Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
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Les auteurs remercient Masae Ohno et Kazuya Nishimura de conseils et d’assistance expérimentale. Ce travail a été soutenu par PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, subventions pour jeunes chercheurs (A) (24687022), contestant la recherche exploratoire (26650055) et la recherche scientifique sur les domaines innovants (23115005), la Japan Society for la Promotion de la Science et par des subventions de la Takeda Science Foundation et la fondation du mémorial Mochida à usage médical et la recherche pharmaceutique. S.L. reconnaît le soutien du programme RIKEN International programme Associate (IPA).

1. préparation de la cellule
<ol><li>Cultiver des cellules HeLa dans un plat de 10 cm à 37 ° C moins de 5 % de CO2 dans Dulbecco de l’aigle modifié contenant 10 % sérum de veau fœtal.</li>
	<li>Prélever des cellules exponentiellement croissants que lorsqu’ils ont atteint 70 % confluence, suivant les instructions de ATCC17.<ol>
<li>Rincer les cellules avec 5 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4). Supprimer les PBS.</li>
		<li>Ajouter 1 mL d’ac...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Cet article décrit un protocole afin de quantifier l’homogénéité étiquetage de chaque espèce de protéines marquées dans les cellules après la séparation avec SDS-PAGE (étape 3). La méthode de séparation peut être substituée avec d’autres méthodes comme la chromatographie en phase liquide ou électrophorèse capillaire, permettant la séparation et le fractionnement des protéines cellulaires à haute résolution, tout en nécessitant un équipement spécial23. La méthode étiq...

Analyse du protéome, qui vise à quantifier l’ensemble des molécules de protéines exprimées dans la cellule, est une approche utile dans les études biologiques et pharmaceutiques actuelles. Cette analyse s’appuie généralement sur la spectrométrie de masse, qui identifie les espèces de protéines issus des spectres générées par l’intermédiaire de protéines ionisation1,2,3. Une autre méthode d’analyse du protéome est l’électrophorèse, y compris l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), l’électrophorèse capillaire et l’électrophorèse sur gel en deux dimensions (2D). Cette méthode repose sur le marquage fluorescent non spécifique de toutes les molécules de protéine dans les cellules analysées, suivies de la séparation par électrophorèse et de détection et de quantification de chaque espèce de protéine. Pour atteindre l’étiquetage requis des protéines non spécifiques, une stratégie consiste à utiliser des colorants fluorescents qui peuvent se lier aux protéines via des interactions électrostatiques et hydrophobes, comme le bleu de Coomassie et Sypro Ruby4,5,6 . Une autre stratégie consiste à utiliser le marquage covalent avec colorants contenant de l’ester N-hydroxysuccinimide (NHS) ou maléimide, qui peut lier par liaison covalente à des protéines par le biais de résidus communs tels que les amines primaires et thiols, respectivement7, 8.
Pendant ce temps, la sensibilité de détection de fluorescence est idéale pour l’analyse des protéines de faible abondance et un petit nombre de cellules. Imagerie de fluorescence des molécules simples est une des méthodes plus sensibles qui permet la détection des colorants fluorescents individuels et des protéines marquées in vitro et in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Application de cette méthode d’imagerie pour l’analyse protéomique axée sur l’électrophorèse est prévue pour permettre des essais hautement sensibles et quantitatives en comptant les différentes protéines fluorescent marquées. Cependant, on ne sait si l’étiquetage avec les colorants fluorescents est assez homogène dans l’ensemble de toutes les molécules de protéines, et comment cette homogénéité est affectée par des espèces de protéines différentes (Figure 1). Mesures de solution simple en vrac peuvent être utilisées pour obtenir un rapport molaire de colorants fluorescents aux protéines appelées « efficacité de couplage »8 « étiquetage efficacité », mais cette propriété ne fournit pas d’information sur l’homogénéité de l’étiquetage des molécules de protéines.
Nous décrivons ici le protocole pour un dosage d’enquêter sur l’homogénéité d’étiquetage pour toutes les espèces de protéines dans la cellule (Figure 2)16. Les deux principales étapes de ce test sont l’imagerie et purification des protéines. Dans la première étape, toutes les protéines dans les cellules sont étiquetés fluorescent et biotinylés, puis extrait séparément à l’aide de l’électrophorèse sur gel suivie par électroélution. Dans la deuxième étape, les propriétés de fluorescence des molécules de protéines individuelles dans les échantillons extraits sont évaluées basées sur l’imagerie seule molécule. Partir de ces données, paramètres importants pour l’analyse de l’inventaire, tels que le pourcentage de protéines marquées avec un moins un colorant, qui nous appelons étiquetage occupation (LO)16, et le nombre moyen de colorants fluorescents lié à une molécule de protéine unique (n̄ colorant), peuvent être caractérisés. Dans le protocole, une procédure optimisée pour l’étiquetage du protéome de cellules HeLa avec colorant de Cyanine 3 (Cy3) base d’esters NHS est présentée à titre d’exemple et peut être modifiée avec d’autres procédures d’étiquetage selon les objectifs de recherche désiré.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Cellule protéomes sont souvent caractérisées à l’aide de tests d’électrophorèse, où toutes les espèces de protéines dans les cellules sont non spécifiquement étiquetés avec un colorant fluorescent et sont repérés par un photodétecteur après leur séparation. Imagerie de fluorescence seule molécule peut fournir détection ultrasensible de protéines grâce à sa capacité de visualisation de molécules fluorescentes individuels. Toutefois, l’application de cette méthode d’imagerie puissante aux déterminations de l’électrophorèse est entravée par le manque de moyens pour caractériser l’homogénéité du marquage fluorescent de chaque espèce de protéines à travers le protéome. Ici, nous avons développé une méthode pour évaluer l’homogénéité d’étiquetage dans l’ensemble du protéome basé sur un test d’imagerie de fluorescence seule molécule. Dans notre mesure en utilisant un échantillon de cellules HeLa, la proportion de protéines marquées au moins un colorant, qui nous appelé « étiquetage occupation » (LO), était déterminé à gamme de 50 à 90 %, soutenant le potentiel élevé de l’application de l’imagerie de la seule molécule à analyse du protéome sensible et précis.

