Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान संस्थान द्वारा मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारी अनुदान (K08DK106450) और जे Grosfeld पुरस्कार अमेरिकी बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन से C.J.H. करने के लिए समर्थन किया गया था

संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी एन और शिकागो, शिकागो, आईएल के रॉबर्ट एच Lurie बच्चों के अस्पताल में आंत्र लकीर के दौर से गुजर रोगियों से ऊतक के नमूने के संग्रह के लिए (IRB #2013-१५१५२) प्राप्त किया गया था । सभी प्?...

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	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

इस उपंयास पूर्व vivo मानव आंत्र एंड्रॉइड मॉडल परिगलन आंत्रशोथ (NEC) में आंत्र बाधा रोग के अध्ययन के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में कार्य करता है । यहां प्रस्तुत एंटरॉइड प्रोसेसिंग मेथड्स डीआरएस के पिछले काम ?...

मानव enteroids एक पूर्व vivo 3 आयामी संस्कृति मानव आंत्र ऊतक के नमूनों के आंत्र तहखाने से अलग स्टेम कोशिकाओं से उत्पंन प्रणाली हैं । इस जमीन को तोड़ने मॉडल हंस Clevers द्वारा बीड़ा उठाया था एट अल २००७ में Lgr5 की खोज के बाद +1चूहों में छोटी आंत के तहखाने में स्टेम सेल । उनके काम एक पूर्व vivo कई सेल प्रकार है कि महत्वपूर्ण आनुवंशिक या शारीरिक परिवर्तन2के बिना passaged हो सकता है की आंतों उपकला संस्कृति की स्थापना के लिए नींव रखी । इस खोज के बाद से, enteroids सामान्य पाचन शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और इस तरह के भड़काऊ आंत्र रोग, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और पुनर्योजी दवा के रूप में आंत्र रोगों के pathophysiology2.
आंत्र पैथोफाइसियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में एंटरॉइड का उपयोग वैकल्पिक तकनीकों पर कई फायदे हैं । पिछले कई दशकों के लिए, पशु मॉडल और अमर आंतों के कैंसर-व्युत्पन्न कोशिका लाइनों आंत्र शरीर विज्ञान3,4,5का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एकल कोशिका संस्कृतियों सामांय आंत्र उपकला में मौजूद कोशिका प्रकार की विविधता का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, जिससे सेल के पार करने के लिए सेल की कमी-टॉक और सेगमेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति में विशिष्टता, संकेतन, और रोगज़नक़ रोग प्रेरित6। आंत्रशोथ में स्टेम सेल एंटेरोसाइट्स, पैनेथ कोशिकाओं, गोबलेट कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं और अधिक3के रूप में प्रमुख उपकला कोशिका प्रकार में अंतर । वे ध्रुवता प्रदर्शन, उपकला परिवहन कार्य बाहर ले, और आंतों खंड विशिष्टता6के लिए अनुमति देते हैं । के बाद से enteroids मानव आंत्र उपकला के कई कोशिका प्रकार दोहराऊंगा कर सकते हैं, वे कैंसर सेल आधारित प्रणाली की इस मांयता प्राप्त सीमा पर काबू पाने में सक्षम हैं । समय के साथ, सेल लाइनों के डेरिवेटिव subcloned है और प्रोटीन अभिव्यक्ति और3स्थानीयकरण में अधिक से अधिक विविधता को प्रदर्शित करने के लिए विकसित । इसके विपरीत, enteroids महत्वपूर्ण आनुवंशिक या शारीरिक परिवर्तन2के बिना passaged किया जा सकता है । हालांकि एनईसी के लिए कई पशु मॉडल मौजूद हैं, चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है । इन सीमाओं का एक परिणाम के रूप में, पशु मॉडल से व्युत्पन्न चिकित्सा विज्ञान समय की ९०% असफल जब विषाक्तता या प्रभावकारिता में अंतर के कारण मानव परीक्षण में परीक्षण3. Enteroids पूर्व नैदानिक मॉडल है कि इन कमियों को दूर कर सकते है के रूप में सेवा, जटिल आंत्र pathophysiology की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी है और इसलिए, और अधिक सफल और लागत प्रभावी चिकित्सकीय नवाचारों । वहां भी हाल ही में सबूत है कि ऊतक की उंर है कि एक एंटिरॉइड से उत्पंन होता है biologically महत्वपूर्ण7। यह हमारे मॉडल के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विस्तार है क्योंकि enteroids नवजात ऊतक से उत्पन्न कर रहे हैं, जिससे NEC के साथ रोगियों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बनाए रखने.
मानव बीमारियों के मॉडल के रूप में enteroids की उपयोगिता के लिए गंभीर और व्यापक परिस्थितियों के इलाज खोजने की उंमीद में, विस्तार जारी है । परिगलन आंत्रशोथ (एनईसी) आंत्र परिगलन द्वारा विशेषता नवजात शिशुओं की एक विनाशकारी आंत्र रोग है और अक्सर आंत्र दीवार, गलाघोंटू के वेध की ओर जाता है, और8मौत । एनईसी के जटिल और मल्टीफैक्टोरियल पैथोफाइशियोलॉजी के कारण, रोग की सही व्यवस्था को अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है; हालांकि, वृद्धि हुई आंतों पारगम्यता स्पष्ट रूप से रोग प्रक्रिया में फंसाया गया है8. यह देखते हुए कि एनईसी और संभावित चिकित्सीय एजेंटों के अध्ययन नैतिकता की दृष्टि से मानव विषयों में चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से बच्चों, यह उच्च एनईसी के एक जैविक रूप से प्रासंगिक एंटिरॉइड मॉडल का उपयोग मानव नवजात ऊतक का प्रयोग वांछनीय है । इस प्रकार अब तक, एनईसी के अध्ययन में एंटेरोइड की एक सीमित भूमिका है । यह प्रोटोकॉल एक उपंयास पूर्व vivo मॉडल के रूप में मानव आंत्र ऊतक के नमूनों से प्राप्त enteroids के उपयोग के लिए परिगलन enterocolitis के अध्ययन के लिए वर्णन करता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

