade do repórter é maior do que o fundo.Existem vários problemas que podem ocorrer ao realizar ensaios de leveduras um-híbrido aprimorados. Neste caso, as colônias são muito pequenas e não conseguiram se transferir. Normalmente, aproximadamente 95% das colônias de presas TF apresentam crescimento normal.Neste exemplo, não há crescimento de levedura em uma porção da placa. Esta questão está geralmente relacionada a uma falha na etapa de acasalamento se a almofada de pino 1536 não fizer contato com o fermento no gramado da isca de DNA, na matriz TF, ou na placa de acasalamento. Nestes dois exemplos, não são detectadas interações.Esta questão está frequentemente relacionada a mutações inativas não intencionais nos genes repórteres, em particular LacZ, ou autoatividade muito alta que mascaram interações. Neste caso, a placa apresenta manchas azuis aleatórias que muitas vezes estão relacionadas à contaminação bacteriana. A coisa mais importante a considerar é a preparação adequada da placa.Certificando-se de que todos os componentes são adicionados e que a altura do ágar é uniforme, pois todas as etapas subsequentes dependem disso. Embora a maioria dos reagentes não sejam perigosos, é importante usar luvas o tempo todo para evitar a contaminação das amostras e placas. Como em qualquer ensaio de ligação de DNA, é importante validar as interações identificadas usando ensaios funcionais como ensaios de repórteres, knockdown de fator de transcrição ou nocaute, seguido pela expressão de medição do gene alvo.Este método permitiu a identificação de fatores de transcrição que regulam genes envolvidos em processos biológicos particulares, bem como fatores de transcrição com vinculação alternativa a variantes não codificadas associadas a doenças.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genética

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Determinante 3'-Termini e sequências de moléculas de ADN Viral de Single-Stranded nascente durante o HIV-1 inverter transcrição em células infectadas

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...