Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها معهد لمعهد الصحة الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي ومنحة مرض الكلي (K08DK106450) وجائزة جروسفيلد جاي من "الرابطة الأمريكية لجراحي طب الأطفال" إلى C.J.H.

تم الحصول على موافقة المجلس الاستعراض المؤسسي (IRB #2013-15152) لجمع عينات الأنسجة من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الأمعاء في Ann وروبرت H. لوري الأطفال في مستشفى شيكاغو، شيكاغو. وأجريت جميع البروتوكولات امتثالا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية واللوائح لرفاهية الإنسان. المطلوب موافقة الوالد...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li><li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa.">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+(NEC).">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li><li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis.">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids:+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation.">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).</li><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering.">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

هذه الرواية السابقين فيفو انتيرويد المعوية البشرية نموذج يخدم كوسيلة مفيدة لدراسة الخلل في جدار الأمعاء في التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC). تم تكييف أساليب المعالجة انتيرويد المعروضة هنا من الأعمال السابقة للدكتور حسن ضبابية، ومايكل هيلمراث وفيرتهايم جايسون10،...

انتيرويدس البشرية هي السابقين فيفو ثقافة ثلاثي الأبعاد نظام المتولدة من الخلايا الجذعية المعزولة من الخبايا المعوية من عينات الأنسجة المعوية البشرية. كان رائدا هذا النموذج الرائد بها هانز كليفيرس et al في عام 2007 عقب اكتشاف Lgr5 + الخلايا الجذعية في الأقبية الأمعاء الدقيقة في الفئران1. عملهم وأرسى الأساس لإقامة السابقين فيفو ثقافة الظهارية المعوية العديد من أنواع الخلايا التي يمكن أن تكون باساجيد دون التغييرات الوراثية أو الفسيولوجية الهامة2. ومنذ هذا الاكتشاف، استخدمت انتيرويدس كنموذج رواية لدراسة فسيولوجيا الجهاز الهضمي الطبيعي، والفسيولوجيا المرضية للأمراض المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء والتفاعلات المضيف الممرض والطب التجديدي2.
الاستخدام من انتيرويدس كالسابقين فيفو نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المعوية مزايا عديدة على تقنيات بديلة. للعقود العديدة الماضية، استخدمت خطوط مخلدة الخلية المستمدة من سرطان الأمعاء ونماذج حيوانية لدراسة علم وظائف الأعضاء المعوية3،،من45. الثقافات خلية واحدة لا تمثل تنوع أنواع الخلايا الموجودة في ظهارة الأمعاء العادية، وبالتالي تفتقر إلى خلية إلى خلية عبر الحديث والجزء-خصوصية في التعبير البروتين، والإشارات، والأمراض الناجمة عن العوامل الممرضة6. الخلايا الجذعية في انتيرويدس تفرق في أهم أنواع الخلايا الظهارية مثل انتيروسيتيس بانته الخلايا والخلايا قدح، والخلايا انتيروندوكريني و أكثر3. معرض قطبية، الاضطلاع بمهام النقل الظهارية، والسماح ل خصوصية المعوية الجزء6. حيث يمكن أن الخص انتيرويدس متعددة أنواع خلايا ظهارة الأمعاء البشرية، فقادرة على التغلب على هذا القيد المعترف بها من الأنظمة المستندة إلى خلايا السرطان. مع مرور الوقت، مشتقات خطوط الخلية هي سوبكلونيد وتتطور إلى إبداء قدر أكبر من التنوع في التعبير والتعريب البروتين3. على العكس من ذلك، يمكن أن باساجيد انتيرويدس دون التغييرات الوراثية أو الفسيولوجية الهامة2. وبالرغم من وجود العديد من النماذج الحيوانية للجنة الوطنية للانتخابات، قد تكون الاستجابة للإصابة والتدخلات العلاجية اختلافاً كبيرا بين الأنواع. ونتيجة لهذه القيود، تفشل العلاجات المستمدة من النماذج الحيوانية 90% الوقت عند اختبارها في التجارب البشرية بسبب الاختلافات في سمية أو كفاءة3. انتيرويدس بمثابة نماذج ما قبل السريرية الواعدة التي يمكن التغلب على أوجه القصور هذه، مما يؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية المعوية المعقدة، ومن ثم أكثر الابتكارات العلاجية ناجحة وفعالة من حيث التكلفة. وهناك أيضا أدلة حديثة من الأنسجة التي يتم إنشاؤها انتيرويد من العمر ما زالت هامة بيولوجيا7. هذه تفاصيل مهمة خاصة لنموذجنا منذ انتيرويدس تتولد من أنسجة الأطفال حديثي الولادة، وبالتالي الحفاظ على أهميتها الفسيولوجية للمرضى مع اللجنة الوطنية للانتخابات.