नेक्रोटाइज़िंग एंटोरोकोलाइटिस (NEC) नवजात शिशुओं की एक विनाशकारी बीमारी है । यह मानव आंत्र उपकला में कई pathophysiologic परिवर्तन की विशेषता है, वृद्धि हुई आंतों पारगम्यता के लिए अग्रणी, बिगड़ा पुनर्शोधन, और वृद्धि की कोशिका मौत. हालांकि एनईसी के कई पशु मॉडल हैं, चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है । इसके अलावा, यह नैतिकता की दृष्टि से मानव विषयों, विशेष रूप से बच्चों में रोग पैथोफाइशियोलॉजी या उपंयास चिकित्सकीय एजेंटों का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, यह उच्च एनईसी के एक उपंयास मॉडल मानव ऊतक का उपयोग कर विकसित वांछनीय है । आंत्र उपकला कोशिकाओं से व्युत्पन्न 3-आयामी ऑर्गेनाइड्स हैं । वे जटिल शारीरिक बातचीत, सेल सिग्नलिंग, और मेजबान रोगज़नक़ रक्षा के अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं । इस पांडुलिपि में हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि संस्कृतियों आंत्र लकीर के दौर से गुजर रोगियों से आंत्र स्टेम सेल अलग करने के बाद मानव enteroids । तहखाना कोशिकाओं के विकास कारकों है कि मानव आंत्र उपकला के विभिन्न प्रकार के कोशिका के मूल निवासी में भेदभाव को प्रोत्साहित युक्त मीडिया में सभ्य हैं । इन कोशिकाओं को एक कृत्रिम, प्रोटीन है कि एक पाड़ के रूप में सेवा, अतिरिक्त सेलुलर तहखाने झिल्ली नकल उतारना में बड़े हो रहे हैं । एक परिणाम के रूप में, एंटेरोइड का विकास-basolateral ध्रुवता । मीडिया में लिपोपोलिसैकेराइड (LPS) के सह प्रशासन enteroids में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बनता है, histologic, आनुवंशिक करने के लिए अग्रणी, और प्रोटीन अभिव्यक्ति मानव परिषद में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह परिवर्तन । एनईसी के एक प्रायोगिक मॉडल मानव ऊतक का उपयोग कर दवा और उपचार मानव परीक्षण से पहले परीक्षण के लिए एक अधिक सटीक मंच प्रदान कर सकते हैं, के रूप में हम इस बीमारी के लिए एक इलाज की पहचान करने का प्रयास करते हैं ।

