Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute for Health Institute Diabetes fordøyelseskanal og nyre sykdom Grant (K08DK106450) og Jay Grosfeld prisen fra American Pediatric kirurgiske Association til C.J.H.

Institusjonelle gjennomgang styret godkjenning ble innhentet (IRB #2013-15152) for samling av vevsprøver fra pasienter som gjennomgår tarmen reseksjon på Ann og Robert H. Lurie Children's Hospital i Chicago, Chicago, IL. Alle protokoller ble utført i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer og regler for menneskelig velferd. Skriftlig informert foreldresamtykke var nødvendig og innhentet før prøvetaking i alle tilfeller.
1. forberedelse av reagenser
<ol><li>Forberede ku...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li><li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa.">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+(NEC).">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li><li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis.">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids:+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation.">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).</li><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering.">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

Denne romanen ex vivo menneskelige intestinal enteroid modell fungerer som en nyttig metode for studier av intestinal barriere dysfunksjon i nekrotiserende enterokolitt (NEC). Enteroid behandlingsmetoder presenteres her var tilpasset fra tidligere arbeidet til Dr. Misty Good, Michael Helmrath og Jason Wertheim10,11,12.
Detaljene rundt hele vev samling og timing krypten isolasjon er avgjørende skritt ...

Menneskelig enteroids er en ex vivo 3-dimensjonale kultur-systemet fra stamceller isolert fra intestinal crypts av menneskelige tarmen. Denne banebrytende modellen ble utviklet av Hans Clevers et al. i 2007 etter oppdagelsen av Lgr5 + stamceller på krypten i tynntarmen i mus1. Deres arbeid la grunnlaget for å etablere en ex vivo intestinal epithelial kultur flere celletyper som kan bli passaged uten betydelige genetisk eller fysiologiske endringer2. Siden oppdagelsen har enteroids blitt brukt som en roman modell for å studere normale fordøyelseskanal fysiologi og patofysiologi av tarm sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom, vert-patogen interaksjoner og regenerativ medisin2.
Bruk av enteroids som en ex vivo modell for studiet av intestinal patofysiologi har flere fordeler sammenlignet med alternative teknikker. For de siste tiårene, har dyremodeller og udødeliggjort intestinal kreft-avledet cellelinjer blitt brukt til å studere intestinal fysiologi3,4,5. Encellede kulturer representerer ikke mangfoldet i celletyper tilstede i normal intestinal epitel, dermed mangler celle til celle cross-talk og segment-spesifisitet i protein uttrykk, signalisering og patogen-indusert sykdom6. Stamceller i enteroids skille ut store epithelial celletyper som enterocytes, Paneth celler, fangen celler, enteroendocrine celler og mer3. De viser polaritet, utføre epithelial transport funksjoner og tillate intestinal segmentet spesifisitet6. Siden enteroids kan recapitulate de flere celletyper av menneskelig intestinal epitel, er de stand til å overvinne denne anerkjent begrensningen av kreft celle-baserte systemer. Over tid, derivater av linjer er subcloned og utvikle seg til å exhibit større mangfold i protein uttrykk og lokalisering3. Tvert imot, kan enteroids være passaged uten betydelige genetisk eller fysiologiske endringer2. Selv om mange dyr modeller for NEC eksisterer, kan det hende at svaret å skade og terapeutisk intervensjon svært variabel mellom artene. Som følge av disse begrensningene therapeutics avledet fra dyremodeller mislykkes 90% av tiden da testet i menneskelige studier skyldes forskjeller i toksisitet eller effekt3. Enteroids tjener som lovende pre-klinisk modeller som kan overvinne disse manglene, fører til en bedre forståelse av komplekse intestinal patofysiologi, og derfor mer vellykket og kostnadseffektiv terapeutiske innovasjoner. Nyere bevis som en alder av vev som en enteroid genereres fra forblir biologisk viktig7finnes også. Dette er en spesielt viktig detalj for våre modellen siden enteroids genereres fra neonatal vev, og dermed opprettholde fysiologiske relevans til pasienter med NEC.
Nytten av enteroids som modeller av menneskelige sykdommer fortsetter å utvide, i håp om å finne kurer alvorlig og gjennomgripende forhold. Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en ødeleggende tarm sykdom i nyfødte preget av intestinal nekrose og ofte fører til perforering av tarmveggen, septicemia og død8. På grunn av den komplekse og multifaktoriell pathophysiology av NEC, har den eksakte mekanismen for sykdommen ennå ikke fullt utredet; Imidlertid, økt tarm permeabilitet har vært tydelig innblandet i sykdommen prosessen8. Gitt at studiet av NEC og potensielle terapeutiske agenter er etisk utfordrende i menneskelig fag, særlig barn, er det svært ønskelig å benytte biologisk relevante enteroid modell av NEC bruker menneskelig neonatal vev. Så langt har enteroids en begrenset rolle i studiet av NEC. Denne protokollen beskriver bruken av enteroids avledet fra menneskelige tarmen tissue prøver som en roman ex vivo modell for studiet av nekrotiserende enterokolitt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

