Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Institutes of Health [R35-GM128625 till J.I.F.B.].

1. förberedelser
<ol><li>
SC −U −H plattor (150 mm petriskålar) Obs: Dessa plattor kommer att användas för att odla de DNA-bete jäststammar.<ol>
<li>Lös den avhopp mix, jäst kväve bas (YNB), adenin hemisulfate och ammoniumsulfat i 920 mL vatten och pH till 5,9 med 5 M NaOH (ca 1 mL per liter media, se tabell 2 för sammansättning). Häll i en 2 L mätkolv och tillsätt en uppståndelse bar.</li>
		<li>I en andra 2 L mätkolv, tillsätt ägarn till 950 m...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

Den robotic eY1H parning screening metod som beskrivs här kraftigt ökar genomflödet för att identifiera uppsättningen av TFs som binder till en DNA-region av intresse, jämfört med tidigare bibliotek screening eller klädd screening metoder som bygger på omvandling. Ytterligare, TF-DNA interaktionen upptäcks av eY1H analyser finns mycket reproducerbara som 90% av interaktioner upptäckt positiva för alla fyra kolonier testas per TF, och 90% av interaktioner testa i en oberoende skärmen i samma jäst DNA-bete st...

Ett centralt problem i det biomedicinska fältet är att fastställa de mekanismer genom vilka varje mänsklig gen regleras. Transkription är det första steget i Kontrollera gen uttryck nivåer, och det är reglerat av uppsättningar av transkriptionsfaktorer (TFs) som är unika för varje gen. Med tanke på att människor koda för > 1 500 TFs1,2, identifiera komplett uppsättning av TFs som styr uttrycket av varje gen fortfarande en öppen utmaning.
Två typer av metoder kan användas för att mappa TF-DNA interaktioner: TF-centrerad och DNA-centrerad metoder3 (figur 1A). I TF-centrerad metoder, är en TF sevärdheter utforskad för bindning till genomisk DNA regioner eller för att avgöra dess DNA bindande särart. Dessa metoder inkluderar kromatin immunoprecipitation (ChIP) följt av hög genomströmning sekvensering, protein bindande microarrays och SELEX4,5,6. I DNA-centrerad metoder, är en DNA-sekvens av intresse utforskad för att avgöra uppsättningen TFs som binder till DNA-sekvensen. Den mest allmänt tillämpad av sådana metoder är jäst en-hybrid (Y1H) analyser, i vilka interaktioner mellan TFs och DNA testas regioner i miljön av jäst kärnan med reporter gener7,8,9.
Y1H analyser innebär två komponenter: ett 'DNA-bete' (t.ex. initiativtagare, smakförstärkare, ljuddämpare, etc.) och en 'TF-byte' vilket kan undersökas för reporter gen aktiveringen9,10 (figur 1B). DNA-betet är klonade uppströms av två reporter gener (Lindholm och HIS3) och båda DNA-bait::reporter konstruktioner är integrerade i jäst genomet att generera chromatinized 'DNA-bete stammar.' TF-bytet, kodade i en plasmid som uttrycker en TF smält till domänen aktivering (AD) av jäst Gal4 TF, införs i den DNA-bete stammen att fiska för TF-DNA interaktioner. Om TF-bytet binder till DNA-bete sekvensen, kommer då annonsen i TF-bytet leda till aktivering av både reporter gener. Celler med en positiv interaktion kan därför väljas för tillväxt på plattor saknar histidin, samt övervinna en kompetitiv hämmare, 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT), och visualiseras som blå kolonier i närvaro av X-gal. Eftersom den potenta jästen Gal4 AD används, Y1H analyser kan upptäcka interaktioner mellan transkriptionell aktivatorer samt kvinnoförtryckarna. Dessutom, med tanke på att TF-bytesorganismer uttrycks från en stark jäst promotor (ADH1), kan interaktioner upptäckas även för TFs som har låga endogena uttryck nivåer, vilket är en utmaning för att upptäcka av ChIP11,12.
Mest publicerade protokoll för att utföra Y1H analyser bygger på att införa TF-bytesorganismer i de DNA-bete jäststammar genom att omvandla poolade TF-prey bibliotek följt av urval, koloni plocka och sekvensering att identifiera samverkande TF, eller omvandla enskilda kloner8,9. Detta är tidskrävande protokoll, begränsning av antalet DNA-sekvenser som kan testas per forskare. En nyligen förbättring av Y1H analyser, kallas enhanced Y1H (eY1H), har dramatiskt ökat dataflödet som screening med en hög densitet matris (HDA) robotic platform för att para jäststammar DNA-bete med en samling av jäststammar varje uttrycker en annan TF-byte10,13 (figur 1 c). Dessa skärmar anställa en 1 536 kolonin format gör det möjligt att testa de flesta mänskliga TFs i fyra exemplar med endast tre plåtar. Vidare, med tanke på att TF-DNA interaktioner är testade på parvisa sätt, detta tillvägagångssätt möjliggör jämföra interaktioner mellan DNA-beten (såsom två kodande enda nukleotid varianter) och mellan olika TFs eller TF varianter11,12 ,14.
Använder eY1H analyser, har vi beskrivit de största mänskliga och Caenorhabditis elegans DNA-centrerad TF-DNA interaktioner nätverk till-datum. I synnerhet har vi identifierat 2.230 interaktioner mellan 246 mänskliga utvecklingsmässiga smakförstärkare och 283 TFs12. Vidare har vi anställt eY1H analyser att avslöja förändrad TF bindning till 109 enda nukleotid kodande varianter associerade med genetiska sjukdomar såsom utvecklingsmässiga missbildningar, cancer och neurologiska sjukdomar. Mer nyligen, vi brukade eY1H avgränsa ett nätverk bestående av 21,714 interaktioner mellan 2 576 C. elegans gen promotorer och 366 TFs11. Detta nätverk bidrog till att avslöja den funktionella rollen av dussintals C. elegans TFs.
Protokollen till generera DNA-bete fläckar och utvärdera av bakgrunden reporter verksamhet har varit rapporterade någon annanstans15,16,17. Här beskriver vi ett eY1H pipeline som kan användas till skärmen någon mänsklig genomisk DNA regionen mot en rad 1 086 mänskliga TFs. När en jäst DNA-bete stam genereras och en TF-byte-matris är fläckig på motsvarande plattorna, kan hela protokollet utföras i två veckor (tabell 1). Viktigare, kan protokollet vara parallelized så att en enskild forskare kan skärmen 60 DNA-bete sekvenser samtidigt. För att demonstrera protokollet, vi initiativtagarna till två cytokingener CCL15 och IL17F. Dessutom visar vi resultat från misslyckade skärmar för att illustrera vilka typer av problem som kan uppstå när du utför eY1H analyser och felsÃ¶kning av dem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