तुरंत चढ़ाना के बाद, ताजा अलग आंत्र तहखाने लम्बी छड़ के रूप में दिखाई देते हैं । घंटे के भीतर, एंड्रोइड एक गोल दिखावट पर ले जाएगा (चित्रा 1ए) । अगले कई दिनों में, एंटार्ड्स के ?...

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A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

एंट्रल मानव रोग के अध्ययन में एक उपंयास मॉडल के रूप में उभर रहे हैं । प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि नवजात ऊतक से उत्पन्न आंत्रशोथ के लिपोपोलिसैकेराइड (LPS) के उपचार का उपयोग कर मानव नेक्रोटाइज़िंग एन्टीरोकोलाइटिस के एक एंटिरॉइड मॉडल का अनुकरण कैसे करें । एकत्र आंत्रशोथ मानव परिगलन enterocolitis में देखा उन के सदृश भड़काऊ परिवर्तन का प्रदर्शन ।

नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ के एक उपंयास मानव उपकला एंड्रोइड मॉडल

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

एंटरॉइड आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं से प्राप्त तीन आयामी ऑर्गेनॉइड होते हैं। वे जटिल शारीरिक बातचीत, सेल सिग्नलिंग और मेजबान रोगजनक रक्षा के अध्ययन के लिए आदर्श हैं। हमारा प्रोटोकॉल बताता है कि आंत्र रिसेक्शन से गुजर रहे रोगियों से आंतों के स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के बाद मानव आंत्रों को कैसे संस्कृति में शामिल किया जाए।हमारी संस्कृति मीडिया में लिपोपोलिसाकराइड का सह-प्रशासन एंट्रोइड्स में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बनता है जिससे मानव नेक्रोटाइजिंग एंटोकोलाइटिस में देखे गए लोगों के समान हिस्टोलॉजिक, आनुवंशिक और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन होते हैं। यह देखते हुए कि नेक्रोटाइजिंग एंटोकोलाइटिस और संभावित चिकित्सीय एजेंटों का अध्ययन मानव विषयों, विशेष रूप से बच्चों में नैतिकता की दृष्टि से चुनौतीपूर्ण है, मानव नवजात ऊतक का उपयोग करके नेक्रोटाइजिंग आंत्रशोथ के इस उपन्यास, जैविक रूप से प्रासंगिक आंत्रकृत मॉडल का उपयोग करना अत्यधिक वांछनीय है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि एंटरॉइड मानव आंतों के एपिथेलियम के कई कोशिकाओं प्रकारों को फिर से काटना करने में सक्षम हैं और पशु मॉडल और सेल आधारित प्रणालियों की मान्यता प्राप्त सीमाओं को दूर करने में सक्षम हैं।प्रक्रिया को प्रदर्शित करने में मदद क्रिस्टी Buonpane, एक शल्य चिकित्सा निवासी, और कैरी युआन, हमारी प्रयोगशाला से एक प्रयोगशाला तकनीशियन होगा । ऑपरेटिव सुइट में संग्रह के समय, मानव छोटे आंतों के ऊतकों के नमूने को ठंडे डीपीबीएस में रखें। ठंड डीपीबीएस में नमूना तब तक धोएं जब तक कि यह रक्त और मल से स्पष्ट न हो जाए।तहखाना अलगाव के लिए तैयार होने तक चार डिग्री सेल्सियस पर आरपीएमआई 1640 माध्यम में नमूना स्टोर करें। जब आगे बढ़ने के लिए तैयार हो, तो फिर से जांच करें कि नमूना मल और रक्त से स्पष्ट है। नाजुक विच्छेदन कैंची का उपयोग किसी भी अतिरिक्त वसा या सर्जिकल क्लिप और स्टेपल को दूर।नमूना वजन और लगभग 0.75 से 2.5 ग्राम है कि एक टुकड़ा के लिए लक्ष्य। इसके बाद, ऊतक को 0.5 सेंटीमीटर टुकड़ों में काट लें और उन्हें एक ट्यूब में रखें जिसमें 30 मिलीलीटर बफर नंबर एक हो। चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक कम गति से हिलाएं।फिर, एक 100 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से ऊतक को फ़िल्टर करें और प्रवाह को त्याग दें। फ़िल्टर किए गए ऊतकों को एक ट्यूब में जोड़ें जिसमें 30 मिलीलीटर बफर नंबर दो होता है। चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक कम गति से हिलाएं।ऊतक को 100 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और प्रवाह को त्याग दें। इसके बाद, बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 500 माइक्रोलीटर गल। एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में ठंड DMEM के 10 मिलीलीटर के लिए कुछ ऊतक जोड़ें और 10 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती से हिला।इस निलंबन को 100 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें और प्रवाह को इकट्ठा करें। इस ट्यूब को बर्फ पर रखें। एक अलग 50 मिलीलीटर शंकु नली में ठंडे डीएमईएम के एक और 10 मिलीलीटर के लिए कुछ ऊतक जोड़ें और 10 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती से हिलाएं।इस निलंबन को 100 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें और प्रवाह को इकट्ठा करें। इस प्रक्रिया को दो अतिरिक्त बार दोहराएं जब तक कि चार के माध्यम से लेबल किए गए एक के माध्यम से प्रवाह युक्त चार शंकुकंदन हैं। फिर, एक 100 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से ट्यूब नंबर एक में समाधान फिल्टर और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में भी नंबर एक लेबल में के माध्यम से प्रवाह हस्तांतरण।