Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [R35-GM128625 до J.I.F.B.].

1. Подготовка
<ol><li>
SC −U −H плиты (Петри 150 мм) Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания штаммов дрожжей ДНК приманки.<ol>
<li>Растворите отсева микс, дрожжи азота базы (YNB), аденин hemisulfate и сульфат аммония в 920 мл воды и pH 5.9 с 5 M NaOH (примерно 1 мл на литр СМ?...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

Робот eY1H спаривания скрининг подход, описанный здесь значительно увеличивает пропускную способность для определения набора TFs, привязанные к ДНК региона интерес, по сравнению с предыдущей библиотеки скрининга или выстроились скрининг подходы, основанные на преобразование. Кроме того...

Центральная проблема в области биомедицины, является определение механизмов, которыми регулируется каждого человека ген. Транскрипция является первым шагом в борьбе уровни выражения гена, и он регулируется наборы факторов транскрипции (TFs), которые являются уникальными для каждого гена. Учитывая, что люди кодировать для > 1500 TFs1,2, определить полный набор TFs, которые контролируют выражение каждого гена остается открытым вызовом.
Два типа методов может использоваться для сопоставления TF-ДНК взаимодействий: TF-центре и ДНК центру методы3 (рис. 1A). TF-центру методов TF интереса является зондируемой для привязки геномной ДНК регионов или для определения его специфика связывания ДНК. Эти методы включают в себя иммунопреципитации chromatin (чип) следуют высокопроизводительного секвенирования, microarrays протеина привязки и SELEX4,5,6. В ДНК центру методов последовательность ДНК интереса является зондируемой определить набор TFs, привязанные к последовательности ДНК. Наиболее широко применяемым из таких методов является дрожжи один гибрид анализов (Y1H), в которых взаимодействия между TFs и ДНК регионах тестируются в среде дрожжи ядра с помощью репортер генов7,8,9.
Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например, промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для Репортер ген активации9,10 (рис. 1B). ДНК приманка клонируется вверх по течению два репортера генов (LacZ и HIS3) и оба ДНК bait::reporter конструкции интегрированы в геноме дрожжи для создания chromatinized ДНК приманка штаммов. TF-добычу, закодированные в плазмиды, выражающий TF сливается для активации домена (AD) дрожжей Gal4 TF, вводится в штамм ДНК приманка для ловли TF-ДНК взаимодействия. Если TF-добычу связывает последовательности ДНК приманка, AD, присутствующих в TF-добычу приведет к активации как репортер генов. В результате клетки с позитивного взаимодействия может выбран для роста на пластины не хватает гистидина, а также преодоление конкурентный ингибитор, 3-амино-1,2,4-триазола (3-AT) и визуализируется как синий колоний в присутствии X-Гал. Потому что мощным дрожжи Gal4 объявление используется, Y1H анализов может обнаруживать взаимодействия с участием transcriptional активаторы, а также подавляющего. Кроме того учитывая, что TF-preys выражаются от сильного дрожжи промоутер (ADH1), взаимодействия могут быть обнаружены даже для TFs, которые имеют низкий эндогенного выражение уровней, которые являются сложными для обнаружения на чип11,12.
Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H анализы основаны на внесении TF-preys в ДНК приманка штаммов дрожжей путем преобразования пуле TF-добычу библиотек, последующим выбор, колонии комплектации и последовательности для определения взаимодействующих TF, или Преобразование отдельных клонов8,9. Это трудоемкий протоколы, ограничивая число последовательностей ДНК, которые могут быть проверены на исследователь. Недавнее улучшение анализов Y1H, называется расширение Y1H (eY1H), резко возросли скрининга пропускную способность с помощью высокой плотности массив (HDA) Роботизированная платформа для каждого выражения разных мат штаммов дрожжей ДНК приманка с коллекцией штаммов дрожжей TF-добычу10,13 (рис. 1 c). Эти экраны используют 1.536 колонии формат, позволяющий проверить большинство человеческих TFs в составленном, используя только три пластины. Кроме того, учитывая, что TF-ДНК взаимодействия тестируются на основе pairwise, этот подход позволяет для сравнения взаимодействий между ДНК приманок (например, два варианта некодирующей единичных нуклеотидных) и между различными TFs или TF варианты11,12 ,14.
С помощью eY1H анализов, мы разделенное крупнейший человека и Caenorhabditis elegans TF-ДНК, ДНК центру взаимодействия сетей к дата. В частности мы определили 2,230 взаимодействий между 246 человеческого развития усилителей и 283 TFs12. Кроме того мы использовали eY1H анализов для выявления измененных TF привязки 109 единичных нуклеотидных некодирующей варианты, связанные с генетическими заболеваниями, такими как пороки развития, рак и неврологических расстройств. Совсем недавно мы использовали eY1H для разграничения сети, состоящей из 21,714 взаимодействий между 2576 C. elegans генным стимуляторам и 366 TFs11. Эта сеть была инструментальная раскрыть функциональные роли десятки C. elegans TFs.
Протоколы для создания ДНК приманка пятна и оценивать уровни фоновой активности репортер были сообщила других15,16,17. Здесь мы описываем eY1H трубопровода, которые могут использоваться для экран любого человека геномной ДНК региона против массив 1086 человека TFs. После того, как формируется дрожжей штамма ДНК приманки и TF-добычу массив выставляется на соответствующий пластин, весь протокол могут быть выполнены в две недели (Таблица 1). Что еще более важно протокол можно распараллелить так, что один исследователь может одновременно экрана 60 последовательностей ДНК приманки. Чтобы продемонстрировать протокол, мы экранированный промоутеров двух генов цитокинов, CCL15 и IL17F. Кроме того мы показываем результаты от неудачных экранов проиллюстрировать типы проблем, которые могут возникнуть при выполнении eY1H анализов и способы их устранения.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

