Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [J.I.F.B. için R35-GM128625] tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlıkları
<ol><li>
SC −U −H levha (150 mm Petri yemekler) Not: Bu tabakları DNA-yem maya suşları büyüyen için kullanılacaktır.<ol>
<li>Bırakma mix, Maya azot Bankası (YNB), adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 5 M NaOH (yaklaşık medya litre başına 1 mL; kompozisyon için bkz: Tablo 2 ) ile geçiyoruz. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.</li>
		<li>Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

Robot eY1H çiftleşme tarama yaklaşımı büyük ölçüde burada açıklanan faiz önceki Kütüphane tarama için karşılaştırıldığında, ya da dönüşüm üzerinde göre dizilmiş tarama yaklaşımlar bir DNA bölgesine bağlamak TFs kümesini tanımlamak için daha fazla işlem hacmi artar. Ayrıca, tüm dört kolonileri için olumlu TF test edilmiş ve etkileşimleri yüzde 90'ını aynı Maya DNA-yem zorlanma10 bağımsız bir ekranda tekrar test etkileşimleri % 90'ı tespit deneyl...

Biyomedikal alanında merkezi bir sorun hangi tarafından her insan gen düzenlenmiştir mekanizmaları belirliyor. Transkripsiyon gen ifade düzeyleri kontrol ilk adım, ve bu her gen özgüdür transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tarafından düzenlenir. Verilen bu insan için kodlamak > her gen ifadesi kontrol TFs eksiksiz kümesi tanımlayan 1.500 TFs1,2, kalır açık bir meydan okuma.
İki tür yöntemi TF-DNA etkileşimleri eşlemek için kullanılan: TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri3 (resim 1A). TF merkezli yöntemlerinde, bağlama genomik DNA bölgeleri veya onun DNA bağlama özgüllük belirlemek için bir TF ilgi probed. Bu yöntemler yüksek üretilen iş sıralama, protein bağlayıcı microarrays ve SELEX4,5,6takip kromatin immunoprecipitation (ChIP) içerir. DNA merkezli yöntemlerinde, DNA dizisi bağlamak TFs kümesini belirlemek için bir DNA dizisi ilgi probed. Bu yöntemlerden en yaygın olarak uygulanan Maya bir hibrid (Y1H) deneyleri, TFs ve DNA arasında hangi etkileşimleri bölgeleri reporter genler7,8,9kullanarak Maya çekirdeği ortamda test edilir var.
Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (örneğin, organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek9,10 için (Şekil 1B) ekranlı av,'. DNA-yem akıntıya karşı klonlanmış iki muhabir gen (LacZ ve HIS3) ve her iki DNA-bait::reporter yapıları chromatinized 'DNA-yem suşları.' oluşturmak için Maya genom entegre edilmiştir TF-av, harekete geçirmek etki alanına Gal4 TF, Maya (AD) erimiş bir TF ifade eder bir plazmid kodlanmış TF-DNA etkileşimleri için balık için DNA-yem gerilim girmiştir. TF-av DNA-yem sırasına bağlanır, TF-av içinde mevcut reklam her iki gazeteci genleri harekete geçirmek yol açacaktır. Sonuç olarak, olumlu etkileşim içeren hücreler büyüme histidin eksik yanı sıra bir rekabetçi inhibitörü, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), üstesinden plakaları için seçilen ve X-gal huzurunda mavi koloniler olarak görüntülenir. Çünkü güçlü Maya Gal4 AD kullanıldığında, Y1H deneyleri ilgili transkripsiyon aktivatörleri yanı sıra repressors etkileşimleri algılayabilir. Ayrıca, verilen bu TF-dualarının güçlü Maya organizatörü (ADH1) ifade edilir, etkileşimleri için bile çip11,12' algılamak için zorlu düşük endojen ifade seviyesine sahip TFs algılanabilir.
Y1H deneyleri gerçekleştirmek için en yayımlanmış protokolleri seçimi, koloni tespit ve etkileşen TF tanımlamak için sıralama veya havuza alınmış TF-av kitaplıkları dönüştürerek Maya DNA-yem suşları TF-dualarının tanıtımı üzerinde temel alan bireysel dönüşüm8,9klonlar. Bunlar araştırmacı test edilebilir DNA dizileri sayısını sınırlama zaman alıcı kurallarıdır. Y1H deneyleri, adı verilen bir son gelişme Y1H Gelişmiş (eY1H), önemli ölçüde artmıştır tarama işlem hacmi Maya DNA-yem suşları maya suşları topluluğu ile her bir farklı ifade dostum için bir yüksek yoğunluklu dizi (HDA) robot platformu kullanarak TF-av10,13 (Şekil 1 c). Bu ekranlar bir 1.536 koloni biçimine izin en insan TFs sadece üç tabak kullanarak quadruplicate test etmek için istihdam. TF-DNA etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir göz önüne alındığında, daha fazla, bu yaklaşım etkileşimler DNA-yemler (örneğin iki kodlamayan tek nükleotid çeşitleri) arasında farklı TFs arasında karşılaştırmak için olanak tanır veya TF türevleri11,12 ,14.
