Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
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这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病赠款研究所 (K08DK106450) 和美国儿科外科协会 jay Grosfeld 奖对 c. j. h. 的支持。

获得机构审查委员会批准 (IRB #2013-15152), 以便从伊利诺伊州芝加哥安和罗伯特 H. Lurie 儿童医院接受肠道切除的病人收集组织样本。所有议定书都是按照机构和国家人类福利准则和条例执行的。在所有情况下, 在采集样本之前都需要得到父母的书面知情同意。
1. 试剂制备
<ol><li>为整个组织收集准备培养基库存溶液: Dulbecco 改性鹰培养基 (DMEM) 的1升、胎儿牛血清 (FBS) 的110毫升、?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li><li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa.">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+(NEC).">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li><li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis.">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids:+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation.">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).</li><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering.">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

这种新型的体外人体肠肠素模型可作为坏死性小肠结肠炎 (NEC) 肠道屏障功能障碍的研究方法。这里介绍的肠内处理方法是根据 Misty good 博士、Michael Helmrath 博士和 Jason Wertheim博士 10、11、12 的前一部工作改编的。
有关整个组织收集和密码隔离时间的详细信息是本协议中的关键步骤。手术切除时必须立即收?...

人肠内化合物是一种从人体肠道组织样本的肠道隐窝中分离出的干细胞产生的体外三维培养系统。2007年, 汉斯·克莱弗斯等人在小鼠1的小肠隐窝中发现 lgr5 + 干细胞后, 开创了这一突破性模型。他们的工作为建立多种细胞类型的体外肠道上皮培养奠定了基础, 这些细胞可以在没有明显遗传或生理变化的情况下被传代2。自这一发现以来, 肠体已被用作研究正常消化生理学的新模型, 以及炎症性肠病、宿主病原体相互作用和再生医学2等肠道疾病的病理生理学.
与替代技术相比, 使用肠内生物作为肠道病理生理学研究的体外模型有几个优势。近几十年来, 动物模型和不朽的肠道癌症衍生细胞系被用于肠道生理研究3,4,5。单细胞培养并不代表正常肠道上皮细胞类型的多样性, 因此在蛋白质表达、信号和病原诱发疾病方面缺乏细胞对细胞的交叉对话和节段特异性 6.肠内细胞中的干细胞分化为主要的上皮细胞类型, 如肠细胞、Paneth 细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等3种。它们表现出极性, 执行上皮运输功能, 并允许肠道部分特异性6。由于肠体可以重述人类肠道上皮的多种细胞类型, 他们能够克服这种公认的局限性的癌症细胞为基础的系统。随着时间的推移, 细胞系的衍生物被克隆和进化, 以显示出更大的多样性, 蛋白质表达和定位3。相反, 肠内化合物可以在没有显著遗传或生理变化的情况下进行传代2。尽管有许多 nec 的动物模型, 但对伤害的反应和治疗干预可能在物种之间差异很大。由于这些限制, 从动物模型中提取的疗法在人体试验中测试的时间有90% 的时间都在失败, 因为毒性或疗效的差异3。肠素作为有前途的临床前模型, 可以克服这些缺陷, 导致更好地了解复杂的肠道病理生理学, 从而更成功和更具成本效益的治疗创新。最近还有证据表明, 肠体产生的组织年龄在生物学上仍然重要 7.这是一个特别重要的细节, 我们的模型, 因为肠素是由新生儿组织产生, 从而保持生理相关性的 nec 患者。
肠类固醇作为人类疾病的模型的效用继续扩大, 希望找到治疗严重和普遍的疾病的方法。坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是一种破坏性的新生儿肠道疾病, 其特点是肠道坏死, 经常导致肠壁穿孔、败血症和死亡8。由于 NEC 的复杂和多因素病理生理学, 该疾病的确切机制尚未得到充分阐明;然而, 肠道通透性的增加显然与疾病过程有牵连8。鉴于 NEC 和潜在治疗药物的研究在人类主体, 特别是儿童的伦理上具有挑战性, 因此非常希望使用使用人类新生儿组织的 NEC 的生物学相关肠样模型。到目前为止, 肠体在 NEC 的研究中的作用有限。该方案描述了从人体肠道组织样本中提取的肠素作为一种新的体外模型来研究坏死性小肠结肠炎的方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是新生儿的一种毁灭性疾病。它的特点是人类肠道上皮的多种病理生理改变, 导致肠道通透性增加, 恢复受损, 细胞死亡增加。虽然 NEC 有许多动物模型, 但对伤害的反应和治疗干预可能在物种之间差异很大。此外, 直接在人体, 特别是儿童身上研究疾病病理生理学或新型治疗药物在伦理上具有挑战性。因此, 开发一种利用人体组织的新的 NEC 模型是非常可取的。肠内化合物是从肠道上皮细胞中提取的三维有机体。它们是研究复杂生理相互作用、细胞信号转导和宿主病原体防御的理想选择。在这份手稿中, 我们描述了一个方案, 培养人类肠内化合物后, 从患者的肠道切除分离。隐孢子细胞在培养基中培养, 培养基中含有生长因子, 鼓励分化为人体肠道上皮所固有的各种细胞类型。这些细胞生长在一种合成的胶原蛋白混合物中, 作为支架, 模仿细胞外基底膜。因此, 肠体发育到顶端-基外侧极性。在培养基中联合使用脂多糖 (LPS) 会引起肠内的炎症反应, 导致组织学、遗传和蛋白质表达的改变, 类似于人类 NEC 中的变化。使用人体组织的 NEC 实验模型可以为人体试验前的药物和治疗测试提供更准确的平台, 因为我们努力确定这种疾病的治愈方法。

