Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальный институт здравоохранения Институт диабета и пищеварительной и Грант болезни почек (K08DK106450) и Джей Гросфельд премию от Американской ассоциации детской хирургической C.J.H.

Одобрение Советом институциональный обзор был получен (СИБ #2013-15152) для сбора образцов ткани от пациентов, перенесших резекция кишечника на Энн и Роберт H. Лурье Детская Больница Чикаго, Чикаго, Иллинойс. Все протоколы были исполнены в соответствии с институциональных и национальных рук?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li><li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa.">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+(NEC).">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li><li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis.">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids:+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation.">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).</li><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering.">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

Этот роман ex vivo человека кишечные enteroid модель служит полезным методом для изучения дисфункции кишечника барьер в некротизирующего энтероколита (НЭК). Представленные здесь методы обработки enteroid были адаптированы из предыдущей работы Drs. Misty добра, Майкл Helmrath и Джейсон Wertheim10...

Человеческого enteroids являются ex vivo система 3-мерного культуры генерируется из стволовых клеток, изолированных от кишечных склепы образцов человеческой ткани кишечника. Эта модель наземного разорвать был впервые, Hans Clevers et al. в 2007 году после обнаружения Lgr5 + стволовых клеток в склепы тонкой кишки у мышей1. Их работа заложила основу для установления ex vivo кишечного эпителия культуры несколько типов клеток, которые могут быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. После этого открытия enteroids использовались как Роман модель для изучения нормальной физиологии пищеварения и патофизиологии кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника, хост возбудитель взаимодействия и регенеративной медицины2.
Использование в enteroids как ex vivo модель для изучения кишечных патофизиологии имеет ряд преимуществ перед альтернативные методы. За последние несколько десятилетий Животные модели и увековечен кишечного рака производные клеточных линий использовались для изучения физиологии кишечника3,4,5. Сингл клеточных культур не отражают разнообразие типов клеток в нормальной кишечного эпителия, тем самым не хватает в ячейке кросс talk и сегмент специфичность белков, сигнализации и индуцированных возбудителя болезни6. Стволовые клетки в enteroids дифференцироваться в основных типов эпителиальных клеток, таких как enterocytes, Paneth клетки, бокаловидных клеток, клеток enteroendocrine и более3. Они проявляют полярности, эпителиальные транспортных функций и позволяют для кишечных сегмент специфика6. Поскольку enteroids можно повторить несколько типов клеток кишечного эпителия человека, они могут преодолеть это ограничение признанных систем на основе клеток рака. Со временем производные клеточных линий subcloned и развиваться, чтобы выставлять большее разнообразие в выражение и локализация протеина3. Напротив enteroids может быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. Хотя существует множество животных моделей для NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. В результате этих ограничений, терапевтов, полученных от животных моделей неудачу 90% времени при тестировании в человеческих испытаний из-за различий в токсичности или эффективность3. Enteroids служат в качестве перспективных доклинических моделей, которые можно преодолеть эти недостатки, ведущих к лучшему пониманию сложных кишечных патофизиологии и, следовательно, более успешным и экономически эффективных терапевтических инноваций. Существует также недавние свидетельства того, что возраст ткани, создаваемый enteroid остается биологически важных7. Это особенно важная деталь для нашей модели, так как enteroids генерируются из новорожденных ткани, тем самым сохраняя физиологическое значение для пациентов с НВК.
Утилита enteroids как модели заболеваний человека продолжает расширяться, в надежде найти лекарства от серьезных и широко распространенных условий. Некротизирующего энтероколита (НЭК) является разрушительной кишечных заболеваний новорожденных характеризуется кишечных некроза и часто приводит к перфорации кишечника стены, сепсис и смерти8. Из-за сложных и многофакторных патофизиологии NEC точный механизм заболевания не еще не выяснен полностью; Однако повышение проницаемости кишечной ясно было вовлечено в процесс болезни8. Учитывая, что изучение NEC и потенциальных терапевтических агентов является этически сложный в человеке, особенно детей, это крайне желательно использовать биологически соответствующих enteroid модель NEC с использованием тканей человека новорожденных. До настоящего времени enteroids имеют ограниченную роль в изучении NEC. Этот протокол описывает использование enteroids, производный от образцов человеческой ткани кишечника как Роман ex vivo модель для изучения некротизирующего энтероколита.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