Nekrotiserende enterokolitt er (NEC) en ødeleggende sykdom i nyfødte. Det er preget av flere pathophysiologic endringer i menneskelig intestinal epitel, fører til økt tarm permeabilitet, svekket hvile og økt celledød. Men det er mange dyr modeller av NEC, kan det hende at svaret å skade og terapeutisk intervensjon svært variabel mellom artene. Videre er det etisk utfordrende å studere sykdom patofysiologi eller romanen terapeutiske agenter direkte i menneskelig fag, særlig barn. Derfor er det svært ønskelig å utvikle en ny modell av NEC bruker menneskelig vev. Enteroids er 3-dimensjonale organoids avledet fra intestinal epitelceller. De er ideelle for studier av komplekse fysiologiske interaksjoner, celle signalisering og vert-patogen defense. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll som kulturer menneskelige enteroids etter isolere intestinal stamceller fra pasienter som gjennomgår tarm resection. Krypten cellene er kultivert i media som inneholder vekstfaktorer som oppmuntrer differensiering inn de ulike celle typer innfødte av menneskelig intestinal epitel. Disse cellene er dyrket i et syntetisk, collagenous blanding av proteiner som fungerer som et stillas, etterligne ekstra-mobile kjelleren membranen. Resultatet utvikle enteroids apikale-basolateral polaritet. Co administrasjon av lipopolysakkarid (LPS) i media forårsaker en inflammatorisk respons i enteroids, fører til histologic, genetisk og protein uttrykk endringer like de sett i menneskelig NEC. En eksperimentell modell av NEC bruker menneskelig vev kan gi en mer nøyaktig plattform for narkotika og behandling testing før menneskelige prøvelser, som vi forsøker å identifisere en kur for denne sykdommen.

Umiddelbart etter plating vises fersk isolert intestinal crypts som langstrakt stenger. Innen timer tar enteroid på en runde utseende (figur 1en). Over de neste dagene starter enteroids danner kuler som vist i figur 1b. Spirende oppstår mellom 5-10 dager (figur 1c) og enteroid samling skje på den tiden.
<p class="jove_content" fo:keep-together...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Enteroids dukker opp som en ny modell i studiet av menneskelig sykdom. Protokollen beskriver hvordan å simulere en enteroid modell av menneskelig necrotizing enterokolitt bruker lipopolysakkarid (LPS) behandling av enteroids fra neonatal vev. Samlet enteroids viser inflammatoriske endringer som dem sett i menneskelig necrotizing enterokolitt.