EY1H deneyleri kullanarak, biz en büyük insan ve Caenorhabditis elegans DNA merkezli TF-DNA etkileşimleri ağlar-Tarih belirlendi. Özellikle, 246 insan gelişimsel arttırıcılar ve 283 TFs122,230 Hofstede belirledik. Ayrıca, biz eY1H deneyleri 109 tek nükleotid kodlamayan değişik gelişimsel malformasyonu, kanser ve nörolojik bozukluklar gibi genetik hastalıklar ile ilişkili değişmiş TF bağlama ortaya çıkarmak için istihdam. Daha yakın zamanlarda, eY1H 21,714 etkileşimleri 2,576 C. elegans gen rehberleri ile 366 TFs11arasında oluşan bir ağ betimlemek için kullanılır. Bu ağ, C. elegans TFs onlarca işlevsel rolü ortaya çıkarmak için bir vesile oldu.
Protokol DNA-yem lekeleri oluşturmak ve arka plan muhabir etkinliği düzeylerini değerlendirmek için başka bir yerde15,16,17bildirdi. Burada, herhangi bir insan genomik DNA bölge 1,086 insan TFs bir dizi karşı ekran için kullanılan bir eY1H boru hattı açıklayın. Bir kez bir Maya DNA-yem zorlanma oluşturulur ve bir TF-av dizi karşılık gelen tabak fark edilir, tüm protokol iki haftada (Tablo 1) gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, böylece tek bir araştırmacı 60 DNA-yem dizileri aynı anda ekran protokol parallelized. Protokol göstermek için iki sitokin gen CCL15 ve IL17F ve ekranlı. Buna ek olarak, eY1H deneyleri ve onları giderme işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları türlerini göstermek için başarısız ekranlar sonuç göster.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

Her insan gen düzenleyen transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tanımlayan çok sayıda deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar entegre gerektiren bir iştir. Böyle bir yöntem hangi Hofstede TFs ve DNA bölgeleri reporter genler kullanarak Maya çekirdeği ortamda sınanır Maya bir hibrid (Y1H) tahlil olduğunu. Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (e.g., organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek için ekranlı av,'. Y1H ekranlar yerine getirmek için kullanılan en yayımlanmış protokolleri TF-av kitaplıkları veya dizileri DNA-yem maya suşları dönüşüm üzerinde temel alır. Burada, biz bir ardışık düzen tanımlamak, gelişmiş Y1H denilen (eY1H) deneyleri, nerede TF-DNA etkileşimleri DNA-yem suşları dizilmiş bir koleksiyonundan bir yüksek yoğunluklu kullanarak TF-av suşlarının çiftleşme tarafından sorguya bir 1,536 tarama sağlar (HDA) robot platformu Koloni biçimi. Bu işlem hacmi dramatik bir artış sağlar (karşı 60 DNA-yem dizileri > 1000 TFs araştırmacı başına iki hafta alır) ve tekrarlanabilirlik. Biz insan organizatörü dizileri 1,086 insan TFs yanı sıra ekranlar ve onları giderme sırasında ortaya çıkabilecek sorunları örnekleri bir dizi karşı test ederek beklenen sonuçları farklı türleri gösterilmektedir.