Некротизирующего энтероколита (НЭК) разрушительное заболевание новорожденных. Он характеризуется несколькими патофизиологические изменения в человека кишечного эпителия, приводит к увеличению проницаемости кишечника, нарушениями реституции и возросла клеточной смерти. Хотя существует множество животных моделей NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. Кроме того это этически сложный для изучения патофизиологии болезни или роман терапевтических агентов непосредственно в человеке, особенно детей. Таким образом весьма желательно разработать модель Роман NEC с использованием тканей человека. Enteroids, 3-мерной organoids, производный от клеток кишечного эпителия. Они идеально подходят для изучения сложных физиологических взаимодействий, сигнализации ячейки и хост Возбудитель обороне. В этой рукописи мы описываем протокол этого человека enteroids культур после изоляции кишечных стволовые клетки от пациентов, перенесших резекция кишечника. Склеп клетки культивировали в СМИ, содержит факторы роста, которые поощряют дифференцировку в различных родной типы клеток человека кишечного эпителия. Эти клетки выращивают в смесь синтетических, коллагеновых белков, которые служат в качестве лески, подражая внеклеточных базальной мембраны. В результате enteroids развивать апикальной базолатеральной полярности. Совместное управление липополисахарида (LPS) в средствах массовой информации вызывает воспалительной реакции в enteroids, ведущих к гистологических, генетические и белка выражение изменения, аналогичные тем, которые видели в человека NEC. Экспериментальная модель NEC с использованием тканей человека может предоставить более точные платформу для наркотиков и лечения тестирования до испытания на человеке, как мы стремимся определить лекарство от этой болезни.

Сразу же после покрытия, свежевыделенных кишечные крипты появляются как удлиненные стержней. В течение часов enteroid будет принимать круглый вид(рисунок 1). В течение следующих нескольких дней enteroids начнет формирование сфер, как показано на <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Enteroids появляются как модель роман в исследовании болезней человека. Протокол описывает как имитировать модель enteroid человека некротизирующего энтероколита, используя липополисахарида (LPS) лечение enteroids, созданный из новорожденных ткани. Собранные enteroids демонстрируют воспалительные изменения наподобие тех, которые видели в человека некротизирующего энтероколита.

Роман человеческого эпителиального Enteroid модель развития некротизирующего энтероколита

