Name: a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

Detta arbete stöds av det nationella institutet för hälsa Institutet för Diabetes och mag och njur sjukdom Grant (K08DK106450) och Jay Grosfeld Award från American Pediatric kirurgiska Association till C.J.H.

Institutionella granskning styrelsens godkännande erhölls (IRB #2013-15152) för insamling av vävnadsprover från patienter som genomgår tarm resektion vid Ann och Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago, Chicago, IL. Alla protokoll utfördes institutionella och nationella riktlinjer och förordningar för mänsklig välfärd. Skriftliga informerade föräldrarnas samtycke krävs och utvunnen före provtagning i alla fall.
1. REAGENSBEREDNING
<ol><li>Förbereda kultur Media staml?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li><li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa.">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+(NEC).">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li><li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis.">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids:+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation.">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).</li><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering.">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier.">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li><li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice.">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li></ol>

Denna roman ex vivo human intestinal enteroid modell fungerar som en användbar metod för att studera tarmbarriären dysfunktion i nekrotiserande enterokolit (NEC). Enteroid bearbetningsmetoderna presenteras här anpassades från tidigare arbete av Drs. Misty Good, Michael Helmrath och Jason Wertheim10,11,12.
Detaljerna kring hela vävnad samling och tidpunkten för crypt isolering är viktiga steg i...

Mänskliga enteroids är en ex vivo 3-dimensionell kultur systemgenererade från stamceller isoleras från intestinal kryptor av human intestinal vävnadsprover. Denna banbrytande modell var pionjärer av Hans Clevers et al. i 2007 efter upptäckten av Lgr5 + stamceller på kryptor av tunntarmen i möss1. Deras arbete lade grunden för att upprätta en ex vivo intestinal epitelial kultur flera celltyper som kunde vara passaged utan betydande genetiska eller fysiologiska förändringar2. Sedan denna upptäckt, har enteroids använts som romanen modell för att studera normal mag fysiologi och Patofysiologi av tarmsjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom, värd-patogen interaktioner och regenerativ medicin2.
Användning av enteroids som ex vivo modell för studier av intestinal patofysiologin har flera fördelar jämfört med alternativa tekniker. För de senaste decennierna, har djurmodeller och förevigade intestinal cancer-derived cellinjer använts för att studera tarmens fysiologi3,4,5. Encelliga kulturer representerar inte mångfalden av celltyper förekommer i normal tarm epitel, därmed saknar celler överhörning och segment-specificitet i proteinuttryck, signalering och patogen-inducerad sjukdom6. I enteroids stamceller differentieras till stora epitelial celltyper såsom enterocyter, Paneth celler, bägarceller, enteroendokrina celler och mer3. De uppvisar polaritet, utföra epitelial transport funktioner och möjliggör intestinal segmentet specificitet6. Eftersom enteroids kan sammanfatta de flera celltyper av human intestinal epitel, är de kunna övervinna denna erkända begränsning av cancer cell-baserat system. Med tiden, derivat av cellinjer är subcloned och utvecklas för att uppvisa större mångfald i protein uttryck och lokalisering3. Däremot kan enteroids vara passaged utan betydande genetiska eller fysiologiska förändringar2. Även om många djurmodeller för NEC finns, kan svar till skada och terapeutiska insatser vara mycket varierande mellan arter. Till följd av dessa begränsningar therapeutics härrör från djurmodeller misslyckas 90% av tiden när testas i mänskliga prövningar på grund av skillnader i toxicitet eller effekt3. Enteroids fungera som lovande prekliniska modeller som kan övervinna dessa brister, vilket leder till en bättre förståelse för komplexa intestinal patofysiologi och därför mer framgångsrikt och kostnadseffektivt terapeutiska innovationer. Det finns också nya rön som åldern av vävnad som en enteroid genereras från återstår biologiskt viktiga7. Detta är en särskilt viktig detalj för vår modell eftersom enteroids genereras från neonatal vävnad, därigenom bibehålla fysiologiska betydelse för patienter med NEC.
Nyttan av enteroids som modeller för humana sjukdomar fortsätter att expandera, i hopp om att hitta botemedel för allvarliga och genomgripande förhållanden. Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en förödande tarm sjukdom hos nyfödda kännetecknas av intestinal nekros och ofta leder till perforation av tarmväggen, septikemi, och död8. På grund av komplex och multifaktoriell patofysiologin av NEC, har den exakta mekanismen av sjukdomen inte ännu helt klarlagd; men har ökad intestinal permeabilitet varit tydligt inblandade i sjukdom processen8. Eftersom studien av NEC och potentiella terapeutiska medel är etiskt utmanande på människor, särskilt barn, det är mycket önskvärt att utnyttja en biologiskt relevanta enteroid modell av NEC med mänsklig neonatal vävnad. Hittills har enteroids en begränsad roll i studiet av NEC. Det här protokollet beskriver användningen av enteroids härrör från human intestinal vävnadsprover som en roman ex vivo modell för studier av nekrotiserande enterokolit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:887px;" width="887">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">AAJ19943K2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">A-83</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Tocris</td>
			<td style="width:167px;">2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">B-27 supplement minus Vitamin A</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">MT-16-405-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11-965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gemini Bio-Pro</td>
			<td style="width:167px;">100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G5013-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Insulin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I9278-5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">[leu] 15-gastrin 1</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9145-.1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Noggin</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">6057-NG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-5X10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">R-Spondin</td>
			<td style="width:139px;">PEPROTECH INC</td>
			<td style="width:167px;">120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SB202190</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7067-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Processing Gel (Histogel)</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td>22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems INC</td>
			<td style="width:167px;">5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Y-27632</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis

Nekrotiserande enterokolit är (NEC) en förödande sjukdom hos nyfödda. Den kännetecknas av flera patofysiologiska förändringar i människans tarm epitel, vilket leder till ökad intestinal permeabilitet, nedsatt restitution och ökade celldöd. Det finns ett flertal djurmodeller av NEC, kan svar till skada och terapeutiska insatser vara mycket varierande mellan arter. Det är dessutom etiskt utmanande att studera sjukdomen patofysiologi eller nya terapeutiska medel direkt på människor, särskilt barn. Därför är det önskvärt att utveckla en ny modell av NEC med mänsklig vävnad. Enteroids är 3-dimensionella organoids härrör från tarmepitelceller. De är idealiska för studiet av komplexa fysiologiska samspel, cellsignalering och värd-patogen försvar. I detta manuskript beskriver vi ett protokoll att kulturer mänskliga enteroids efter isolera intestinal stamceller från patienter som genomgår tarm resektion. Crypt cellerna odlas i media som innehåller tillväxtfaktorer som stimulerar differentiering i olika cell typer infödingen av human intestinal epitel. Dessa celler odlas i en syntetisk, kollagena blandning av proteiner som fungerar som en byggnadsställning, härma extra-cellulära basalmembranet. Som ett resultat, utveckla enteroids apikala-basolateral polaritet. Samtidig administrering av lipopolysackarid (LPS) i media orsakar en inflammatorisk reaktion i enteroids, leder till histologisk, genetisk och protein uttryck förändringar liknande de som setts i mänskliga NEC. En experimentell modell av NEC med mänsklig vävnad kan ge en mer exakt plattform för läkemedel och behandling provning innan försök på människa, som vi strävar efter att identifiera ett botemedel mot denna sjukdom.

Omedelbart efter plätering visas nymalen isolerade intestinal kryptor som avlånga stavar. Inom timmar tar enteroid på en runda utseende (figur 1en). Under de kommande dagarna börjar enteroids utgör områden som ses i figur 1b. Spirande skulle uppstå mellan 5-10 dagar (figur 1c) och enteroid samling bör ske på den tiden.
<p class="jove_con...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Enteroids växer fram som en ny modell i studiet av mänskliga sjukdomar. Protokollet beskrivs hur du simulerar en enteroid modell av mänskliga nekrotiserande enterokolit använder lipopolysackarid (LPS) behandling av enteroids genereras från neonatal vävnad. Insamlade enteroids påvisa inflammatoriska förändringar besläktad med de som setts hos människa nekrotiserande enterokolit.