चार के माध्यम से दो ट्यूबों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। 15 मिलीलीटर ट्यूबों को २०० बार जी पर और 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें । लैमिनार फ्लो हुड में, प्रत्येक ट्यूब से सुपरनैंट निकालें और इसे त्याग दें।गोली के तुरंत ऊपर ऊतक के बादल को बाधित करने से बचें, भले ही इसका मतलब है कि कुछ सुपरनटेंट को पीछे छोड़ना। प्रत्येक ट्यूब में, बचे हुए सुपरनेट के साथ गोली को मिलाने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्रत्येक ट्यूब से मिश्रण को एक दो मिलीलीटर शंकु नली और अपकेंद्रित्र में 200 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।इसके बाद, सुपरनैंट को हटा दें और पूर्व-गल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 500 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। एक ठंडा पिपेट टिप का उपयोग करें एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से केंद्र के लिए इस निलंबन के ५० माइक्रोलीटर लागू होते हैं । यह नमूना गुंबद के आकार का दिखाई देना चाहिए।10 कुल कुओं को भरने के लिए इस आवेदन प्रक्रिया को नौ बार दोहराएं। बहुलीकरण की अनुमति देने के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। फिर, प्रत्येक कुएं में मानव मिनीगॉट मीडिया के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक ही शर्तों के तहत इनक्यूबेटिंग जारी रखें, हर दो दिन में इस मीडिया को बदलने के लिए सुनिश्चित कर रही है । सबसे पहले, मानव मिनीगट मीडिया के 500 माइक्रोलीटर को शून्य पर प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूरा करने के लिए पांच मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर एलपीएस के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग जारी रखें और संग्रह तक हर दो दिनों में पूरक मीडिया की जगह ।पैराफिन एम्बेडिंग के लिए तैयार करने के लिए, पहले धीरे से मीडिया को हटा दें, पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को भंग करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, जबकि सावधान रहें कि एंटरॉइड को lyse न करें। पांच मिनट तक 300 बार जी से कम गति से सेंट्रलाइज करें और फिर पीबीएस को हटा दें। 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड जोड़ें और कमरे के तापमान पर ठीक करने के लिए ट्यूब को एक घंटे के लिए अलग सेट करें।पांच मिनट तक 300 बार जी से कम गति से सेंट्रलाइज करने के लिए गोली और फिर पैराफॉर्मल्डिहाइड को हटा दें। पांच मिनट के लिए ३०० बार जी से कम गति से पीबीएस और अपकेंद्रित्र के एक मिलीलीटर के साथ धीरे से धोएं । इसके बाद पीबीएस निकालें।इस वॉश प्रोसेस को एक बार पीबीएस के साथ दोहराएं। ऊतक प्रसंस्करण जेल की वांछित मात्रा को शंकु नली में रखें और इसे तरल होने तक तीन से 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सूखे स्नान इनक्यूबेटर में गर्म करें। इसके बाद, पिघले हुए ऊतक प्रसंस्करण जेल को गोली में जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं।एक छोटी सी क्लोनिंग रिंग को कवरलिप में रखें। पिपेट ऊतक प्रसंस्करण जेल और एंटरॉइड मिश्रण क्लोनिंग रिंग में जो कवरस्लिप पर रखा जाता है। ऊतक प्रसंस्करण जेल और आंत्र मिश्रण को एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर जमना की अनुमति दें।फिर, पैराफिन एम्बेडिंग के लिए तैयार करने के लिए 70% इथेनॉल में ठोस मिश्रण के साथ क्लोनिंग रिंग को जलमग्न करें। चढ़ाना के तुरंत बाद, हौसले से अलग आंतों के तहखाने लम्बी छड़ के रूप में दिखाई देते हैं। कुछ ही घंटों के भीतर एंटरनोइड एक गोल उपस्थिति पर ले जाएगा।अगले कई दिनों में एंटरनोइड गोले बनाना शुरू कर देंगे। नवोदित पांच से 10 दिनों के बीच होना चाहिए, जो तब होता है जब आंत्र संग्रह होना चाहिए। बढ़ते आंत्रविज्ञान में ध्रुवीयता भी प्रदर्शित होती है, जिसमें एक केंद्रीकृत ल्यूमेन, एक एपिकल बॉर्डर और बेसिलेट्रल डोमेन होता है।एंटोइड्स एक मजबूत ऐक्टिन साइटोस्केलेटन द्वारा प्रतिनिधित्व संरचनात्मक अखंडता भी दिखाते हैं। संस्कृति में कई दिनों के बाद, एलबीएस इलाज आंत्रप्रेन्योर अधिक एपोप्टोसिस का अनुभव करते हैं और नियंत्रण समूह की तुलना में कम उपज होती है। जैसा कि एनईसी के मुरीन मॉडल में मानव एनईसी में देखा गया है, रिसेप्टर फोर जैसे टोल की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति नियंत्रण की तुलना में एलपीएस इलाज एंटोइड में पाई जाती है ।आंत्रप्रेन्योर्स को आरएनए और प्रोटीन एक्सट्रैक्ट के लिए भी इकट्ठा किया जा सकता है, जिसमें अच्छी तरह से स्थापित क्यूआरटी-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉटिंग तकनीक जीन एक्सप्रेशन और प्रोटीन आइसोलेशन का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