Üç ana faktör ne zaman analiz eY1H deneyleri sonuçları düşünülmelidir: arka plan muhabir etkinliği DNA-yem baskı, TF-DNA etkileşimleri ve olumlu kolonileri sayısına karşılık gelen muhabir etkinlik gücünü. DNA-yem zorlanma arka plan muhabir etkinliği (örneğin, autoactivity) genel büyüme ve okuma plaka bir TF-av yokluğunda bile Maya kolonilerde rengini gösterir. İdeal olarak, bir arka plan beyaz veya açık kahverengi renk, Sigara autoactive suşları göstermek colonies olumlu etkileşimler iç...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan > 1000 TFs tek denemede.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Geliştirilmiş maya tek melez tahlillerin amacı, bir DNA ilgi dizisine bağlanan transkripsiyon faktörleri kümesini tanımlamaktır. Bu tekniğin avantajı, gelişmiş maya tek melez tahliller tek bir deneyde 1000'den fazla transkripsiyon faktörleri değerlendirebilirsiniz. Tersine, kromatin immünopresidivarı aynı anda sadece bir transkripsiyon faktörünü değerlendirir.Bu yöntem, gen yükselticilerine ve arttırıcılarına bağlanan transkripsiyon faktörlerinin repertuarını belirlemek ve kodlamayan varyantlara bağlanan değiştirilmiş transkripsiyon faktörünü belirlemek için fonksiyonel genomikler için önemli bir araçtır. Prosedürü gösteren Dr.Xing Liu benim laboratuvarımdan bir doktora sonrası olacak. Buz üzerinde TF av dizisi ile maya gliserol stok plakaları çözültün.12 kanallı pipet kullanarak mayayı yeniden askıya alın ve 1 ila 3 dakika içinde bir sonraki adıma geçin. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar içine maya nokta için, kaynak olarak multiwell 96 plakaları seçmek için yüksek yoğunluklu bir dizi robot kullanın, hedef olarak 96 agar plakaları, ve 96 uzun pin pedleri. Pin pedleri yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.96 kuyu plakası başına iki kopya yapmak için Spot Birçok programını seçin. Dondurulmuş stokların geri kontaminasyonunu önlemek için geri dönüşüm veya yeniden kullanım seçeneklerini kullanmayın. Ayrıca, maya karıştırmak için kaynak yukarı ve aşağı girdap seçeneği seçin.Plakaları nereye ve ne zaman yerleştirebileceğinize yönelik talimatları uygulayın ve robotun mayayı Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalara yerleştirmesine izin verin. Çanta benekli dizi ve 2 ila 3 gün boyunca 30 derece santigrat kadar agar tarafı kuluçka. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalarda 384 koloni dizisi oluşturmak için kaynak olarak 96 agar plaka, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa iğne pedi seçin.Ardından 1:4 dizi tek kaynak programını seçin. Bu şekilde, dört adet 96 koloni plakası bir 384 koloni plakasında birleştirilir. Farklı plakalar arasındaki kirlenmeyi önlemek için geri dönüşüm veya yeniden kullanım seçeneklerini kullanmayın.Plakaları poşetle ve benekli 384 koloni dizisini 2 gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar 1536 koloni dizileri oluşturmak için, kaynak olarak 384 agar plakaları seçin, hedef olarak 1536 agar plakaları, ve 384 kısa pin pedleri. Ardından 1:4 tek kaynak programını seçin.Amaç, dört katına çıkarmak için her koloniyi dört koloniye kopyalamaktır. Her koloninin 4 kez kopyalanması yla ilgili olarak geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneklerini kullanın. Robotun talimatlarına uyun ve robotun 3 gün boyunca 30 santigrat derecede benekli 1536 koloni dizisini paketlemeden ve kuluçkaya yatırmadan önce mayayı plakalara göre tespit etmesine izin verin.Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar 1536 koloni dizi yükseltmek için, kaynak olarak 1536 agar plakaları seçin, hedef olarak 1536 agar plakaları, ve 1536 kısa pin pedleri. 3 ila 4 kopyayı çoğaltmak için Çoğaltma Çok programını seçin. Geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneğini kullanın, ancak çapraz kontaminasyonu önlemek için dizinin farklı bir plakasına geçerken pedi atın.Robotun Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar içinde 1536 koloni dizisini yükseltmek için izin verin. Son olarak, plakaları torba ve 30 derece santigrat kadar 3gün boyunca miyon adımlar için kullanmak için benekli 1536 koloni dizisi agar tarafı kuluçka. Dna yem zorlanma çimleri mite için hazırlamak için, bir Sc eksi urasil ve histidine plaka üzerinde DNA maya yem suşları nokta ve 3gün boyunca 30 santigrat derece büyümek.Her plaka 12-16 farklı suşları sığacak şekilde steril bir kürdan kullanarak 15 santimetre Sc eksi urasil ve histidin plaka içine maya Streak. Tabağı bir gün 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her plaka 4 farklı suşları sığar, böylece steril bir kürdan kullanarak 15 santimetre Sc eksi urasil ve histidin plaka içine maya çizgi.Tabağı bir gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, steril bir kürdan kullanarak maya kazıyın, herhangi bir agar kazımak için emin olun. 500 mikrolitre steril su ile 1,5 mililitrelik bir tüp içine maya ekleyin.