Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det nationale institut sundhed Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdom Grant (K08DK106450) og Jay Grosfeld Award fra den amerikanske Pediatric kirurgisk forening til C.J.H.

Institutionelle review board godkendelse blev opnået (IRB #2013-15152) til samling af vævsprøver fra patienter i tarm resektion ved Ann og Robert H. Lurie children's Hospital i Chicago, Chicago, IL. Alle protokoller blev udført i overensstemmelse med institutionelle og nationale retningslinjer og forordninger for menneskelig velfærd. Skriftlig informeret forældresamtykke var påkrævet og fremstillet før prøvetagning i alle tilfælde.
1. reagens
<ol><li>Forberede hele væv samling dy...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li><li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa.">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+(NEC).">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li><li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis.">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids:+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation.">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).</li><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering.">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

Denne roman ex vivo menneskelige tarm enteroid model fungerer som en nyttig metode til undersøgelse af intestinal barriere dysfunktion i nekrotiserende enterocolitis (NEC). Enteroid forarbejdningsmetoderne præsenteres her var tilpasset fra den tidligere arbejde af Drs. Misty Good, Michael Helmrath og Jason Wertheim10,11,12.
Detaljer omkring hele væv samling og timing crypt isolationsniveauet er vig...

Menneskets enteroids er en ex vivo 3-dimensionelle kultur system genereret fra stamceller isoleret fra tarm Krypter af menneskelige intestinal vævsprøver. Denne banebrydende model var banebrydende ved Hans Clevers et al. i 2007 efter opdagelsen af Lgr5 + stamceller på Krypter af tyndtarmen i mus1. Deres arbejde lagde fundamentet for etablering af en ex vivo intestinale epitel kultur af flere celletyper, der kunne være passaged uden betydelige genetiske eller fysiologiske ændringer2. Siden denne opdagelse, er enteroids blevet brugt som en ny model til at studere normal mave fysiologi og Patofysiologi af tarm sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom, vært-patogen interaktioner og regenerativ medicin2.
Brugen af enteroids som en ex vivo model for studiet af intestinal Patofysiologi har flere fordele sammenlignet med alternative teknikker. For de sidste mange årtier, blevet dyremodeller og udødeliggjort tarm kræft-afledte cellelinjer brugt til at studere intestinal fysiologi3,4,5. Encellede kulturer repræsenterer ikke forskellige celletyper findes i normal tarm epitel, dermed mangler celle til celle cross-talk og segment-specificitet i protein udtryk, signalering og patogen-induceret sygdom6. Stamceller i enteroids differentiere i store epitelcelle typer såsom enterocytes, Paneth cellerne, goblet celler, enteroendocrine celler og mere3. De udviser polaritet, udføre epithelial transport funktioner og mulighed for intestinal segment specificitet6. Da enteroids kan sammenfatte de flere celletyper af menneskelige intestinale epitel, er de i stand til at overvinde denne anerkendte begrænsning af kræft celle-baserede systemer. Over tid, derivater af cellelinjer er subcloned og udvikle sig til at udvise større mangfoldighed i protein udtryk og lokalisering3. Tværtimod, kan enteroids være passaged uden betydelige genetiske eller fysiologiske ændringer2. Selv om adskillige dyremodeller for NEC findes, kan svar til skade og terapeutiske indgreb være meget varierende mellem arter. Som følge af disse begrænsninger, therapeutics udledes fra dyremodeller mislykkes 90% af tiden når testet i menneskelige forsøg på grund af forskelle i toksicitet eller virkning3. Enteroids tjene som lovende prækliniske modeller, der kan afhjælpe disse mangler, hvilket fører til en bedre forståelse af komplekse intestinal Patofysiologi og derfor, mere vellykket og omkostningseffektivt terapeutiske nyskabelser. Der er også de seneste beviser på, at alder af væv, der en enteroid genereres fra forbliver biologisk vigtige7. Dette er en specielt vigtig detalje for vores model da enteroids er genereret fra neonatal væv, dermed bevare fysiologisk relevans for patienter med NEC.
Nytte af enteroids som modeller for humane sygdomme fortsætter med at udvide, i håb om at finde kur alvorlige og udbredte betingelser. Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en ødelæggende tarm sygdom hos nyfødte karakteriseret ved tarm nekrose og ofte fører til perforering af tarmvæggen, sepsis og død8. På grund af den komplekse og multifaktoriel Patofysiologi af NEC, har den nøjagtige mekanisme af sygdommen ikke endnu blevet fuldt belyst; imidlertid har øget intestinal permeabilitet klart været impliceret i sygdom proces8. Da studiet af NEC og potentielle terapeutiske agenter er etisk udfordrende på mennesker, især børn, er det ønskeligt at udnytte en biologisk relevante enteroid model af NEC ved hjælp af menneskelige neonatal væv. Hidtil har enteroids en begrænset rolle i studiet af NEC. Denne protokol beskriver brugen af enteroids stammer fra menneskelige intestinal vævsprøver som en roman ex vivo model for studiet af nekrotiserende enterocolitis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