الأداة المساعدة انتيرويدس كنماذج لأمراض البشرية تواصل توسيع، أملا في إيجاد علاجات لظروف قاسية وانتشارا. التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC) هو مرض معوي مدمرة الولدان تتميز بنخر الأمعاء وكثيراً ما يؤدي إلى ثقب جدار الأمعاء وتسمم الدم والموت8. سبب الفيزيولوجيا المرضية المعقدة والمتعددة العوامل من NEC، الآلية الدقيقة لهذا المرض قد لا بعد تم تماما توضيح؛ ومع ذلك، زيادة نفاذية الأمعاء كان متورطا بوضوح في عملية المرض8. ونظرا لأن دراسة اللجنة الوطنية للانتخابات والعوامل العلاجية المحتملة تحديا أخلاقيا في البشر، وبخاصة الأطفال، فمن المرغوب فيه جداً الاستفادة من نموذج انتيرويد بيولوجيا ذات صلة من NEC باستخدام الأنسجة البشرية في الأطفال حديثي الولادة. لم انتيرويدس حتى الآن بدور محدود في الدراسة للجنة الوطنية للانتخابات. ويصف هذا البروتوكول استعمال انتيرويدس المستمدة من عينات الأنسجة المعوية البشرية كرواية السابقين فيفو نموذج للدراسة لالتهاب الأمعاء والقولون النّاخر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC) مرض مدمر للأطفال حديثي الولادة. تتميز بالتعديلات باثوفيسيولوجيك متعددة في ظهارة الأمعاء البشرية، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الأمعاء، ضعف في الرد، وزاد موت الخلية. على الرغم من أن هناك العديد من النماذج الحيوانية من اللجنة الوطنية للانتخابات، قد تكون الاستجابة للإصابة والتدخلات العلاجية اختلافاً كبيرا بين الأنواع. وعلاوة على ذلك، أنها تمثل تحديا أخلاقيا لدراسة المرض الفيزيولوجيا المرضية أو العوامل العلاجية رواية مباشرة على البشر، لا سيما الأطفال. ولذلك، مرغوب فيه للغاية تطوير نموذج رواية من NEC باستخدام الأنسجة البشرية. انتيرويدس أورجانويدس الأبعاد 3-المستمدة من الخلايا الظهارية المعوية. مثالية لدراسة التفاعلات الفسيولوجية المعقدة، مما يشير إلى خلية، والدفاع المضيف الممرض. في هذه المخطوطة يصف لنا بروتوكول انتيرويدس البشرية تلك الثقافات بعد عزل الخلايا الجذعية المعوية من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الأمعاء. الخلايا سرداب تستزرع في الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو التي تشجع على التفرقة في الخلية مختلف أنواع الأم من ظهارة الأمعاء البشرية. وتزرع هذه الخلايا في مزيج الاصطناعية، كولاجينوس من البروتينات بمثابة سقالة، محاكاة الغشاء الطابق السفلي خارج الخلوية. نتيجة لذلك وضع انتيرويدس قطبية قمي باسولاتيرال. الإدارة المشارك من lipopolysaccharide (LPS) في وسائل الإعلام يسبب استجابة التهابية في انتيرويدس، مما يؤدي إلى نسيجية، والوراثية، والبروتين التعبير تعديلات مماثلة لتلك التي شهدتها البشرية NEC. نموذج تجريبي من NEC باستخدام الأنسجة البشرية قد توفر منبرا أكثر دقة للمخدرات والعلاج الاختبار قبل التجارب على الإنسان، ونحن نسعى جاهدين للتعرف على علاج لهذا المرض.

فورا بعد الطلاء، تظهر الخبايا المعوية المعزولة حديثا كقضبان ممدود. في غضون ساعات، سوف تأخذ انتيرويد على مظهر جولة (الشكل 1). خلال الأيام القليلة المقبلة، سوف تبدأ انتيرويدس تشكيل المجالات كما هو مبين في الشكل 1ب. مهدها وي?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

انتيرويدس تبرز كنموذج رواية في دراسة الأمراض البشرية. البروتوكول وصف كيفية محاكاة نموذج انتيرويد للبشرية التهاب الأمعاء والقولون النّاخر استخدام العلاج lipopolysaccharide (لبس) من انتيرويدس التي تم إنشاؤها من أنسجة الأطفال حديثي الولادة. انتيرويدس التي تم جمعها تبين التغيرات المثيرة شبيهة بتلك التي شهدتها البشرية التهاب الأمعاء والقولون النّاخر.