Identifiera uppsättningarna av transkriptionsfaktorer (TFs) som reglerar varje mänsklig gen är en svår uppgift som kräver att integrera ett flertal experimentella och kalkylmässiga metoder. En sådan metod är den jäst en-hybrid (Y1H) analys, i vilken interaktioner mellan TFs och DNA testas regioner i miljön av jäst kärnan med hjälp av reporter gener. Y1H analyser innebär två komponenter: ett 'DNA-bete' (e.g., initiativtagare, smakförstärkare, ljuddämpare, etc.) och en 'TF-byte' vilket kan undersökas för reporter gen aktivering. Mest publicerade protokoll för att utföra Y1H skärmar är baserade på omvandla TF-prey bibliotek eller matriser till DNA-bete jäststammar. Här beskriver vi en rörledning, kallas utökade Y1H (eY1H)-analyser, där TF-DNA interaktioner är under parning DNA-bete stammar med en klädd samling av TF-prey stammar med en hög densitet matris (HDA) robotic plattform som tillåter screening i en 1,536 koloni-format. Detta ger en dramatisk ökning genomströmning (60 DNA-bete sekvenser mot > 1000 TFs tar två veckor per forskare) och reproducerbarhet. Vi illustrerar de olika typerna av förväntade resultat av provning mänskliga arrangören sekvenser mot en rad 1 086 mänskliga TFs, samt exempel på problem som kan uppstå under skärmar och felsÃ¶kning av dem.

Tre huvudsakliga faktorer övervägas när analysera resultat från eY1H analyser: bakgrunden reporter aktiviteten av DNA-bete stammen, styrkan i aktiviteten reporter motsvarar TF-DNA interaktioner och antalet positiva kolonier. Bakgrunden reporter verksamhet (dvs. autoactivity) DNA-bete stammen avser den totala tillväxt och färg av jäst kolonierna i avläsning plattan, även i avsaknad av ett TF-byte. Helst icke-autoactive stammar visar en vit eller ljus brun bakgrundsfärg, med kolonier för positiva interaktioner ?...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Här presenterar vi en förbättrad jäst en-hybrid screening protokoll för att identifiera de transkriptionsfaktorer (TFs) som kan binda till en mänsklig DNA-region av intresse. Denna metod använder en hög genomströmning screening pipeline som kan förhöra bindningen av > 1 000 TFs i ett enda experiment.

Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Målet med förbättrad jäst en-hybrid analyser är att identifiera den uppsättning transkriptionsfaktorer som binder till en DNA-sekvens av intresse. Fördelen med denna teknik är att förbättrad jäst en-hybrid analyser kan utvärdera mer än 1000 transkription faktorer i ett enda experiment. Omvänt utvärderar kromatin immunprecipitation endast en transkriptionsfaktor i taget.Denna metod utgör ett nyckelverktyg för funktionell genomik för att identifiera repertoaren av transkriptionsfaktorer som binder till genpromotorer och förstärkare och för att identifiera förändrad transkriptionsfaktor som är bindande för icke-kodande varianter. Demonstrera förfarandet kommer att Dr.Xing Liu en postdoc från mitt laboratorium. Tina jäst glycerol lager plattor med TF byte array på is.Resuspend jästen med hjälp av en 12 kanals pipett och gå vidare till nästa steg inom 1 till 3 minuter. För att upptäcka jästen i Sc minus tryptofan rektangulära plattor, använd en hög densitet array robot för att välja multiwell 96 plattor som källa, 96 agar plattor som mål, och 96 långa stift kuddar. Pin-kuddar är inte återanvändbara och bör kasseras.Välj programmet Spot Many om du vill göra två kopior per 96 brunnsplatta. Använd inte återvinnings- eller återbesöksalternativen för att undvika tillbakakontaminering av de frysta lagren. Välj också alternativet att virvla upp och ner i källan för att blanda jästen.Följ anvisningar för var och när du ska placera plattorna och låt roboten att upptäcka jästen i Sc minus tryptofan rektangulära plattor. Väska fläckig array och ruva den agar sida upp på 30 grader Celsius i 2 till 3 dagar. För att generera 384 kolonimatriser i Sc minus tryptofan rektangulära plattor, välj 96 agar plattor som källa, 384 agar platta som mål, och 96 korta stift kuddar.Välj sedan 1:4-matrisens enda källprogram. På så sätt kommer fyra 96 koloniplattor att konsolideras till en 384 koloniplatta. Använd inte återvinnings- eller återbesöksalternativen för att undvika kontaminering mellan olika plattor.Väska plattorna och ruva fläckig 384 koloni array agar sida upp på 30 grader Celsius i 2 dagar. För att generera 1536 kolonimatriser i Sc minus tryptofan rektangulära plattor, välj 384 agar plattor som källa, de 1536 agar plattorna som mål, och 384 korta stift kuddar. Välj sedan 1:4-analys enda källprogrammet.Målet är att kopiera varje koloni i fyra kolonier för att få fyrdubblas. Använd de återvinna och se över alternativ eftersom detta innebär att kopiera varje koloni 4 gånger. Följ robotens instruktioner och låt roboten upptäcka jästen i plattorna innan uppsamlare och inkubera den fläckiga 1536 koloni array agar sidan upp på 30 grader Celsius i 3 dagar.För att förstärka 1536 koloni array i Sc minus tryptofan rektangulära plattor, välj 1536 agar plattor som källa, 1536 agar plattor som mål, och 1536 korta stift kuddar. Välj programmet Replikera många om du vill replikera 3 till 4 kopior. Använd alternativet återvinna och återbesök men kasta ut dynan när du byter till en annan platta av matrisen för att undvika korskontaminering.Låt roboten förstärka 1536 koloni array i Sc minus tryptofan rektangulära plattor. Slutligen, väska plattorna och ruva fläckig 1536 koloni array agar sida upp på 30 grader Celsius i 3 dagar att använda för parning steg. För att förbereda DNA-betet stam gräsmattor för parning, plats DNA jäst bete stammar på en Sc minus uracil och histidin tallrik och växa i 3 dagar vid 30 grader Celsius.Strimm jästen i en 15 centimeter Sc minus uracil och histidin plattan med hjälp av en steril tandpetare så att varje platta passar 12 till 16 olika stammar. Inkubera plattan en dag vid 30 grader Celsius. Nästa dag, strimma jästen i en 15 centimeter Sc minus uracil och histidin plattan med hjälp av en steril tandpetare så att varje platta passar 4 olika stammar.Inkubera plattan för en dag vid 30 grader Celsius. Efter inkubation, skrapa jästen med hjälp av en steril tandpetare, se till att inte skrapa någon agar. Tillsätt jästen i ett 1,5 milliliterrör med 500 mikroliter sterilt vatten.Nu lägga 10 till 15 sterila glaspärlor och jäst suspension på en YAPD rektangulär platta. Skaka ordentligt i alla riktningar i en minut för att säkerställa att jästen sprids i hela plattan. Invertera plattan omedelbart, och knacka så att pärlorna går till locket.Ta bort och återvinn pärlorna. Väska plattorna och ruva dem agar sida ner i 1 till 2 dagar vid 30 grader Celsius. Därefter fortsätter du till parningssteget.För att para jästen DNA-betet och TF-matrisstammarna överför du TF-matrisen till en YAPD-rektangulär platta med roboten. Välj 1536 agar plattan som källa och målet, och 1536 kort stift pad. Välj programmet Replikera många.Välj 4 källplattor och alternativen för att återvinna