Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
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作者感谢大野正和和屋的实验协助和建议。这项工作得到了 PRESTO (JPMJPR15F7)、日本科学技术厅、青年科学家补助金 (a) (24687022)、挑战探索性研究 (26650055) 和日本信息社会创新领域科学研究 (23115005) 的支持。促进科学, 并由武田科学基金会和莫奇达医学和药物研究纪念基金会提供赠款。S. l. 感谢 RIKEN 国际项目助理 (IPA) 计划的支持。

1. 细胞制备
<ol><li>在杜尔贝科的改良鹰培养基中培养在37°c 以下的37厘米盘中的平底物中的平细胞, 其中含有10% 的胎儿牛血清。</li>
	<li>收集指数生长的细胞, 一旦他们已经达到70% 的融合, 按照 ATCC 指令17。<ol>
<li>用1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pH 值 7.4) 冲洗细胞。删除 PBS。</li>
		<li>加入1毫升0.1% 的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (EDTA)。在37°c 下孵化5分钟。</li>
		<li>用显微镜监测细胞...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

本文介绍了一种用 SDS-PAGE 分离后细胞中每个标记蛋白物种的标记同质性的量化方案 (步骤 3)。分离方法可替代其他方法, 如液相色谱或毛细管电泳, 允许分离和分馏的细胞蛋白与高分辨率, 同时需要特殊的设备23。例如, 在当前协议中使用 Nhs-ster 的标记方法可以用使用马来酰亚胺酯或抗体的其他方法取代。
标签均匀性分析的要求取决于标记在多大程度上偏离了...

蛋白质组分析, 旨在量化在细胞中表达的整个蛋白质分子集, 是目前的生物和医学研究中的一个有价值的方法。这种分析通常依靠质谱技术, 根据通过蛋白质电离产生的光谱1,2,3来识别蛋白质物种。蛋白质组分析的另一种方法是电泳, 包括聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)、毛细管电泳和二维凝胶电泳。这种方法依赖于分析细胞中所有蛋白质分子的非特异性荧光标记, 然后对每个蛋白质物种进行电泳分离、检测和定量。为了实现所需的非特异性蛋白质标记, 一种策略是使用荧光染料, 这些染料可以通过静电和疏水相互作用与蛋白质结合, 例如 coomassie blue 和 sypro-ruby4、5、6.另一种策略是对含有 n-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺的染料使用共价标记, 后者可以通过初级胺和硫醇等常见残留物与蛋白质共价结合,8。
同时, 荧光检测的灵敏度是分析低丰度蛋白质和少量细胞的理想选择。单分子荧光成像是最敏感的方法之一, 允许检测个别荧光染料和标记的蛋白质在体外和体内9, 10,11,12, 13,14,15。应用这种成像方法的电泳为基础蛋白质组分析, 预计通过计数单个荧光标记的蛋白质, 可以实现高度敏感和定量的检测。然而, 目前仍不清楚荧光染料的标记是否在所有蛋白质分子中都足够均匀, 以及不同的蛋白质种类如何影响这种同质性 (图 1)。简单的散装溶液测量可用于获得荧光染料与称为 "耦合效率" 8 或 "标记效率"的蛋白质的摩尔比, 但这一特性并不提供有关标记之间的均匀性的信息。蛋白质分子。
在这里, 我们描述了一种检测方案, 以研究细胞中所有蛋白质物种的标记同质性 (图 2)16。该检测的两个关键步骤是蛋白质纯化和成像。在第一步中, 细胞中的所有蛋白质都是荧光标记和生物素化的, 然后使用凝胶电泳然后进行电洗法提取。第二步, 在单分子成像的基础上, 对提取样品中单个蛋白质分子的荧光特性进行评价。从这些数据来看, 重要的参数对计数分析很重要, 例如用最少一种染料标记的蛋白质的百分比, 我们称之为标记占用率 (LO) 16, 以及与单个蛋白质分子结合的荧光染料的平均数量 (n~ n染料), 可以被描述。在该协议中, 以 NHS 酯为基础的氰氨酸 3 (Cy3) 染料标记 H待体细胞蛋白质组的优化程序为例, 并可根据所需的研究目标使用其他标记程序进行修改。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