Nekrotiserende enterocolitis er (NEC) en ødelæggende sygdom hos nyfødte spædbørn. Det er kendetegnet ved flere patofysiologiske forandringer i den menneskelige intestinale epitel, fører til øget intestinal permeabilitet, nedsat tilbagelevering og øget celledød. Selvom der er adskillige dyremodeller for NEC, kan svar til skade og terapeutiske indgreb være meget varierende mellem arter. Derudover er det etisk udfordrende at studere sygdom Patofysiologi eller roman terapeutiske agenter direkte i forsøgspersoner, især børn. Derfor er det ønskeligt at udvikle en ny model af NEC ved hjælp af menneskelige væv. Enteroids er 3-dimensionel organoids stammer fra tarm epitel celler. De er ideelle til studiet af kompleks fysiologisk interaktioner, celle signalering og vært-patogen forsvar. I dette manuskript beskrive vi en protokol at kulturer menneskelige enteroids efter isolere intestinal stamceller fra patienter i tarm resektion. Krypten celler er kulturperler i medier indeholdende vækstfaktorer, der fremmer differentiering af de forskellige celle typer indfødte af den menneskelige intestinale epitel. Disse celler dyrkes i en syntetisk, kollagen blanding af proteiner, der tjener som et stillads, efterligne den ekstra-cellulære basalmembranen. Som følge heraf udvikle enteroids apikale basolateral polaritet. Fælles administration af LPS (LPS) i medier forårsager en inflammatorisk reaktion i enteroids, fører til Histologisk, genetiske og protein udtryk ændringer ligner dem set i menneskelige NEC. En eksperimentel model af NEC ved hjælp af menneskelige væv kan give en mere nøjagtig platform for narkotika og behandling prøveudtagning før forsøg på mennesker, som vi stræber efter at finde en kur mod denne sygdom.

Umiddelbart efter plating vises frisk isolerede intestinal Krypter som aflange stænger. Inden for timer, vil enteroid tage på en runde udseende (figur 1en). Over de næste mange dage, vil enteroids begynde formning kugler, som det ses i figur 1b. Spirende bør opstå mellem 5-10 dage (figur 1c) og enteroid samling skulle opstå på tidspunktet....

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Enteroids dukker op som en roman model i studiet af menneskers sygdom. Protokollen beskriver hvordan man simulere en enteroid model af menneskelige nekrotiserende enterocolitis ved hjælp af LPS (LPS) behandling af enteroids genereret fra neonatal væv. Indsamlede enteroids vise inflammatoriske forandringer beslægtet med dem, der ses i menneskelige nekrotiserende enterocolitis.