En roman menneskelige Epithelial Enteroid modell for nekrotiserende enterokolitt

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroider er tredimensjonale organoider avledet fra tarmepitelceller. De er ideelle for studiet av komplekse fysiologiske interaksjoner, cellesignalering og vertspatogenforsvar. Vår protokoll beskriver hvordan man dyrker menneskelige enteroider etter å ha isolert tarmstamceller fra pasienter som gjennomgår tarmreseksjon.Samtidig administrering av lipopolysakkarid i kulturmediene våre forårsaker en inflammatorisk respons i enteroidene som fører til histologiske, genetiske og proteinuttrykksendringer som ligner på de som er sett i menneskelig nekrotiserende enterocolitt. Gitt at studien av nekrotiserende enterocolitt og potensielle terapeutiske midler er etisk utfordrende hos mennesker, spesielt barn, er det svært ønskelig å bruke denne romanen, biologisk relevant enteroid modell av nekrotiserende enterocolitt ved hjelp av humant neonatal vev. Den største fordelen med denne teknikken er at enteroider er i stand til å rekapilere flere celletyper av humant tarmepitel og er i stand til å overvinne de anerkjente begrensningene av dyremodeller og cellebaserte systemer.Å demonstrere prosedyren vil være Christie Buonpane, en kirurgisk beboer, og Carrie Yuan, en laboratorietekniker fra laboratoriet vårt. På tidspunktet for samlingen i den operative suiten, plasser den menneskelige lille tarmvevsprøven i kalde DPBS. Vask prøven i den kalde DPBS til den er klar av blod og avføring.Oppbevar prøven i RPMI 1640 medium ved fire grader Celsius til den er klar for kryptisolering. Når du er klar til å fortsette, kontroller igjen at prøven er klar av avføring og blod. Ved hjelp av delikat dissekering saks fjerne overflødig fett eller kirurgiske klipp og stifter.Vekt prøven og sikt på et stykke som er ca 0,75 til 2,5 gram. Deretter kutter vevet i 0,5 centimeter stykker og plasserer dem i et rør som inneholder 30 milliliter chelating buffer nummer én. Rist med lav hastighet i 15 minutter ved fire grader Celsius.Deretter filtrerer vevet gjennom en 100 mikrometercellesil og kaster strømmen gjennom. Tilsett det filtrerte vevet i et rør som inneholder 30 milliliter chelating buffer nummer to. Rist med lav hastighet i 15 minutter ved fire grader Celsius.Filtrer vevet gjennom et 100 mikrometerfilter og kast strømmen gjennom. Etter dette tine 500 mikroliter kjeller membran matrise på is for senere bruk. Tilsett litt vev til 10 milliliter kald DMEM i et 50 milliliter konisk rør og rist kraftig for hånd i 10 sekunder.Filtrer denne suspensjonen gjennom en 100 mikrometercellesil og samle strømmen gjennom. Hold dette røret på is. Tilsett litt vev til en annen 10 milliliter kald DMEM i en egen 50 milliliter konisk rør og riste kraftig for hånd i 10 sekunder.Filtrer denne suspensjonen gjennom en 100 mikrometercellesil og samle strømmen gjennom. Gjenta prosessen to ekstra ganger til det er fire koniske rør som inneholder strømning gjennom merket en til fire. Deretter filtrerer du løsningen i rør nummer én gjennom en 100 mikrometercellesil og overfører strømmen gjennom til et konisk rør på 15 milliliter, også merket som nummer én.Gjenta denne prosessen for rør to til fire. Sentrifuge de 15 milliliter rørene ved 200 ganger G og ved fire grader Celsius i 15 minutter. I laminærstrømningshetten fjerner du supernatanten fra hvert rør og kaster den.Unngå å forstyrre skyen av vev rett over pellet, selv om det betyr å forlate noen supernatant bak. I hvert rør, pipette opp og ned sakte for å blande pellet med restene overnatant. Overfør blandingen fra hvert rør til et enkelt to milliliter konisk rør og sentrifuge ved 200 ganger G og ved fire grader Celsius i 20 minutter.Etter dette fjerner du den overnaturlige og gjenbruker pelleten i 500 mikroliter av pre-tint kjellermembranmatrise. Bruk en kjølt pipettespiss til å påføre 50 mikroliter av