Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Forfatterne takke Masae Ohno og Kazuya Nishimura for eksperimenterende assistance og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af PRESTO (JPMJPR15F7), Japan videnskab og teknologi agentur, Grants-in-aid for unge forskere (A) (24687022), udfordrende sonderende forskning (26650055) og videnskabelig forskning på Innovative områder (23115005), Japan samfundet for Fremme af videnskab, og ved tilskud fra Takeda Science Foundation og Mochida Memorial Foundation for medicinsk og farmaceutisk forskning. S.L. anerkender støtte fra programmet RIKEN International Program tilknytte (IPA).

1. celle forberedelse
<ol><li>Dyrke HeLa celler i en 10 cm parabol ved 37 ° C under 5% CO2 i Dulbecco ændrede Eagles medie som indeholder 10% føtal bovint serum.</li>
	<li>Indsamle eksponentielt voksende celler, når de har nået 70% confluency, efter ATCC instruktioner17.<ol>
<li>Skyl celler med 5 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH 7,4). Fjerne PBS.</li>
		<li>Der tilsættes 1 mL af 0,1% trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA). Inkuber 5 min ved 37 ° C.</li>
		<li>O...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Dette papir beskriver en protokol for at kvantificere den mærkning ensartethed af hver mærket protein arter i celler efter separation med SDS-PAGE (trin 3). Metoden adskillelse kan erstattes med andre metoder såsom væskekromatografi eller kapillær elektroforese, som giver mulighed for adskillelse og fraktionering af cellulære proteiner med høj opløsning, mens der kræver særligt udstyr23. Metoden mærkning ved hjælp af NHS-ester i den nuværende protokol kan erstattes med andre metoder, ...

Proteom analyse, som har til formål at kvantificere hele sættet af proteinmolekyler udtrykt i cellen, er en værdifuld fremgangsmåde i nuværende biologiske og medicinske undersøgelser. Denne analyse bygger ofte på massespektrometri, som identificerer protein arter baseret på spektre genereret gennem protein ionisering1,2,3. En alternativ metode til proteomet analyse er elektroforese, herunder polyacrylamid gelelektroforese (side), kapillær elektroforese og todimensionale (2D) gelelektroforese. Denne metode bygger på ikke-specifikke fluorescerende mærkning af alle proteinmolekyler i de analyserede celler, efterfulgt af elektroforetisk separation og påvisningen og kvantificeringen af hvert protein arter. For at opnå kræves ikke-specifik protein mærkning, er én strategi at bruge fluorescerende farvestoffer, der kan bindes til proteiner via elektrostatiske og hydrofobe interaktioner, såsom Coomassie blå og Sypro-Ruby4,5,6 . En alternativ metode er at bruge kovalente mærkning med farvestoffer, der indeholder N-hydroxysuccinimide (NHS) ester eller maleimide, som kan kovalent binder sig til proteiner gennem fælles rester som primære aminer og dithioler, henholdsvis7, 8.
I mellemtiden, fluorescens påvisning følsomhed er ideel til at analysere lav-overflod proteiner og det lille antal celler. Enkelt molekyle fluorescens imaging er en af de mest følsomme metoder, der tillader detektering af individuelle fluorescerende farvestoffer og mærket proteiner i in vitro og in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anvendelsen af denne billedmetoden til elektroforese-baserede proteomet analyse forventes at aktivere meget følsomme og kvantitative analyser af tælle enkelte fluorescently mærket proteiner. Men det er fortsat uklart, om mærkning med fluorescerende farvestoffer er homogene nok på tværs af alle proteinmolekyler, og hvordan denne homogenitet påvirkes af forskellige protein arter (figur 1). Simpel bulk løsning målinger kan bruges til at opnå en kindtand forholdet mellem fluorescerende farvestoffer til proteiner kaldet 'kobling effektivitet'8 eller 'mærkning effektivitet', men denne egenskab indeholder ikke oplysninger om homogeniteten af mærkning blandt proteinmolekyler.
Her beskriver vi protokol for en analyse at undersøge den mærkning ensartethed for alle arter, protein i cellen (figur 2)16. De to vigtigste skridt i denne analyse er protein oprensning og billedbehandling. I det første trin, alle proteiner i cellerne navngives fluorescently og biotinylated, derefter udvundet separat ved hjælp af gelelektroforese efterfulgt af electroelution. I det andet trin evalueres fluorescens egenskaberne for individuelle proteinmolekyler i de ekstraherede prøver baseret på enkelt molekyle billeddannelse. Fra disse data, parametre vigtigt for tælle analyse, som procentdelen af proteiner markeret med en mindst en farve, som vi kalder mærkning belægning (LO)16, og det gennemsnitlige antal fluorescerende farvestoffer bundet til en enkelt protein molekyle (n̄ farvestof), kan karakteriseres. I protokollen, en optimeret procedure for mærkning HeLa celler proteomet med NHS ester-baserede Cyanine 3 (Cy3) farvestof er præsenteret som et eksempel, og kan ændres med andre mærkning procedurer i overensstemmelse med ønskede forskningsmål.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Celle proteomes er ofte karakteriseret ved hjælp af elektroforese assays, hvor alle arter af proteiner i cellerne er ikke specielt mærket med et fluorescerende farvestof og er spottet af en fotodetektor efter deres adskillelse. Enkelt molekyle fluorescens imaging kan give ultrasensitive protein detection med sin evne til at visualisere individuelle fluorescerende molekyler. Anvendelsen af denne kraftfulde billedmetoden til elektroforese assays hæmmes imidlertid af manglen på måder at karakterisere homogeniteten af fluorescerende mærkning af hvert protein arter på tværs af proteomet. Her udviklede vi en metode til at vurdere den mærkning homogenitet på tværs af proteomet baseret på et enkelt molekyle fluorescens imaging assay. I vores måling ved hjælp af en HeLa cell sample, andelen af proteiner markeret med mindst ét farvestof, som vi kalder 'mærkning belægning' (LO), var fast besluttet på at vifte fra 50% til 90%, støtte det høje potentiale af anvendelsen af enkelt molekyle imaging til følsom og præcis proteomet analyse.