电镀后, 新鲜隔离的肠道墓穴立即显示为细长的棒。在数小时内, 肠体将出现圆形外观 (图 1a)。在接下来的几天里, 肠体将开始形成球体, 如图 1b 所示。发芽应发生在5-10 之间 (图 1c), 肠体收集应在该时间发生。
生长中的肠?...

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A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

肠类正在成为人类疾病研究的新模式。该协议描述了如何模拟人坏死性小肠结肠炎的肠素模型使用脂多糖 (LPS) 治疗从新生儿组织产生的肠内化合物。收集的肠素显示炎症变化类似于那些在人类坏死性小肠结肠炎。

一种新的坏死性肠结肠炎人上皮肠素模型

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

肠体是从肠道上皮细胞中提取的三维器官。它们是研究复杂生理相互作用、细胞信号和宿主病原体防御的的理想之选。我们的协议描述了在接受肠切除的患者中隔离肠道干细胞后如何培养人肠。在我们的培养媒体中，合用利多糖会导致肠内炎症反应，导致组织学、遗传和蛋白质表达改变，类似于人类坏死性肠结肠炎中见的。鉴于对坏死性肠结肠炎和潜在治疗剂的研究在人类主体中，特别是儿童中具有伦理挑战性，利用这种利用人类新生儿组织坏死性肠结肠炎的新颖、生物相关肠体模型是非常可取的。该技术的主要优点是，肠道能够重述人类肠道上皮的多种细胞类型，并能够克服动物模型和基于细胞的系统所承认的局限性。帮助演示手术的将是外科住院病人克里斯蒂·邦帕内和实验室技术员袁嘉莉。在手术套件中采集时，将人体小肠道组织样本放在冷的DPBS中。在冰冷的 DPBS 中清洗标本，直到没有血迹和粪便。将试样存放在 RPMI 1640 介质中，温度为 4 摄氏度，直到准备好进行加密隔离。准备继续操作时，再次检查标本是否远离粪便和血迹。使用精致的解剖剪刀去除多余的脂肪或手术夹和订书针。对样品进行重量，并瞄准大约 0.75 至 2.5 克的片断。接下来，将组织切成0.5厘米的碎片，并把它们放在一个管子里，里面装着30毫升的溷合缓冲液。在4摄氏度下以低速摇晃15分钟。然后，通过100微米细胞滤株过滤组织，并丢弃流经。将过滤的组织添加到含有30毫升溷合缓冲液二号管中。在4摄氏度下以低速摇晃15分钟。通过 100 微米过滤器过滤组织，然后丢弃流经。在此之后，在冰上解冻500微升的地下室膜基质供以后使用。在50毫升锥形管中加入10毫升冷DMEM组织，用手大力摇动10秒。通过 100 微米细胞滤株过滤此悬浮液，然后收集流经。把管子放在冰上在单独的 50 毫升锥形管中再加入 10 毫升冷 DMEM 中的一些组织，用手大力摇动 10 秒钟。通过 100 微米细胞滤株过滤此悬浮液，然后收集流经。重复此过程两次，直到有四个锥形管包含流通过标记一个到四个。然后，通过100微米电池滤株过滤1号管中的溶液，将流量转移到15毫升锥形管中，也标有1号。对管二到四重复此过程。将15毫升管在200倍G和4摄氏度下离心15分钟。在层流罩中，从每个管中拆下上流液并丢弃。避免破坏颗粒上方的组织云，即使这意味着留下一些上一液。在每个管中，移液器上下缓慢地将颗粒与剩余的上流液混合。将混合物从每个管转移到一个两毫升锥形管中，在200倍G和4摄氏度下离心20分钟。在此之后，去除上经剂，并在预解冻的地下膜基质的500微升中重新暂停颗粒。使用冰镇移液器尖端将 50 微升的悬架应用到 24 井板的井中心。此示例应显示为圆顶形状。重复此应用过程九次，以填充 10 个总井。