एक माउस के आवेदन Peyer पैच आंतों लूप परख ligated एम कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल तेज मूल्यांकन

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

एक<em&gt; इन विट्रो में</emमानव बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और ध्रुवीकरण की विविधता का अध्ययन करने के&gt; मॉडल

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

मानव थाइमस से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं का अलगाव

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

अलगाव, पहचान, और murine Thymic उपकला कोशिकाओं के शोधन

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

एक उपन्यास<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव पूरे रक्त और endothelium के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदर्श

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

विकास और मानव न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशालकाय phagocytes के एक उपन्यास उप-जनसंख्या की पहचान<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

माउस और मानव व्युत्पंन प्राथमिक गैस्ट्रिक उपकला Monolayer उत्थान के अध्ययन के लिए संस्कृति

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग आंतों ऑर्गेनॉइड व्युत्पंन का अध्ययन करने और साल्मोनेला और अंय रोगज़नक़ों के खिलाफ उपकला कोशिका संरक्षण को संशोधित

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न Ileal Enteroid Monolayers में एम सेल की तरह कोशिकाओं के प्रेरित भेदभाव

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

उभरते एंटीबायोटिक दवाओं के परीक्षण के लिए एक नया उच्च-थ्रूपुट एक्स विवो ओविन स्किन घाव मॉडल

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...