Figur 4 repræsenterer rå billeddata til forskellige molekylvægt brøkdele af proteiner fra HeLa celle lysate, såvel som den positive og den negative kontrol. Mens både protein prøve og positiv kontrol udstille 100-500 steder pr billede, viser den negative kontrol ingen eller et par steder, viser, at protokollen tilstrækkeligt hæmmer ikke-specifik binding af farvestoffer til coverslip overflade. Spot intensitet histogrammer for protein prøver og den p...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere den mærkning ensartethed for hvert protein arter i et komplekst protein prøve på enkelt-molekyle niveau.

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Denne metode viser kalibrering af kvantificering protein mængden i flydende prøve med enkelt-molekyle proces til optælling. Specifikt kan det illustrere, hvordan proteinpopulationer kan fluorescentt mærkes på hvert molekyleniveau. Tidligere metoder udført bulk målinger til at analysere molar nøgletal af fluorescerende og protein molekyler, men de kan ikke afsløre, hvordan heterogent protein populationer er faktisk mærket.Vores metoder kan gøre det direkte på enkeltmolekyleniveau. Vores metode kan udvides til ultrasensitive og avancerede molekylære koncentrationsanalyser, hvilket vil føre til fremtidige diagnostiske metoder, der muliggør effektive fund af patogene molekyler i prøver. Vores metode kan anvendes på enkelt protein arter analyse ved hjælp af fluorescerende antistoffer, samt flere arter analyse ved hjælp af ikke-specifikke etiketter for alle proteiner adskilt af elektroforese eller kromatografi.Det mest kritiske punkt i teknikken er at opnå data reproducerbarhed. Jeg anbefaler at holde den samme eksperimentelle tilstand så meget som muligt, når man måler flere prøver. Visuel demonstration af denne teknik vil give, hvordan man kan gøre hvert eksperimentelt trin stabilt og reproducerbart.Det vil også vise nogle ualmindelige skridt i biokemi protokoller, såsom spin-belægning og vask af mikroskop coverslips. For at starte denne procedure skal du forberede lysingbufferen og 1%Tween-20 som beskrevet i tekstprotokollen. Brug natriumhydroxid til at justere pH til 12.Bland 100 mikroliter lysing buffer med en microliter af en kindtand DDT og fire mikroliter på 50% CHAPS. Tilføj en mikroliter af den forberedte cellekultur og homogenisere opløsningen ved langsom pipettering for at undgå bobler. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i fem minutter med let omrøring.Derefter rehomogenize opløsningen ved pipetting det op og ned langsomt. Tilføj et mikrogram Cy3 NHS ester farvestof og homogenisere opløsningen ved at bremse pipettering for at undgå bobler. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 10 minutter med let omrøring.Gentag denne proces, tilsæt den samme mængde farvestof og inkubering af prøven én gang. Der tilsættes 100 mikroliter på 0,8 molar HEPES-natriumhydroxid for at justere opløsningens pH-pH til 7,2 og for at slukke reaktionen. Langsomt pipette op og ned for at homogenisere opløsningen.Dernæst tilsættes 20 mikroliter Biotin-2-aamine og fem mikroliter af EDC. Homogeniser opløsningen ved at pipettere langsomt op og ned. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i en time med blid omrøring.Derefter skal du bruge en ultrafiltreringskolonne med en 10 kiloDalton cutoff til at fjerne eventuelle ureagerede etiketteringsgenskabere og koncentrere prøven. Efter at have udført standard SDS-PAGE for proteinprøven og en molekylær stige, skal du afbilde gelen for at identificere placeringen af proteinbåndene. Brug en skarp klinge til at skære gel portioner, der omfatter protein fraktioner af interesse baseret på båndene'locations.Først, der er fastsat coverslips, der er 22 millimeter med 22 millimeter og er 0,15 millimeter tyk. Brug et plasmarenser til at udsætte dækslerne for luftplasma i et minut for at rengøre og aktivere deres overflader. Brug derefter en spin coater til at dreje betræksæberne med 200 mikroliter af avadin buffer i fem sekunder ved 500RPM, efterfulgt af 30 sekunder ved 1000RPM.Inkuber dækslerne ved stuetemperatur i 15 minutter for at lade dem lufttørre. For at forberede dækslæber til proteinprøven skal du bruge en proteinprøve, der er blevet fortyndet. Placer 100 mikroliter af den fortyndede prøve på midten af de avadinbelagte dækslæber.Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter. For at forberede den positive kontrol skal der anvendes 100 mikroliter af renset fluorescerende biotin i fem mikromolar HEPES-natriumhydroxid ved pH 7.2 i midten af en avadinbelagt dæksel. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter.For at forberede den negative kontrol, spin coat plasma coverslips med 200 mikroliter af fem HEPES-natriumhydroxid med to milligram pr. milliliter BSA uden avadin. Der tilsættes 100 mikroliter til renset fluorescerende biotin i fem mikromolar HEPES-natriumhydroxid ved pH 7.2. Inkuberes i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur.Derefter skylles hver dækslæd med 200 mikroliter destilleret vand ved at pipettere i kanterne, og sørg for ikke at røre ved midten af dækslæbet med pipettenspidsen. Gentag denne vask tre gange. Derefter udsætte et tilsvarende antal nye coverslips til luftplasma i et minut.Placer en renset dækslæd på toppen af hver prøve-bundet coverslip for at undgå tørring. Start et bredt felt eller evanescent felt fluorescens mikroskop. Sæt en dækslæb på mikroskopet og find fokus.Udfør derefter en feltscanning for at få mindst 100 billeder. I denne undersøgelse kvantificeres mærkningshomogeniteten for hver mærket proteinart i celler efter adskillelse med SDS-PAGE. De rå billeddata for forskellige molekylvægtfraktioner af proteiner fra HeLa-cellelysatet samt de positive og negative kontroller ses her.Mens både proteinprøven og den positive kontrol udviser mellem 100 og 500 pletter pr. billede, udviser den negative kontrol meget få til ingen. Dette viser, at processen i tilstrækkelig grad hæmmer ikke-specifik binding af farvestoffer til dækslædens overflade. Spotintensitetshistogrammer for proteinprøverne og den positive kontrol præsenterer flere toppe, som repræsenterer den stokastiske binding af farvestoffer til henholdsvis primære aminer i proteiner og avadin tetramerstrukturer.Alle pletter viste blinkende og trinvis fotobleaching med kontinuerlig laser excitation, fremhæver observation på enkelt molekyle niveau. Mærkningsbelægningen eller LO beregnes derefter ud fra forholdet mellem antallet af pletter i hver proteinprøve og forholdet i den positive kontrol. LO målt fra HeLa-cellelyatprøven varierer fra 50 % for den mindre molekylvægtfraktion til 90 % for den højere molekylvægtfraktion.LO for hele proteomprøven uden adskillelse ses at være 72%Det er vigtigt at anvende nyfremstillede reagenser og for at undgå støv, især under klargøringslip. Efter denne procedure kan der udføres en enkelt molekyletællingsanalyse i et bestemt volumen for at kvantificere hvert proteins koncentrationer. For eksempel kan der udføres analyser af ethvert råprodukt eller gel- og kapillærelektroforeseprodukter.Denne teknik baner vejen for at udnytte enkelt molekyle fluorescens imaging til molekylær medicin, organisk kemi, og omics analyse. Ved at bygge bro mellem koncentration og tal. Koncentreret natriumhydroxid er ætsende, og der skal bæres tilstrækkelig beskyttelse ved håndtering af den.Også, høj effekt laserstråling kan forårsage øjenskader, så beskyttelsesbriller kan bæres.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturel Oplysninger fra Single-molekyle FRET Eksperimenter Brug af Fast Nano-positionering System

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Prøve Multiplexing af væv under anvendelse kombinerede Precursor isotopmærkning og isobar Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...