将 24 个井板转移到 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中 30 分钟，以便进行聚合。然后，在每一个井中加入500微升的人类微糖介质。在相同条件下继续孵育，确保每两天更换一次该介质。首先，在第 0 天将 5 微升的 LPS 添加到 5 微升的人类微升介质中，每毫升浓度为 5 毫克。继续在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育，并每两天更换一次补充的介质，直到收集。要准备石蜡嵌入，首先轻轻去除介质，加入一毫升PBS，并轻轻地上下移液器溶解地下室膜基质，同时小心不要将肠子拉丝。以低于 300 倍 G 的速度离心，5 分钟进行颗粒化，然后取出 PBS。加入4%的甲醛，将管子放在一边一小时，在室温下固定。以低于 300 倍 G 的速度离心，5 分钟进行颗粒化，然后去除半成醛。用一毫升 PBS 轻轻清洗，以低于 300 倍 G 的速度离心，五分钟。然后删除 PBS。使用 PBS 重复此洗涤过程一次。将所需数量的组织加工凝胶放入锥形管中，在65摄氏度的干浴培养箱中加热3至10分钟，直到其变成液体。在此之后，将熔化的组织加工凝胶加入颗粒中，轻轻混合。将一个小克隆环放入盖玻片中。将组织加工凝胶和肠状混合物移入安装在盖玻片上的克隆环中。让组织加工凝胶和肠状混合物在四摄氏度下凝固一小时。然后，将克隆环与凝固混合物一起淹没到70%乙醇中，为石蜡嵌入做准备。电镀后，刚隔离的肠道墓穴立即显示为拉长棒。在几个小时内，输入体将采取圆形的外观。在接下来的几天里，这些球体将开始形成球体。萌芽应发生在 5 到 10 天之间，即当输入收集应发生。生长的输入体也表现出极性，包含集中的流明、一个点状边框和一个罗勒边域。肠子也显示结构完整性，以健壮的细胞骨架表示。经过几天的培养，LBS治疗的肠菌体经历更多的凋亡，具有低于对照组的产量。如NEC的人类NEC模型中显示的，与对控相比，在LPS治疗的肠状体中，像受体4一样收费的表达增加。还可以利用成熟的 qRT-PCR 和西方印迹技术进行基因表达和蛋白质分离，为RNA和蛋白质提取收集肠素。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收

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科研

免疫与感染

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

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Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

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Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

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A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

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The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...