细胞蛋白质组的特征通常使用电泳检测, 其中细胞中的所有种类的蛋白质都没有专门标记为荧光染料, 并在分离后被光电探测器发现。单分子荧光成像可以提供超敏感的蛋白质检测, 其能力, 可视化个别荧光分子。然而, 这种强大的成像方法在电泳检测中的应用受到了阻碍, 因为缺乏表征蛋白质组中每个蛋白质物种荧光标记的同质性的方法。在这里, 我们开发了一种基于单分子荧光成像分析的蛋白质组标记均匀性的方法。在我们使用 HeLa 细胞样本进行测量时, 用至少一种染料标记的蛋白质的比例被确定为50% 至 90%, 支持单分子成像应用于敏感而精确的蛋白质组分析。

图 4显示了来自 hela 细胞裂解液的蛋白质的不同分子量分数的原始图像数据, 以及正负对照。虽然蛋白质样本和阳性控制在每个图像中都表现出100-500 点, 但负控制不会显示任何点或几个点, 这表明该协议足以抑制染料与覆盖物表面的非特异性结合。蛋白质样品的点强直方图和阳性对照显示多个峰, 分别代表染料与蛋白质中的原胺的随机结合和阿维丁四?...

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

在这里, 我们提出了一个协议, 以评估标签同质性的每个蛋白质物种在一个复杂的蛋白质样本在单分子水平。

单分子水平标记均匀性的全蛋白质定量

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

该方法演示了用单分子计算法对液体样品中蛋白质量进行量化的校准。具体来说，它可以说明蛋白质群如何在每个分子水平上被荧光标记。先前的方法进行了批量测量，以分析荧光分子和蛋白质分子的摩尔比，但它们不能揭示异质蛋白质群是如何实际标记的。我们的方法可以直接在单分子水平上做到这一点。我们的方法可以扩展到超敏感和先进的分子浓度测定，这将导致未来的诊断方法，从而在样品中有效地发现致病分子。我们的方法可用于使用荧光抗体进行单一蛋白质物种分析，以及使用非特异性标签对通过电泳或色谱分离的所有蛋白质进行多物种分析。该技术最关键的一点是获得数据可重复性。我建议在测量多个样品时尽可能保持相同的实验条件。该技术的可视化演示将提供如何使每个实验步骤稳定且可重复。它还会显示一些不寻常的步骤在生物化学协议，如旋转涂层和洗涤显微镜盖玻片。若要开始此过程，请准备文本协议中概述的 lysing 缓冲区和 1%Tween-20。使用氢氧化钠将pH调至12。将 100 微升的开水缓冲液与一个摩尔滴滴涕的微升和 4 个 50%CHAPS 的微升混合。添加一个微升的准备好的细胞培养，通过慢移液使溶液均质，以避免气泡。在黑暗中室温下孵育五分钟，轻轻搅拌。然后，通过缓慢向上和向下移液，使溶液重新变生。加入一微克的Cy3 NHS酯染料，通过减慢移液速度使溶液均匀化，避免气泡。在黑暗中在室温下孵育10分钟，轻轻搅拌。重复此过程，添加相同数量的染料并孵育样品一次。加入 100 微升 0.8 摩尔 HEPES-氢氧化钠，将溶液的 pH 调节为 7.2 并淬火反应。缓慢移液器上下，使溶液均质化。接下来，加入20微升生物素-2胺和5微升EDC。通过缓慢向上和向下移液使溶液均匀。在黑暗中在室温下孵育一小时，轻轻搅拌。在此之后，使用具有 10 千吨截止的超滤柱去除任何未反应的标签试剂并浓缩样品。在对蛋白质样本和分子梯执行标准 SDS-PAGE 后，对凝胶进行成像，以确定蛋白质波段的位置。使用锋利的刀片切出含有蛋白质部分的凝胶部分，这些份量基于带的位置。首先，设置 22 毫米由 22 毫米的盖玻片，0.15 毫米厚的盖玻片。使用等离子清洁剂将盖玻片暴露在空气等离子体中一分钟，以清洁和激活其表面。接下来，使用旋转涂布器在 500RPM 时用 200 微升的 avadin 缓冲器旋转盖玻片，在 500RPM 下旋转 5 秒钟，随后在 1000RPM 下旋转 30 秒。