نموذج انتيرويد الظهارية الإنسان رواية لالتهاب الأمعاء والقولون النّاخر

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

الأمعاء هي أجهزة أعضاء ثلاثية الأبعاد مشتقة من الخلايا الظهارية المعوية. فهي مثالية لدراسة التفاعلات الفسيولوجية المعقدة ، وإشارات الخلايا ، والدفاع الممرض المضيف. يصف بروتوكولنا كيفية زراعة الأمعاء البشرية بعد عزل الخلايا الجذعية المعوية من المرضى الذين يخضعون لعملية استئصال الأمعاء.الإدارة المشتركة للدهون الدهنية في وسائل الإعلام ثقافتنا يسبب استجابة التهابية في المعوي مما يؤدي إلى الهستوولوجي، والوراثة، والبروتين التعديلات التعبير مماثلة لتلك التي شوهدت في التهاب القولون المعوي نخر الإنسان. وبالنظر إلى أن دراسة التهاب الأمعاء القولون النخري والعوامل العلاجية المحتملة تشكل تحديا أخلاقيا في البشر، وخاصة الأطفال، فمن المرغوب فيه للغاية الاستفادة من هذا النموذج البيوئي الرواية ذات الصلة بيولوجيا من التهاب الأمعاء القولون النخري باستخدام أنسجة حديثي الولادة البشرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الأمعاء قادرة على تلخيص أنواع الخلايا المتعددة من ظهارة الأمعاء البشرية وقادرة على التغلب على القيود المعترف بها من النماذج الحيوانية والنظم القائمة على الخلايا.المساعدة في إثبات الإجراء سيكون كريستي بونباني، وهي مقيمة جراحية، وكاري يوان، فني مختبر من مختبرنا. في وقت جمع في جناح المنطوق، ووضع عينة الأنسجة المعوية الصغيرة الإنسان في DPBS الباردة. اغسل العينة في DPBS الباردة حتى تكون واضحة من الدم والبراز.تخزين العينة في RPMI 1640 المتوسطة في أربع درجات مئوية حتى جاهزة لعزل سرداب. عندما تكون جاهزة للمضي قدما، تحقق مرة أخرى أن العينة واضحة من البراز والدم. باستخدام مقص تشريح حساسة إزالة أي الدهون الزائدة أو لقطات الجراحية والمواد الغذائية.وزن العينة والهدف لقطعة التي هي ما يقرب من 0.75 إلى 2.5 غرام. بعد ذلك ، قطع الأنسجة إلى قطع 0.5 سنتيمتر ووضعها في أنبوب يحتوي على 30 ملليلتر من الحاجز المؤقت رقم واحد. هز بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.ثم، تصفية الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر والتخلص من تدفق من خلال. إضافة الأنسجة المصفاة إلى أنبوب يحتوي على 30 ملليلتر من chelating العازلة رقم اثنين. هز بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.تصفية الأنسجة من خلال مرشح 100 ميكرومتر والتخلص من تدفق من خلال. بعد ذلك، ذوبان 500 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. إضافة بعض الأنسجة إلى 10 ملليلتر من DMEM الباردة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ويهز بقوة باليد لمدة 10 ثانية.تصفية هذا التعليق من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر وجمع تدفق من خلال. أبق هذا الأنبوب على الجليد إضافة بعض الأنسجة إلى آخر 10 ملليلتر من DMEM الباردة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر منفصلة ويهز بقوة باليد لمدة 10 ثانية.تصفية هذا التعليق من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر وجمع تدفق من خلال. كرر العملية مرتين إضافية حتى يكون هناك أربعة أنابيب المخروطية التي تحتوي على تدفق من خلال واحد المسمى من خلال أربعة. ثم، تصفية الحل في أنبوب رقم واحد من خلال مصفاة الخلية ميكرومتر 100 ونقل تدفق من خلال إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر أيضا المسمى رقم واحد.كرر هذه العملية للأنابيب من 2 إلى 4. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 15 ملليلتر في 200 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في غطاء محرك التدفق الفاتن، إزالة ناظر من كل أنبوب وتجاهله.تجنب تعطيل سحابة من الأنسجة مباشرة فوق بيليه، حتى لو كان ذلك يعني ترك بعض متجاوز وراء. في كل أنبوب، ماصة صعودا وهبوطا ببطء لخلط بيليه مع بقايا supernatant. نقل الخليط من كل أنبوب إلى أنبوب واحد مخروطي ملليلتر وطاردة مركزية في 200 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.