Определение набора факторов транскрипции (TFs), которые регулируют каждого человека ген является сложной задачей, которая требует интеграции многочисленные экспериментальные и расчетные подходы. Один из таких методов является дрожжи пробирного один гибрид (Y1H), в котором взаимодействие между TFs и ДНК регионах тестируются в обстановке дрожжи ядра с помощью репортер генов. Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например., промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для активации Репортер ген. Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H экраны основаны на преобразования библиотеки TF-добычу или массивов в ДНК приманка штаммов дрожжей. Здесь мы описываем трубопровода, называется расширенной Y1H assays (eY1H), где допрашивают TF-ДНК взаимодействия путем спаривания ДНК приманка штаммы с выстроились коллекции штаммов TF-добычу, используя массив высокой плотности (HDA) Роботизированная платформа, которая позволяет скрининга в 1536 колонии формат. Это позволяет резкое увеличение пропускной способности (60 последовательностей ДНК приманка против > 1000 TFs занимает две недели за исследователь) и воспроизводимость. Мы иллюстрируют различные виды ожидаемых результатов путем тестирования человека промоутер последовательности против массив 1086 человека TFs, а также примеры вопросов, которые могут возникнуть во время экраны и способы их устранения.

Три основные факторы следует учитывать при анализе результатов от eY1H анализов: фоновой активности репортер штамма ДНК приманка, сила репортер деятельности соответствующего взаимодействия TF-ДНК и количество положительных колоний. Репортер фоновой активности (например, autoactivity) штамма ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Здесь мы представляем расширенной дрожжи один гибрид скрининг протокол для выявления факторов транскрипции (TFs), которые можно привязать к человеческой ДНК региона интерес. Этот метод использует высокопроизводительного скрининга трубопровода, который может допрашивать связывание > 1000 TFs в одном эксперименте.

Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Цель расширенных дрожжей один гибрид анализов является выявление набора транскрипционных факторов, которые связываются с последовательностью ДНК интерес. Преимущество этого метода заключается в том, что расширенные дрожжи одномио гибридных анализов может оценить более 1000 транскрипционных факторов в одном эксперименте. И наоборот, иммунопреципиентация хроматина оценивает только один транскрипционный фактор за один раз.Этот метод представляет собой ключевой инструмент для функциональной геномики для определения репертуара транскрипционных факторов, которые связываются с генными промоутерами и усилителями, и для выявления измененного фактора транскрипции, связывающего некодирующие варианты. Демонстрация процедуры будет Dr.Xing Лю postdoc из моей лаборатории. Оттепель дрожжей глицерола фондовых пластин с TF добычу массива на льду.Resuspend дрожжей с помощью 12 каналов пипетки и перейти к следующему шагу в течение 1 до 3 минут. Чтобы обнаружить дрожжи в Sc минус триптофан прямоугольные пластины, использовать высокую плотность массива робота, чтобы выбрать multiwell 96 пластин в качестве источника, 96 агар пластин в качестве мишени, и 96 длинных контактных колодок. Pin колодки не являются многоразовыми и должны быть отброшены.Выберите Spot Многие программы, чтобы сделать две копии на 96 хорошо пластины. Не используйте рециркуляции или пересмотреть варианты, чтобы избежать обратного загрязнения замороженных запасов. Кроме того, выберите вариант кружиться вверх и вниз в источнике, чтобы смешать дрожжи.Следуйте инструкциям, где и когда разместить пластины и позволить роботу обнаружить дрожжи в Sc минус триптофан прямоугольные пластины. Сумка пятнистый массив и инкубировать его агар сторону вверх при 30 градусов по Цельсию в течение 2 до 3 дней. Для создания 384 массивов колонии в Sc минус триптофан прямоугольные пластины, выберите 96 агар пластин в качестве источника, 384 агар пластины в качестве цели, и 96 коротких контактных колодок.Затем выберите единую программу 1:4. Таким образом, четыре 96 колоний будут объединены в одну 384 колонии пластины. Не используйте рециркуляции или пересмотреть варианты, чтобы избежать загрязнения между различными пластинами.Сумка пластины и инкубировать пятнистый 384 колонии массив агар стороне при 30 градусов по Цельсию в течение 2 дней. Для создания 1536 массивов колонии в Sc минус триптофан прямоугольные пластины, выберите 384 агар пластин в качестве источника, 1536 агар пластин в качестве мишени, и 384 коротких контактных колодок. Затем выберите программу анализа 1:4 с одним исходным кодом.Цель состоит в том, чтобы скопировать каждую колонию на четыре колонии, чтобы получить четырехкратные. Используйте рециркуляции и пересмотреть варианты, поскольку это включает в себя копирование каждой колонии 4 раза. Следуйте инструкциям робота и позвольте роботу обнаружить дрожжи в тарелках перед мешками и инкубацией пятнистой 1536 колонии массив агар стороны вверх на 30 градусов по Цельсию в течение 3 дней.Чтобы усилить массив 1536 колоний в прямоугольных пластинах Sc минус триптофан, выберите 1536 агарных пластин в качестве источника, 1536 агарных пластин в качестве мишени и 1536 коротких контактных колодок. Выберите программу Replicate Many, чтобы воспроизвести от 3 до 4 копий. Используйте опцию рециркуляции и повторного использования, но выкинуть площадку при переключении на другую пластину массива, чтобы избежать перекрестного загрязнения.Позвольте роботу усилить массив колонии 1536 в прямоугольных пластинах Sc минус триптофан. Наконец, мешок пластин и инкубировать пятнистый 1536 колонии массив агар стороны на 30 градусов по Цельсию в течение 3 дней, чтобы использовать для спаривания шагов. Чтобы подготовить ДНК приманки штамм газонов для спаривания, месте ДНК дрожжей приманки штаммов на Sc минус uracil и гистидин пластины и расти в течение 3 дней при температуре 30 градусов по Цельсию.Streak дрожжей в 15 сантиметров Sc минус uracil и гистидин пластины с помощью стерильной зубочистки, так что каждая пластина подходит от 12 до 16 различных штаммов. Инкубировать пластину один день при 30 градусах по Цельсию. На следующий день, полоса дрожжей в 15 сантиметров Sc минус uracil и гистидин пластины с помощью стерильной зубочистки, так что каждая пластина подходит 4 различных штаммов.Инкубировать пластину в течение одного дня при 30 градусах по Цельсию. После инкубации, соскребать дрожжи с помощью стерильной зубочистки, убедившись, что не царапать любой агар. Добавьте дрожжи в 1,5 миллилитровую трубку с 500 микролитров стерильной воды.Теперь добавьте от 10 до 15 стерильных стеклянных бусин и дрожжевой суспензии на прямоугольную пластину YAPD. Встряхните тщательно во всех направлениях в течение одной минуты, чтобы обеспечить дрожжи распространяется по всей тарелке. Переверните тарелку немедленно, и нажмите так, чтобы шарики пошли на крышку.