在室温下孵育盖玻片15分钟，让其空气干燥。要为蛋白质样品准备盖玻片，请使用已稀释的蛋白质样本。将稀释样品的 100 微升放在涂覆盖玻片的中心。在室温下在黑暗中孵育15分钟。为了准备正对，将100微升纯化荧光生物素放在5微摩尔 HEPES-氢氧化钠中，在pH 7.2的中心处，放在一个镀膜盖玻片的中心。在室温下在黑暗中孵育15分钟。为了准备负对，旋转涂层等离子盖玻片与200微升5 HEPES-氢氧化钠与两毫克每毫升BSA没有阿瓦丁。在pH 7.2的5微摩尔 HEPES-氢氧化钠中加入100微升到纯化荧光生物素中。在黑暗中在室温下孵育15分钟。在此之后，通过边缘移液，用 200 微升蒸馏水冲洗每个盖玻片，确保不要用移液器尖端触摸盖玻片的中间。重复此洗涤三次。然后，将等数量的新盖玻片暴露在空气等离子体中一分钟。将清洁的盖玻片放在每个样品装盖玻片的顶部，以避免干燥。启动宽场或消逝场荧光显微镜。在显微镜上设置盖玻片并找到焦点。然后，执行磁贴扫描以获取至少 100 个图像。在这项研究中，与SDS-PAGE分离后，对细胞中每个标记蛋白物种的标签均质进行量化。这里显示了来自 HeLa 细胞 lysate 的不同蛋白质分子量分数的原始图像数据，以及正负对比。虽然蛋白质样本和阳性对照显示每个图像 100 到 500 个点之间，但负对照显示的很少或根本没有。这表明，该工艺充分抑制染料与盖玻片表面的非特异性结合。蛋白质样本的点强度直方图和正对照呈现多个峰值，分别表示染料与蛋白质和 avadin 四聚体结构中原胺的随机结合。所有斑点都显示出闪烁和逐步光漂白与连续激光激发，突出观察在单个分子水平。然后，根据每个蛋白质样本中的斑点数与正对照中的点数之比计算标签占用率。从 HeLa 细胞 lysate 样品中测量的 LO 范围从 50% 的分子量分数到 90% 的分子量分数。整个蛋白质组样品的LO，没有分离，被认为是72%的关键使用新鲜制作的试剂，并避免任何灰尘，特别是在准备盖玻片。按照这个程序，可以在一定体积进行单分子计数分析，以量化每种蛋白质的浓度。例如，可以对任何原始产品或凝胶和毛细管电泳产品进行分析。该技术为将单分子荧光成像应用于分子医学、有机化学和组理分析铺平了道路。通过在集中和数字之间缩小概念。浓缩氢氧化钠具有腐蚀性，处理时应佩戴足够的保护。此外，高功率激光辐射可能会导致眼睛损伤，因此可能会佩戴护目镜。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

从单分子结构信息FRET实验使用快速纳米定位系统

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

科研

生物化学

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

单分子水平的高精度FRET用于生物分子结构测定

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

磁性镊子 quadruplexes 单分子操作

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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

应用三色单分子焦虑研究蛋白质相互作用的相关性

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

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In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

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