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Энтероиды являются трехмерными органоидами, полученными из кишечных эпителиальных клеток. Они идеально подходят для изучения сложных физиологических взаимодействий, клеточной сигнализации и защиты патогенов-хозяина. Наш протокол описывает, как культуры человека энтероидов после изоляции кишечных стволовых клеток от пациентов, проходящих дефекции.Совместное администрирование липополисахарид в наших культурных средствах массовой информации вызывает воспалительные реакции у энтероидов, что приводит к гистологическим, генетическим и белковым изменениям экспрессии, аналогичным тем, которые наблюдается в некротизирующем энтероколите человека. Учитывая, что изучение некротизирующего энтероколита и потенциальных терапевтических агентов является этически сложной задачей у людей, особенно детей, очень желательно использовать эту новую, биологически релевантную энтероидную модель некротизирующего энтероколита с использованием неонатальной ткани человека. Основным преимуществом этой техники является то, что энтероиды способны резюмировать несколько типов клеток кишечного эпителия человека и способны преодолеть признанные ограничения животных моделей и клеточных систем.Помочь продемонстрировать процедуру будут Кристи Buonpane, хирургический резидент, и Кэрри Yuan, лаборант из нашей лаборатории. Во время сбора в оперативном наборе поместите человеческий маленький образец кишечной ткани в холодный DPBS. Вымойте образец в холодном DPBS, пока он не будет очищен от крови и стула.Храните образец в RPMI 1640 среды при четырех градусах по Цельсию до готовности к изоляции склепа. Когда готовы приступить, проверьте еще раз, что образец очищается от стула и крови. Использование деликатных рассечения ножниц удалить излишки жира или хирургические клипы и скобы.Вес образца и стремиться к кусок, который составляет примерно 0,75 до 2,5 граммов. Затем разрежьте ткань на 0,5 сантиметра и поместите их в трубку, содержащую 30 миллилитров хелатирующего буфера номер один. Встряхните на низкой скорости в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.Затем процедите ткань через 100-метровый клеточный ситечко и отбросьте поток. Добавьте фильтрованную ткань в трубку, содержащую 30 миллилитров хелатирующего буфера номер два. Встряхните на низкой скорости в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.Фильтр ткани через 100 микрометровый фильтр и отбросить поток до конца. После этого оттепель 500 микролитров мембранной матрицы подвала на льду для более длительного использования. Добавьте немного ткани до 10 миллилитров холодного DMEM в 50 миллилитровой конической трубки и энергично встряхните вручную в течение 10 секунд.Фильтр этой подвески через 100 микрометровый ситечко клетки и собирать поток до конца. Держи эту трубку на льду. Добавьте немного ткани еще к 10 миллилитров холодного DMEM в отдельной 50 миллилитровой конической трубке и встряхните энергично вручную в течение 10 секунд.Фильтр этой подвески через 100 микрометровый ситечко клетки и собирать поток до конца. Повторите этот процесс еще два раза, пока есть четыре конические трубки, содержащие поток через помечены один через четыре. Затем отфильтруй раствор в трубке номер один через 100-метровый клеточный ситечко и перенесите поток в 15-миллилитровую коническую трубку, также помеченную номером один.Повторите этот процесс для трубок от двух до четырех. Центрифуга 15 миллилитров труб при 200 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. В ламинарный капюшон потока, удалить supernatant из каждой трубки и отказаться от него.Избегайте нарушения облако ткани непосредственно над гранулами, даже если это означает, что оставить некоторые supernatant позади. В каждой трубке, пипетка вверх и вниз медленно, чтобы смешать гранулы с остатками супернатанта. Перенесите смесь из каждой трубки в одну двухми миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 200 градусах G и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.После этого удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 500 микролитров предварительно размороженой мембранной матрицы подвала. Используйте охлажденный наконечник пипетки, чтобы применить 50 микролитров этой подвески к центру хорошо в 24 пластины хорошо. Этот образец должен появиться в форме купола.Повторите этот процесс подачи заявки девять раз, чтобы заполнить 10 общих скважин. Перенесите 24 хорошо пластины в 5%carbon двуокиси инкубатор при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы полимеризации. Затем добавьте 500 микролитров человеческих минигутных средств массовой информации в комплекте с каждой хорошо.Продолжайте инкубацию в тех же условиях, убедившись, что заменить этот медиа каждые два дня. Во-первых, добавьте 10 микролитров LPS при концентрации в пять миллиграммов на миллилитр до 500 микролитров человеческого минигута, завершенных в каждом колодеце пластины на нулевом дне. Продолжайте инкубацию при 37 градусах По Цельсию с 5%-ным углекислым газом и замените дополненные средства каждые два дня до сбора.Чтобы подготовиться к встраиванию парафина, сначала аккуратно удалите средства массовой информации, добавьте один миллилитр PBS и аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы растворить матрицу мембраны подвала, будучи осторожными, чтобы не подставить энтероиды. Центрифуга на скорости менее 300 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулы, а затем удалить PBS. Добавить 4%paraformaldehyde и установить трубку в сторону в течение одного часа, чтобы исправить при комнатной температуре.Центрифуга со скоростью менее 300 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать, а затем удалить параформальдегид. Вымойте осторожно с одним миллилитров PBS и центрифуги на скорости менее 300 раз G в течение пяти минут. Затем удалите PBS.Повторите этот процесс мытья с PBS один раз. Поместите нужное количество геля обработки тканей в коническую трубку и разогреете его в инкубаторе сухой ванны при 65 градусах по Цельсию в течение трех-десяти минут, пока он не будет жидким. После этого добавьте гель для обработки расплавленной ткани в гранулы и аккуратно перемешайте.Поместите небольшое клонирование кольца в крышку. Pipette ткани обработки геля и энтероидной смеси в клонирование кольцо, которое устанавливается на крышку. Разрешить ткани обработки геля и энтероидной смеси затвердеть при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа.Затем погрузите клонирование кольца с затверденой смесью в 70% этанола для подготовки к встраиванию парафина. Сразу же после покрытия, свежеизоляционные кишечные склепы появляются как удлиненные стержни. В течение нескольких часов энтероиды будут принимать круглый вид.В течение следующих нескольких дней энтероиды начнут формировать сферы. Подающий надежды должен происходить от пяти до 10 дней, то есть, когда энтероидный сбор должен произойти. Растущие энтероиды также обладают полярностью, содержащей централизованный люмен, апикал-границу и базилатеральный домен.Энтероиды также показывают структурную целостность, представленную надежным актином цитоскелета. После нескольких дней в культуре, LBS лечение энтероидов опыт более апоптоза и имеют более низкую урожайность, чем контрольная группа. Как видно из человека NEC в муриновых моделях NEC, увеличение экспрессии пошлины, как рецептор четыре находится в LPS лечение энтероидов по сравнению с контроля.Энтероиды также могут быть собраны для извлечения РНК и белка с использованием хорошо установленных qRT-PCR и западных методов blotting экспрессии генов и белковой изоляции могут быть выполнены.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Мыши и человека, полученных первичных желудка эпителиальных монослойном культивировании для изучения регенерации

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток-производные кишечные органоиды для изучения и изменения эпителиальной защиты клеток против сальмонеллы и других патогенов

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Индуцированная дифференциация M-клеточных клеток в стволовой клетке человека производные Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Новая высокопроизводительная модель раны овечьей кожи Ex Vivo для тестирования новых антибиотиков

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...