och se över. Varje TF-matrisplatta kan användas för att överföra 3 till 4 YAPD-plattor. TF-matrisplattorna som används för parning måste vara 2 till 3 dagar gamla, men inte mer eftersom parning kan vara ineffektiv.För att överföra gräsmattan av en DNA-bete stam till YAPD plattor som redan innehåller TF array, välj 1536 agar plattan som källa och målet och 1536 kort stift pad. Välj programmet Replikera många. Använd en slumpmässig offset i källan med en radie på cirka 0,6 millimeter för att undvika att ta jäst från samma plats och välj Mix on Target för att underlätta kontakten mellan jäststammar.Använd gräsmattan som innehåller DNA-betesstammarna som källa, och YAPD-plattorna som innehåller den fläckiga TF-arrayen som mål innan du packar plattorna och ruvar dem agarsidan upp på 30 grader Celsius under en dag. För val av diploidjäst väljer du 1536 agarplattan som källa och mål och väljer 1536-kortstiftsdynan. Välj programmet Replikera.Välj Blanda på Källa och på Mål. Låt roboten överföra den parade jästen från YAPD-plattorna till Sc minus uracil och tryptofanplattorna innan du packar plattorna och ruvar dem agarsidan upp i 30 grader Celsius i 2 till 3 dagar. Nu väljer du 1536 agar plattor som källa och målet och 1536 kort stift pad.Välj programmet Replikera. Överför diploidjästen från Sc minus uracil- och tryptofanplattorna till de rektangulära 3-AT- och X-gal-innehållande plattorna med hjälp av roboten. Väska plattorna och ruva dem agar sida upp vid 30 grader Celsius i upp till 7 dagar.För DNA-betesstammar med hög bakgrundsreporteraktivitet, ta bilder på dag 2, 3 och 4. Annars tar du bilder på dag 4 och 7. Håll TF-matrisplattorna i rumstemperatur och kopiera igen efter 7 dagar för en ny omgång av screening.För att illustrera vilken typ av resultat som kan erhållas med hjälp av förbättrad jäst en-hybrid analyser, var promotorn regionerna av CCL15 och IL17F gener screenas mot en matris med 1086 mänskliga TFs. CCL15 promotorn är ett exempel på en icke-autoaktiv DNA-bete, där interaktioner, även svaga sådana, lätt kan upptäckas. IL17F-promotorn är ett exempel på en autoaktiv DNA-bete med ojämn bakgrundsreporteraktivitet där vissa interaktioner kan upptäckas, medan det för flera TFs är osäkert om reporteraktiviteten är högre än bakgrund.Det finns flera problem som kan uppstå när du utför förbättrad jäst en-hybrid analyser. I detta fall är kolonier för små och misslyckades med att överföra. Vanligtvis visar cirka 95% av TF byteskolonier normal tillväxt.I detta exempel finns det ingen jästtillväxt i en del av plattan. Denna fråga är i allmänhet relaterad till ett fel i parningssteget om 1536 pin pad misslyckas med att få kontakt med jästen i DNA-betet stam gräsmatta, i TF array, eller i parningsplattan. I dessa två exempel upptäcks inga interaktioner.Detta problem är ofta relaterat till antingen oavsiktliga inaktiverande mutationer i reportern gener, i synnerhet LacZ, eller för hög autoaktivitet som maskerar interaktioner. I detta fall presenterar plattan slumpmässiga blå fläckar som ofta är relaterade till bakteriell kontaminering. Det viktigaste att tänka på är korrekt tallrik förberedelse.Se till att alla komponenter läggs till och att Agar höjd är enhetlig som alla efterföljande steg beror på detta. Även om de flesta reagenser inte är farliga är det viktigt att alltid använda handskar för att undvika kontaminering av proverna och plattorna. Som med alla DNA-bindande analys, Är det viktigt att validera de interaktioner som identifierats med hjälp av funktionella analyser såsom reporter analyser, transkriptionsfaktor knockdown eller knockout, följt av mätning uttryck av målet genen.Denna metod har möjlig gjort det möjligt att identifiera transkriptionsfaktorer som reglerar gener som är involverade i synnerhet biologiska processer samt transkriptionsfaktorer med alternativ bindning till icke-kodande sjukdomsrelaterade varianter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down förfarande att identifiera RNA mål av en lång icke-kodande RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen-riktade slumpmässig mutagenes att välja Heterokromatin-destabiliserande proteasom mutanter i Fission jäst

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Avgörande 3'-Termini och sekvenser av begynnande enkelsträngat virala DNA-molekyler under HIV-1 omvänd Transkription i infekterade celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforska Sekvensutrymme för att identifiera bindnings platser för regulatoriska RNA-bindande proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo framåt genetisk skärm för att identifiera nya neuroprotektiva gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Poolade CRISPR-baserade genetiska skärmar i däggdjursceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...