En roman mänskliga epitelceller Enteroid modell för nekrotiserande enterokolit

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroider är tredimensionella organoider som härrör från tarmepitetelceller. De är idealiska för studier av komplexa fysiologiska interaktioner, cell signalering, och värd patogen försvar. Vårt protokoll beskriver hur man kultur mänskliga enteroids efter isolera intestinala stamceller från patienter som genomgår tarm samband.Samadministration av lipopolysackarid i vår kultur media orsakar en inflammatorisk svar i enteroids leder till histologic, genetiska och protein expression ändringar som liknar de som ses i mänskliga necrotizing enterocolitis. Med tanke på att studiet av necrotizing enterocolitis och potentiella terapeutiska agenter är etiskt utmanande i mänskliga ämnen, särskilt barn, är det mycket önskvärt att utnyttja denna roman, biologiskt relevant enteroid modell av necrotizing enterokolit med hjälp av mänskliga neonatal vävnad. Den största fördelen med denna teknik är att enteroids har möjlighet att rekapitulera de flera celler typer av mänskliga intestinala epitel och har möjlighet att övervinna de erkända begränsningar av djurmodeller och cellbaserade system.Att hjälpa till att visa förfarandet kommer att Christie Buonpane, en kirurgisk bosatt, och Carrie Yuan, en laboratorietekniker från vårt laboratorium. Vid tidpunkten för insamling i den operativa sviten, placera den mänskliga små tarmvävnad prov i kalla DPBS. Tvätta exemplaret i den kalla DPBS tills det är klart av blod och avföring.Förvara exemplaret i RPMI 1640 medium vid fyra grader Celsius tills det är klart för kryptisolering. När du är redo att fortsätta, kontrollera igen att provet är klart från avföring och blod. Använda känsliga dissekera saxar bort eventuella överflödigt fett eller kirurgiska klipp och häftklamrar.Vikta preparatet och sikta på en bit som är ungefär 0,75 till 2,5 gram. Därefter skär vävnaden i 0,5 centimeter bitar och placera dem i ett rör som innehåller 30 milliliter kelatbuffert nummer ett. Skaka i låg hastighet i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Filtrera sedan vävnaden genom en 100 mikrometercellsil och kasta flödet igenom. Tillsätt den filtrerade vävnaden i ett rör som innehåller 30 milliliter kelatbuffert nummer två. Skaka i låg hastighet i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Filtrera vävnaden genom ett 100-mikrometerfilter och kassera flödet genom. Efter detta tina 500 mikroliter av källaren membran matris på is för senare användning. Tillsätt lite vävnad till 10 milliliter kall DMEM i en 50 milliliter koniska rör och skaka kraftigt för hand i 10 sekunder.Filtrera denna suspension genom en 100 mikrometer cell sil och samla flödet genom. Håll det här röret på is. Tillsätt lite vävnad till ytterligare 10 milliliter kall DMEM i en separat 50 milliliter koniska röret och skaka kraftigt för hand i 10 sekunder.Filtrera denna suspension genom en 100 mikrometer cell sil och samla flödet genom. Upprepa processen ytterligare två gånger tills det finns fyra koniska rör som innehåller flöde genom märkta en till fyra. Filtrera sedan lösningen i rör nummer ett genom en 100 mikrometer cell sil och överföra flödet genom i en 15 milliliter koniskt rör också märkt nummer ett.Upprepa denna process för rör två till fyra. Centrifugera de 15 milliliter rören vid 200 gånger G och vid fyra grader Celsius i 15 minuter. I laminär flödeshuven tar du bort supernatanten från varje rör och kasserar den.Undvik att störa molnet av vävnad omedelbart ovanför pelleten, även om det innebär att lämna några supernatant bakom. I varje rör, pipettera upp och ner långsamt för att blanda pelleten med överblivna supernatant. Överför blandningen från varje rör till ett enda två milliliter koniskt rör och centrifug vid 200 gånger G och vid fyra grader Celsius i 20 minuter.Efter detta, ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 500 mikroliter av pre-tinade källaren membran matris. Använd en kyld pipettspets för att applicera 50 mikroliter av denna