En roman menneskelige epitelial Enteroid Model af nekrotiserende Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroider er tredimensionelle organoider afledt af tarm epitelceller. De er ideelle til undersøgelse af komplekse fysiologiske interaktioner, celle signalering, og vært patogen forsvar. Vores protokol beskriver, hvordan man kultur menneskelige enteroids efter isolering intestinale stamceller fra patienter, der gennemgår tarm resektion.Co-administration af lipopolysaccharid i vores kultur medier forårsager en inflammatorisk reaktion i enteroids fører til histologisk, genetiske, og protein udtryk ændringer svarende til dem, der ses i human nekrotiserende enterocolitis. I betragtning af, at undersøgelsen af nekrotiserende enterocolitis og potentielle terapeutiske midler er etisk udfordrende hos mennesker, især børn, er det meget ønskeligt at udnytte denne roman, biologisk relevante enteroid model af nekrotiserende enterocolitis ved hjælp af humant neonatal væv. Den største fordel ved denne teknik er, at enteroider er i stand til at opsummere de mange celler typer af humane intestinal epitel og er i stand til at overvinde de anerkendte begrænsninger af dyremodeller og cellebaserede systemer.Hjælpe med at demonstrere proceduren vil være Christie Buonpane, en kirurgisk hjemmehørende, og Carrie Yuan, en laborant fra vores laboratorium. På tidspunktet for indsamling i den operative suite, placere den menneskelige lille tarm væv prøve i koldt DPBS. Vask prøven i den kolde DPBS, indtil det er fri for blod og afføring.Prøven opbevares i RPMI 1640-mediet ved fire grader Celsius, indtil den er klar til kryptisolation. Når du er klar til at fortsætte, skal du igen kontrollere, at prøven er fri for afføring og blod. Brug delikat dissekere saks fjerne overskydende fedt eller kirurgiske klip og hæfteklammer.Prøven vægt, og målet for et stykke, der er ca. 0,75 til 2,5 gram. Dernæst skæres vævet i 0,5 centimeter stykker og læg dem i et rør, der indeholder 30 milliliter chelaterende buffer nummer et. Ryst ved lav hastighed i 15 minutter ved fire grader Celsius.Derefter filtreres vævet gennem en 100 mikrometercelles si, og kassér strømmen igennem. Det filtrerede væv tilsættes et rør, der indeholder 30 milliliter chelaterende buffer nummer to. Ryst ved lav hastighed i 15 minutter ved fire grader Celsius.Væv gennem et 100 mikrometerfilter filtreres, og strømmen kasseres. Herefter skal 500 mikroliter af kældermembranmatrix tøs op på is til senere brug. Tilsæt noget væv til 10 milliliter kold DMEM i et 50 milliliter konisk rør og ryst kraftigt i hånden i 10 sekunder.Denne suspension gennem en 100 mikrometercelles si og opsaml strømmen igennem. Hold dette rør på is. Tilsæt noget væv til yderligere 10 milliliter kold DMEM i et separat 50 milliliter konisk rør og ryst kraftigt i hånden i 10 sekunder.Denne suspension gennem en 100 mikrometercelles si og opsaml strømmen igennem. Gentag processen yderligere to gange, indtil der er fire koniske rør, der indeholder flow gennem mærket en til fire. Derefter filtreres opløsningen i rør nummer et gennem en 100 mikrometercellestuder, og flowet overføres til et 15 milliliter konisk rør, der også er mærket nummer et.Gentag denne proces for rør to til fire. Centrifuge de 15 milliliter rør ved 200 gange G og ved fire grader Celsius i 15 minutter. Fjern supernatanten fra hvert rør i laminarflowet og kassér den.Undgå at forstyrre skyen af væv umiddelbart over pellet, selv om det betyder at efterlade nogle supernatant bag. I hvert rør, pipette op og ned langsomt at blande pellet med sidesten supernatant. Blandingen overføres fra hvert rør til et enkelt to milliliter konisk rør og centrifuge ved 200 gange G og ved fire grader Celsius i 20 minutter.Derefter fjernes supernatanten og opsvar pellet i 500 mikroliter af præ-optøet kælder membran matrix. Brug en kølet pipettespids til at anvende 50 mikroliter af denne suspension til midten af en brønd i en 24 