denne suspensjonen til midten av en brønn i en 24-brønnplate. Denne prøven skal vises kuppelformet.Gjenta denne søknadsprosessen ni ganger for å fylle 10 totale brønner. Overfør 24-brønnplaten til en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i 30 minutter for å tillate polymerisering. Deretter legger du til 500 mikroliter av menneskelige minigut-medier komplett til hver brønn.Fortsett å inkubere under de samme forholdene, og sørg for å erstatte dette mediet annenhver dag. Først legger du til 10 mikroliter LPS med en konsentrasjon på fem milligram per milliliter til de 500 mikroliter av humane minigut-medier som er komplette i hver brønn av platen på dag null. Fortsett å inkubere ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og erstatt det supplementerte mediet annenhver dag til innsamling.For å forberede parafininnbygging, fjern først forsiktig mediet, legg til en milliliter PBS, og forsiktig pipette opp og ned for å oppløse kjellermembranmatrisen mens du er forsiktig med å lyse enteroidene. Sentrifuge med en hastighet mindre enn 300 ganger G i fem minutter for å pellet og deretter fjerne PBS. Tilsett 4% paraformaldehyd og sett røret til side i en time for å fikse ved romtemperatur.Sentrifuge med en hastighet mindre enn 300 ganger G i fem minutter for å pellet og deretter fjerne paraformaldehyd. Vask forsiktig med en milliliter PBS og sentrifuge med en hastighet mindre enn 300 ganger G i fem minutter. Fjern deretter PBS.Gjenta denne vaskeprosessen med PBS én gang. Plasser ønsket mengde vevsbehandlingsgel i et konisk rør og varm den i en tørr bad inkubator ved 65 grader Celsius i tre til 10 minutter til den er flytende. Etter dette, tilsett smeltet vev behandling gel til pellet og bland forsiktig.Plasser en liten kloningring i en dekkslipp. Pipette vevsbehandlingsgelen og enteroidblandingen inn i kloningringen som er montert på en dekkslip. La vevsbehandlingsgelen og enteroidblandingen stivne ved fire grader Celsius i en time.Deretter senker kloningringen med den størknede blandingen i 70% etanol for å forberede parafininnbygging. Umiddelbart etter plating vises de nyisolerende tarmkryptene som langstrakte stenger. Innen timer vil enteroidene ta på seg et rundt utseende.I løpet av de neste dagene vil enteroidene begynne å danne kuler. Spirende bør skje mellom fem til 10 dager, som er når enteroid samling skal skje. De voksende enteroidene viser også polaritet, som inneholder en sentralisert lumen, en apisk grense og et basilateralt domene.Enteroider viser også strukturell integritet representert ved en robust actin cytoskeleton. Etter flere dager i kultur opplever LBS-behandlede enteroider mer apoptose og har et lavere utbytte enn kontrollgruppen. Som sett i menneskelig NEC i murine modeller av NEC, et økt uttrykk for bompenger som reseptor fire finnes i LPS behandlet enteroider sammenlignet med kontroller.Enteroidene kan også samles inn for RNA og proteinekstraksjon ved hjelp av veletablerte qRT-PCR og vestlige blotting teknikker genuttrykk og proteinisolasjon kan utføres.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utvikling og identifikasjon av en Novel undergruppe av menneskelige nøytrofilmedierte avledet Giant Fagocytter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - og menneske-avledet primære mage Epithelial Monolayer kultur for studier av gjenfødelse

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Benytter Human indusert pluripotent stilk cellen-avledet intestinal Organoids å studere og endre epitel cellen sikringen imot Salmonella og annet patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Indusert differensiering av M Cell-lignende celler i Human Stem Cell-avledet ileal Enteroid Monolagere

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

En ny høy gjennomstrømning ex vivo ovine hud sårmodell for testing av nye antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...