Figure 4 représente les données d’image raw pour les fractions de différents poids moléculaires des protéines des cellules HeLa lysat, ainsi que les témoins positifs et négatifs. Bien que l’échantillon de protéine et positif contrôlent pièce 100 – 500 places par image, contrôle négatif affiche aucun ou quelques taches, montrant que le protocole inhibe suffisamment non-spécifiques des colorants à la surface de la lamelle couvre-objet. Spot...

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Cette méthode démontre l’étalonnage de la quantité de protéines quantifiantes dans l’échantillon liquide avec un processus de molécule unique pour le comptage. Plus précisément, il peut illustrer comment les populations de protéines peuvent être étiquetées fluorescentement à chaque niveau de molécule. Les méthodes précédentes ont effectué des mesures en vrac pour analyser les ratios molaire des molécules fluorescentes et protéiques, mais elles ne peuvent pas révéler comment les populations hétérogènes de protéines sont effectivement étiquetées.Nos méthodes peuvent le faire directement au niveau d’une molécule unique. Notre méthode peut être étendue aux analyses de concentration moléculaire ultrasensibles et avancées, qui mèneront aux méthodes diagnostiques futures, permettant des résultats efficaces des molécules pathogènes dans les spécimens. Notre méthode peut être appliquée à l’analyse des espèces de protéines à l’aide d’anticorps fluorescents, ainsi qu’à l’analyse de plusieurs espèces à l’aide d’étiquettes non spécifiques pour toutes les protéines séparées par électrophoresis ou chromatographie.Le point le plus critique de la technique est l’obtention de la reproductibilité des données. Je recommande de garder la même condition expérimentale autant que possible lors de la mesure de plusieurs échantillons. Démonstration visuelle de cette technique fournira comment rendre chaque étape expérimentale stable et reproductible.Il montrera également une certaine étape rare dans les protocoles de biochimie, tels que le spin-enduit et le lavage des couvertures de microscope. Pour commencer cette procédure, préparez le tampon de lysing et 1%Tween-20 tel que décrit dans le protocole de texte. Utilisez de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 12.Mélangez 100 microlitres de tampon de lysing avec un microlitre d’un DDT molaire et quatre microlitres de 50%CHAPS. Ajoutez un microlitre de la culture cellulaire préparée et homogénéisez la solution en letant le pipetting pour éviter les bulles. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant cinq minutes avec une légère agitation.Ensuite, réhomogènez la solution en la pipetage de haut en bas lentement. Ajouter un microgramme de colorant Cy3 NHS ester et homogénéiser la solution en ralentissant le pipetage pour éviter les bulles. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes avec une légère agitation.Répétez ce processus, en ajoutant la même quantité de colorant et en couveant l’échantillon une fois. Ajouter 100 microlitres d’hydroxyde HEPES-sodium molaire de 0,8 molaire pour ajuster le pH de la solution à 7,2 et étancher la réaction. Pipette lentement de haut en bas pour homogénéiser la solution.Ensuite, ajoutez 20 microlitres de biotine-2-amine et cinq microlitres d’EDC. Homogénéisez la solution en faisant monter et descendre lentement. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure avec une légère agitation.Après cela, utilisez une colonne d’ultrafiltration avec une coupure de 10 kiloDalton pour enlever les réetrions d’étiquetage non réagis et concentrer l’échantillon. Après avoir effectué la norme SDS-PAGE pour l’échantillon de protéines et une échelle moléculaire, imagez le gel pour identifier l’emplacement des bandes protéiques. Utilisez une lame tranchante pour découper les portions de gel qui comprennent des fractions de protéines d’intérêt en fonction de l’emplacement des bandes.Tout d’abord, définissez des glissements de couverture de 22 millimètres par 22 millimètres et d’une épaisseur de 0,15 millimètre. Utilisez un nettoyant plasma pour exposer les coverslips au plasma d’air pendant une minute pour nettoyer et activer leurs surfaces. Ensuite, utilisez un revêtement spin pour faire tourner les coverslips avec 200 microlitres de tampon avadin pendant cinq secondes à 500RPM, suivie de 30 secondes à 1000RPM.Incuber les coverslips à température ambiante pendant 15 minutes pour les laisser sécher à l’air libre. Pour préparer des coverslips pour l’échantillon de protéine, utilisez un échantillon de protéine qui a été dilué. Placer 100 microlitres de l’échantillon dilué sur le centre des couvre-t-ils recouverts d’avadin.Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Pour préparer le contrôle positif, placez 100 microlitres de biotine fluorescente purifiée dans cinq hydroxyde micromolaire HEPES-sodium au pH 7.2 au centre d’un coverslip recouvert d’avadin. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.Pour préparer le contrôle négatif, spin coat plasma coverslips avec 200 microlitres de cinq hydroxyde HEPES-sodium avec deux milligrammes par millilitre de BSA sans avadin. Ajouter 100 microlitres à la biotine fluorescente purifiée dans cinq hydroxyde micromolaire HEPES-sodium au pH 7,2. Incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante.Après cela, rincer chaque coverslip avec 200 microlitres d’eau distillée par pipetting sur les bords, en s’assurant de ne pas toucher le milieu de la coverslip avec la pointe pipette. Répétez ce lavage trois fois. Ensuite, exposez un nombre égal de nouvelles couvertures au plasma d’air pendant une minute.Placez un coverslip nettoyé sur chaque coverslip lié à l’échantillon pour éviter le séchage. Démarrez un microscope à fluorescence à champ large ou évanescent. Réglez un coverslip sur le microscope et trouvez la mise au point.Ensuite, effectuez un balayage de tuile pour obtenir au moins 100 images. Dans cette étude, l’homogénéité d’étiquetage de chaque espèce de protéine étiquetée dans les cellules est quantifiée après séparation avec SDS-PAGE. Les données brutes d’image pour différentes fractions de poids moléculaire des protéines du lysate de cellules HeLa, ainsi que les contrôles positifs et négatifs, sont vus ici.Bien que l’échantillon de protéines et le contrôle positif présentent entre 100 et 500 taches par image, le contrôle négatif présente très peu ou pas. Cela montre que le processus inhibe suffisamment la liaison non spécifique des tétines à la surface du coverslip. Les histogrammes d’intensité ponctuelle pour les échantillons de protéines et le contrôle positif présentent de multiples pics, qui représentent la liaison stochastique des tétines aux amines primaires dans les protéines et les structures de tétramer d’avadin respectivement.Tous les spots ont montré des photobleaching clignotants et stepwise avec l’excitation continue de laser, mettant en évidence l’observation au niveau simple de molécule. L’occupation de l’étiquetage, ou LO, est ensuite calculée à partir du rapport entre le nombre de taches dans chaque échantillon de protéines et celui du contrôle positif. Le LO mesuré à partir de l’échantillon de lysate de cellules HeLa varie de 50% pour la plus petite fraction de poids moléculaire, à 90% pour la fraction de poids moléculaire plus élevée.Le LO pour l’échantillon protéome entier sans séparation est considéré comme 72%Il est essentiel d’utiliser des réaménageurs fraîchement faits et d’éviter toute poussière, en particulier pendant la préparation des coverslips. À la suite de cette procédure, une seule molécule comptant l’analyse dans un certain volume peut être effectuée pour quantifier les concentrations de chaque protéine. Par exemple, l’analyse sur n’importe quel produit brut, ou gel et produits d’électrophoresis capillaires, peut être effectuée.Cette technique ouvre la voie à l’utilisation de l’imagerie par fluorescence à molécule unique à la médecine moléculaire, à la chimie organique et à l’analyse omique. En comblant le concept entre concentration et nombres. L’hydroxyde de sodium concentré est corrosif, et une protection adéquate doit être portée lors de sa manipulation.En outre, le rayonnement laser de haute puissance peut causer des dommages oculaires, ainsi les lunettes protectrices peuvent être portées.

Research

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Biochemistry

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