brøndplade. Denne prøve skal vises kuppelformet.Gentag denne ansøgningsproces ni gange for at fylde 10 i alt brønde. Overfør 24 brøndpladen i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius i 30 minutter for at tillade polymerisering. Derefter tilføjes 500 mikroliter af menneskelige minigut medier komplet til hver brønd.Fortsæt inkubering under de samme betingelser, og sørg for at erstatte dette medie hver anden dag. Først tilsættes 10 mikroliter LPS i en koncentration på fem milligram pr. milliliter til de 500 mikroliter af humane minigutmedier, der er komplette i hver brønd af pladen på dag nul. Fortsæt inkubering ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og erstatte de supplerede medier hver anden dag, indtil indsamling.For at forberede paraffin indlejring, først forsigtigt fjerne medierne, tilsæt en milliliter PBS, og forsigtigt pipette op og ned for at opløse kælderen membran matrix og samtidig passe på ikke at lyse enteroids. Centrifuge med en hastighed på mindre end 300 gange G i fem minutter for at pelletere og derefter fjerne PBS. Tilsæt 4% paraformaldehyd og sæt røret til side i en time for at fastsætte ved stuetemperatur.Centrifuge med en hastighed mindre end 300 gange G i fem minutter til pellet og derefter fjerne paraformaldehyd. Vask forsigtigt med en milliliter PBS og centrifuge med en hastighed på mindre end 300 gange G i fem minutter. Fjern derefter PBS.Gentag denne vaskeproces med PBS én gang. Placer den ønskede mængde af vævsbehandling gel i et konisk rør og varm det i et tørt bad inkubator ved 65 grader Celsius i tre til 10 minutter, indtil det er flydende. Efter dette, tilsæt smeltet væv forarbejdning gel til pellet og bland forsigtigt.Placer en lille kloning ring i en coverslip. Pipette vævsbehandling gel og enteroid blandingen i kloning ring, der er monteret på en coverslip. Lad vævsbehandlinggel og enteroidblandingen størkne ved fire grader Celsius i en time.Derefter nedsænkes kloning ringen med størknede blandingen i 70% ethanol for at forberede paraffin indlejring. Umiddelbart efter plating, frisk isolerende tarm krypter fremstår som aflange stænger. Inden for få timer enteroids vil tage på en rund udseende.I løbet af de næste par dage enteroids vil begynde at danne kugler. Spirende bør forekomme mellem fem til 10 dage, hvilket er, når enteroid indsamling bør forekomme. De voksende enteroider udviser også polaritet, indeholdende en centraliseret lumen, en apikale kant og et basilateraldomæne.Enteroider viser også strukturel integritet repræsenteret ved en robust actin cytoskeleton. Efter flere dage i kultur, lbs behandlede enteroids opleve mere apoptose og har et lavere udbytte end kontrolgruppen. Som det ses i humane NEC i murine modeller af NEC, en øget udtryk for vejafgift som receptor fire findes i LPS behandlet enteroider i forhold til kontrol.Enteroiderne kan også indsamles til RNA og proteinekstraktion ved hjælp af veletablerede qRT-PCR og vestlige blotting teknikker genekspression og protein isolation kan udføres.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model for at studere samspillet mellem humant fuldblod og Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Udvikling og Identifikation af en roman underpopulation af human neutrofil-afledte Giant fagocytter<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - og menneske-afledte primære gastrisk epitelial éncellelag kultur for studiet af regenerering

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Ved hjælp af human induceret pluripotente stamceller-afledte tarm Organoider til at studere og ændre epitelial cellebeskyttelse mod salmonella og andre patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Induceret differentiering af M celle-lignende celler i humane stamcelle-afledte ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

En ny ex vivo ovine hudsårsmodel med høj kapacitet til test af nye antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...