بعد هذا، وإزالة عظمى و resuspend بيليه في 500 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي قبل ذوبانها. استخدام طرف ماصة مبردة لتطبيق 50 ميكرولترات من هذا التعليق إلى مركز بئر في 24 لوحة جيدا. يجب أن تظهر هذه العينة على شكل قبة.كرر عملية الطلب هذه تسع مرات لملء 10 آبار إجمالية. نقل 24 لوحة البئر إلى حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح البلمرة. ثم، إضافة 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام المصغرة الإنسان كاملة إلى كل بئر.مواصلة احتضان تحت نفس الظروف، مع التأكد من استبدال هذه الوسائط كل يومين. أولاً، إضافة 10 ميكرولترات من LPS بتركيز خمسة ملليغرام لكل ملليلتر إلى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المصغرة البشرية كاملة في كل بئر من لوحة في اليوم صفر. مواصلة احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون واستبدال وسائل الإعلام المكملة كل يومين حتى جمع.للتحضير للparffin embedding ، أولا إزالة بلطف وسائل الإعلام ، إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ، والماصات بلطف صعودا وهبوطا إلى حل مصفوفة غشاء الطابق السفلي في حين يجري الحرص على عدم التحلل من الـ المعوي. أجهزة الطرد المركزي بسرعة أقل من 300 مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه ثم إزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 4٪ paraformaldehyde وتوضع أنبوب جانبا لمدة ساعة واحدة لإصلاح في درجة حرارة الغرفة.أجهزة الطرد المركزي بسرعة أقل من 300 مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه ثم إزالة شبه شكلي. اغسل بلطف مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية بسرعة أقل من 300 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم إزالة برنامج تلفزيوني.كرر عملية الغسيل هذه مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ضع الكمية المطلوبة من هلام معالجة الأنسجة في أنبوب مخروطي وتدفئه في حاضنة حمام جاف عند 65 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى 10 دقائق حتى يصبح سائلًا. بعد ذلك، إضافة هلام معالجة الأنسجة الذائبة إلى بيليه ومزيج بلطف.ضع حلقة استنساخ صغيرة في غطاء. مازيت هلام معالجة الأنسجة والخليط المعوي في حلقة الاستنساخ التي يتم تركيبها على غطاء. السماح لجل معالجة الأنسجة والخليط المعوي لتتوطد عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.ثم غمر حلقة الاستنساخ مع الخليط المترسخ في 70٪ الإيثانول للتحضير embedding البارافين. مباشرة بعد الطلاء، و سرداب الأمعاء المعزولة حديثا تظهر كقضبان ممدود. في غضون ساعات سوف تأخذ الoidoids على مظهر مستدير.على مدى الأيام القليلة القادمة سوف تبدأ الـoidoids في تشكيل المجالات. يجب أن يحدث في مهدها بين خمسة إلى 10 أيام، وهو عندما يجب أن تحدث جمع البايoid. كما تظهر الـ"الـ"بياتويد" المتنامية قطبية، تحتوي على تجويف مركزي، وحدود بيضوية، ومجال الريحانية.الـ (1) تظهر أيضاً السلامة الهيكلية التي يمثلها هيكل قوي للكتّيل الكيسي. بعد عدة أيام في الثقافة، والـ LBS المعالجة الoidoids تجربة أكثر المبرمج وناقلة من مجموعة التحكم. كما رأينا في NEC الإنسان في نماذج مورين من NEC، تم العثور على تعبير زيادة من حصيلة مثل مستقبلات أربعة في الـ LPS المعالجة المعوية مقارنة بالضوابط.ويمكن أيضا أن يتم جمع البايويدات ل الحمض النووي الريبي والبروتين استخراج باستخدام راسخة qRT-PCR وتقنيات النشاف الغربية التعبير الجيني وعزل البروتين يمكن أن يؤديها.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث المعوية المشتقة لدراسة وتعديل الحماية الخلوية الظهاريه ضد السالمونيلا ومسببات الامراض الأخرى

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

التمايز المستحث للخلايا الشبيهة بالخلايا M في الطبقات الأحادية المعوية اللفائفية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

نموذج جديد عالي الإنتاجية لجرح جلد الأغنام خارج الجسم الحي لاختبار المضادات الحيوية الناشئة

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...