suspension till mitten av en brunn i en 24 brunnsplatta. Detta prov bör visas kupol formad.Upprepa denna ansökningsprocess nio gånger för att fylla 10 totalt brunnar. Överför 24 brunnsplattan till en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i 30 minuter för att möjliggöra polymerisering. Sedan, tillsätt 500 mikroliter av mänskliga minigut media komplett till varje brunn.Fortsätt inkubera under samma förhållanden, se till att ersätta detta media varannan dag. Först, tillsätt 10 mikroliter LPS vid en koncentration av fem milligram per milliliter till 500 mikroliter av mänskliga minigut media komplett i varje brunn av plattan på dag noll. Fortsätt inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid och byt ut de kompletterade medierna varannan dag fram till samlingen.För att förbereda för paraffininbäddning, ta först försiktigt bort media, tillsätt en milliliter PBS, och försiktigt pipettera upp och ner för att lösa upp källaren membranmatrisen samtidigt som man är noga med att inte lysa enteroiderna. Centrifug med en hastighet som är mindre än 300 gånger G i fem minuter till pelleten och ta sedan bort PBS. Tillsätt 4%paraformaldehyd och ställ röret åt sidan i en timme för att fixera vid rumstemperatur.Centrifugera med en hastighet som är mindre än 300 gånger G i fem minuter till pelleten och sedan avlägsna paraformaldehyden. Tvätta försiktigt med en milliliter PBS och centrifug med en hastighet som är mindre än 300 gånger G i fem minuter. Ta sedan bort PBS.Upprepa denna tvättprocess med PBS en gång. Placera önskad mängd av vävnadsbearbetningsgelen i ett koniskt rör och värm den i ett torrt bad inkubator på 65 grader Celsius i tre till 10 minuter tills det är flytande. Efter detta, tillsätt den smälta vävnad bearbetning gel till pelleten och blanda försiktigt.Placera en liten kloningsring i en täckplatta. Pipettera vävnadsbehandlingsgelen och enteroidblandningen i kloningsringen som monteras på ett täckskydd. Låt vävnadsbearbetningsgelen och den enteroida blandningen stelna vid fyra grader Celsius i en timme.Därefter, dränka kloning ringen med stelnat blandningen i 70%etanol för att förbereda för paraffin inbäddning. Omedelbart efter plätering, de nyligen isolerande tarmkrypter visas som långsträckta stavar. Inom några timmar kommer enteroiderna att ta på ett runt utseende.Under de närmaste dagarna kommer enteroiderna att börja bilda sfärer. Knoppning bör ske mellan fem till 10 dagar, vilket är när enteroid insamling bör ske. De växande enteroiderna uppvisar också polaritet, som innehåller en centraliserad lumen, en apikisk gräns och en basilateral domän.Enteroids visar också strukturell integritet representeras av en robust aktin cytoskelett. Efter flera dagar i kultur, lbs behandlade enteroids uppleva mer apoptos och har en lägre avkastning än kontrollgruppen. Som ses i mänskliga NEC i murin modeller av NEC, ett ökat uttryck för vägtull som receptor fyra finns i LPS behandlade enteroids jämfört med kontroller.Enteroiderna kan också samlas in för RNA och protein extraktion med hjälp av väl etablerade qRT-PCR och västra blotting tekniker genuttryck och protein isolering kan utföras.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera interaktioner mellan humant helblod och endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utveckling och identifieringen av en ny underpopulation av humant neutrofilt härrörande Giant fagocyter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - och mänskliga-härledda primära Gastric epitelial enskiktslager kultur för studien av regenerering

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller-derived intestinal Organoider att studera och modifiera epitelial cell skydd mot salmonella och andra patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Inducerad differentiering av M-Cellliknande celler i humana stamcells-härledda ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

En ny ex vivo-sårmodell med hög genomströmning för får för testning av nya antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...