Şimdi 10 ila 15 steril cam boncuk ve maya süspansiyon bir YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya plaka boyunca yayılır sağlamak için bir dakika boyunca her yöne iyice çalkalayın. Plakayı hemen ters çevirin ve boncukların kapağına gitmesi için dokunun.Boncukları çıkarın ve geri dönüştürün. Tabakları poşetleyin ve 30 santigrat derecede 1 ila 2 gün boyunca agar tarafını kuluçkaya yatırın. Daha sonra, miyon adıma geçin.Maya DNA yemi ve TF dizi suşlarını çiftleştirmek için TF dizisini robotla birlikte YAPD dikdörtgen plakaya aktarın. Kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma Çok programı seçin.4 kaynak plakası ve geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneklerini seçin. Her TF dizi plakası 3-4 YAPD plaka transferi için kullanılabilir. Miteleme için kullanılan TF dizi plakaları 2 ila 3 günlük olmalıdır, ancak daha fazla değil, miyelik verimsiz olabilir.DNA yem sürüncünün çimlerini Zaten TF dizisini içeren YAPD plakalarına aktarmak için kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma Çok programı seçin. Aynı noktadan maya alarak önlemek için yaklaşık 0,6 milimetre yarıçapı ile kaynak rasgele bir ofset kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak için Hedef Mix seçin.Kaynak olarak DNA yem suşlarını içeren çimleri ve plakaları poşetleri poşetleyip bir gün boyunca 30 derecede agar tarafını kuluçkaya yatırmadan önce benekli TF dizisini içeren YAPD plakalarını hedef olarak kullanın. Diploid maya seçimi için kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını seçin ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma programını seçin.Kaynakta ve Hedef'te Mix'i seçin. Robotun, plakaları poşetleyip 30 derecede 30 derecede 2-3 gün kuluçkaya yatırmadan önce, yapd plakalarından mated mayayı Sc eksi urasil ve triptofan plakalarına aktarmasını bekleyin. Şimdi, kaynak ve hedef ve 1536 kısa pin pad olarak 1536 agar plakaları seçin.Çoğaltma programını seçin. Diploid mayayı Sc eksi urasil ve triptofan plakalarından robotu kullanarak plakaiçeren okuma dikdörtgen 3-AT ve X-gal'a aktarın. Plakaları poşetleyin ve 7 güne kadar 30 santigrat derecede agar tarafını kuluçkaya yatırın.Yüksek arka plan muhabiri aktivitesi ile DNA yem suşları için, gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, gün 4 ve 7 fotoğraf çekmek. TF dizi plakalarını oda sıcaklığında tutun ve yeni bir tarama turu için 7 gün sonra tekrar kopyalayın.Gelişmiş maya tek melez tahliller kullanılarak elde edilebilir sonuçların türünü göstermek için, CCL15 ve IL17F genlerin organizatör bölgeleri 1086 insan TFs bir dizi karşı taranmış edildi. CCL15 organizatörü, etkileşimlerin, hatta zayıf olanların bile kolayca tespit edilebildiği, otoaktif olmayan DNA yemi örneğidir. IL17F organizatörü bazı etkileşimler tespit edilebilir düzensiz arka plan muhabiri etkinliği ile bir otoaktif DNA yem bir örnektir, birkaç TFs için ise, muhabir etkinliği arka plan daha yüksek olup olmadığı belirsizdir.Gelişmiş maya tek melez tahliller yaparken oluşabilir çeşitli sorunlar vardır. Bu durumda, koloniler çok küçük ve aktarmak için başarısız oldu. Tipik olarak, TF av kolonilerinin yaklaşık %95'i normal büyüme gösterir.Bu örnekte, plakanın bir kısmında maya büyümesi yoktur. 1536 pin pad DNA yem süzme çim maya ile temas yapmak için başarısız olursa bu sorun genellikle meting adımda bir başarısızlık ile ilgilidir, TF dizi, ya da miyelik plaka. Bu iki örnekte, hiçbir etkileşim algılanır.Bu sorun genellikle muhabir genlerde istenmeyen inaktive mutasyonlar ile ilgilidir, özellikle LacZ, ya da çok yüksek otoaktivite maske etkileşimleri. Bu durumda, plaka genellikle bakteriyel kontaminasyon ile ilgili rasgele mavi lekeler sunar. Göz önünde bulundurulması gereken en önemli şey uygun plaka hazırlama.Sonraki tüm adımlar buna bağlı olduğundan, tüm bileşenlerin eklenmediğinden ve agar yüksekliğinin tek düze olduğundan emin olun. Çoğu reaktif tehlikeli olmasa da, numune lerin ve plakaların kirlenmesini önlemek için her zaman eldiven takmak önemlidir. Herhangi bir DNA bağlayıcı testinde olduğu gibi, muhabir tahlilleri, transkripsiyon faktörü nakavt veya nakavt gibi fonksiyonel tahliller kullanılarak tanımlanan etkileşimleri doğrulamak ve ardından hedef genin ekspresyonunu ölçmek önemlidir.Bu yöntem, belirli biyolojik süreçlerde yer alan genleri düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin ve kodlamayan hastalıkla ilişkili varyantlara alternatif bağlanma ile transkripsiyon faktörlerinin tanımlanmasına olanak sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...