Удалите и переработайте бисер. Сумка пластины и инкубировать их агар стороны вниз в течение 1 до 2 дней при 30 градусах по Цельсию. Затем приступайте к шагу спаривания.Чтобы спаривать приманку ДНК дрожжей и штаммы массива TF, перенесите массив TF в прямоугольную пластину YAPD с роботом. Выберите 1536 агар пластины в качестве источника и цели, и 1536 короткий контактный колодки. Выберите программу Replicate Many.Выберите 4 исходные пластины и рециркуляции и пересмотреть варианты. Каждая пластина массива TF может быть использована для передачи от 3 до 4 пластин YAPD. Пластины массива TF, используемые для спаривания, должны быть от 2 до 3 дней, но не более того, так как спаривание может быть неэффективным.Для переноса газона штамма приманки ДНК на пластины YAPD, уже содержащие массив TF, выберите 1536 агар пластины в качестве источника и цели и 1536 короткий контактный колодки. Выберите программу Replicate Many. Используйте случайные смещения в источнике с радиусом около 0,6 миллиметра, чтобы избежать принятия дрожжей из того же места и выбрать Mix на цель для облегчения контакта между штаммами дрожжей.Используйте газон, содержащий штаммы приманки ДНК в качестве источника, и пластины YAPD, содержащие пятнистый массив TF в качестве мишени перед мешками пластин и инкубации их агар сторону вверх на 30 градусов по Цельсию в течение одного дня. Для выбора диплоидных дрожжей, выберите 1536 агар пластины в качестве источника и цели, и выберите 1536 короткий контактный колодки. Выберите программу Replicate.Выберите Mix на источнике и на цели. Разрешить роботу передать мякоть дрожжей из пластин YAPD в Sc минус uracil и триптофан пластины перед мешками пластин и инкубации их агар сторону вверх при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 2 до 3 дней. Теперь выберите 1536 агар пластин в качестве источника и цели и 1536 короткий контактный колодки.Выберите программу Replicate. Передача диплоидных дрожжей из Sc минус uracil и триптофан пластин для считывания прямоугольных 3-AT и X-Gal содержащие пластины с помощью робота. Сумка пластины и инкубировать их агар стороны при 30 градусов по Цельсию на срок до 7 дней.Для штаммов приманки ДНК с высокой активностью репортера фона, сфотографировать на дни 2, 3 и 4. В противном случае, фотографировать в дни 4 и 7. Держите пластины массива TF при комнатной температуре и копируйте снова через 7 дней для нового раунда скрининга.Чтобы проиллюстрировать тип результатов, которые могут быть получены с помощью расширенных дрожжей одногигиверных анализов, промоутер регионов CCL15 и IL17F генов были проверены на массив из 1086 человеческих TFs. Промоутер CCL15 является примером не-автоактивной приманки ДНК, где взаимодействия, даже слабые, могут быть легко обнаружены. Промоутер IL17F является примером автоактивной приманки ДНК с неравномерной активностью фонового репортера, где можно обнаружить некоторые взаимодействия, в то время как для нескольких TFs, неясно, является ли активность репортера выше, чем фон.Есть несколько проблем, которые могут возникнуть при выполнении расширенных дрожжей одно-гибридных анализов. В этом случае колонии слишком малы и не передаются. Как правило, примерно 95% колоний добычи TF демонстрируют нормальный рост.В этом примере, нет роста дрожжей в части пластины. Этот вопрос, как правило, связаны с неудачей в шаге спаривания, если 1536 контактная панель не в состоянии установить контакт с дрожжами в ДНК приманки штамм газон, в массиве TF, или в спаривания пластины. В этих двух примерах взаимодействия не обнаруживаются.Эта проблема часто связана либо с непреднамеренными инактивирующими мутациями в генах репортеров, в частности с Лаком, либо с слишком высокой самоактивностью, маскировочной взаимодействия. В этом случае пластина представляет случайные синие пятна, которые часто связаны с бактериальным загрязнением. Самое главное, что нужно учитывать, это надлежащая подготовка пластины.Убедившись, что все компоненты добавляются и что высота агара является равномерной, как и все последующие шаги зависят от этого. Хотя большинство реагентов не являются опасными, важно носить перчатки во все времена, чтобы избежать загрязнения образцов и пластин. Как и в любом анализе связывания ДНК, важно проверить взаимодействия, выявленные с помощью функциональных анализов, таких как анализы репортеров, нокдаун транскрипционные факторы или нокаут, а затем измерение экспрессии гена-мишени.Этот метод позволил идентифицировать транскрипционные факторы, которые регулируют гены, участвующие в конкретных биологических процессах, а также транскрипционные факторы с альтернативной привязкой к некодирующих связанных с болезнью вариантов.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Определение последовательности зарождающейся вирусной ДНК одноцепочечной молекул во время ВИЧ-1 и 3'-Термини обратный транскрипции в инфицированных клетках

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...