Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
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Die Autoren danken Masae Ohno und Kazuya Nishimura für experimentelle Unterstützung und Beratung. Diese Arbeit wurde von PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, Grants-in-aid für junge Wissenschaftler (A) (24687022), anspruchsvolle Pionierforschung (26650055) und wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (23115005), Japan Society for unterstützt. die Förderung der Wissenschaft und durch Zuschüsse von der Takeda Science Foundation und der Mochida Memorial Foundation für medizinische und pharmazeutische Forschung. S.l. räumt Unterstützung aus dem Programm von RIKEN International Programm zuordnen (IPA).

1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>HeLa-Zellen in einer 10 cm Petrischale bei 37 ° C kultivieren unter 5 % CO2 in Dulbecco modifizierten Adlerhorst 10 % fötalen Rinderserum-haltigem Medium.</li>
	<li>Exponentiell wachsende Zellen zu sammeln, sobald sie 70 % Konfluenz, nach ATCC Anweisungen17erreicht haben.<ol>
<li>Spülen Sie die Zellen mit 5 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4). PBS zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL 0,1 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic S?...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität der einzelnen markierten Protein-Arten in den Zellen nach der Trennung mit SDS-PAGE (Schritt 3) zu quantifizieren. Das Trennverfahren kann mit anderen Methoden wie flüssige Chromatographie oder Kapillarelektrophorese, ersetzt werden, die Trennung und Fraktionierung von zellulären Proteinen mit hoher Auflösung erfordert spezielle Ausrüstung23ermöglichen. Die Kennzeichnung Methode mit NHS-Ester in das aktuelle Protoko...

Proteomanalyse, deren Ziel es ist, die Gesamtheit der Protein-Moleküle in die Zelle ausgedrückt zu quantifizieren, ist ein wertvoller Ansatz an aktuellen biologischen und medizinischen Studien. Diese Analyse basiert häufig auf Massenspektrometrie, die Protein-Arten anhand der Spektren erzeugt durch Protein Ionisation1,2,3identifiziert. Eine alternative Methode für Proteomanalyse ist Elektrophorese, einschließlich Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), Kapillarelektrophorese und zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese. Diese Methode beruht auf unspezifischen fluoreszierende Kennzeichnung der Protein-Moleküle in den analysierten Zellen, gefolgt von elektrophoretischen Trennung und Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Protein-Arten. Zur Erreichung der erforderlichen unspezifische Protein-Kennzeichnung ist eine Strategie, fluoreszierende Farbstoffe zu verwenden, die an Proteine über elektrostatische und hydrophobe Interaktionen, wie Coomassie Blau und Sypro-Ruby4,5,6 binden können . Eine alternative Strategie ist mit kovalente Kennzeichnung mit Farbstoffen mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester oder Maleimide, die kovalent an Proteine durch gemeinsame Rückstände wie primäre Amine und Thiole binden kann, bzw.7, 8.
Unterdessen ist die Nachweisempfindlichkeit Fluoreszenz ideal für Low-Fülle Proteine und kleine Anzahl von Zellen zu analysieren. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung ist eines der empfindlichsten Methoden, die ermöglicht die Erkennung von einzelnen fluoreszierende Farbstoffe und markierte Proteine in Vitro und in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anwendung dieser bildgebenden Methode Elektrophorese basierenden Proteomanalyse wird voraussichtlich hochsensiblen und quantitativen Assays ermöglichen durch individuelle Fluoreszent-markierten Proteinen zählen. Es bleibt unklar, ob Beschriftung mit Fluoreszenzfarbstoffen homogen genug über die Proteinmoleküle ist, und wie diese Homogenität von verschiedenen Protein-Arten (Abbildung 1) betroffen ist. Einfache Masse Lösung Messungen können verwendet werden, um einem Molverhältnis von Fluoreszenzfarbstoffen, Proteine, sogenannte "Kupplung Effizienz"8 oder "Beschriftung Effizienz" zu erhalten, aber diese Eigenschaft liefert keine Informationen über die Homogenität der Beschriftung unter Protein-Moleküle.
Hier beschreiben wir das Protokoll für eine Probe zu untersuchen, die Kennzeichnung Homogenität für alle Arten von Protein in der Zelle (Abbildung 2)16. Die zwei wichtigsten Schritte des Assays sind Proteinreinigung und Bildgebung. Im ersten Schritt alle Proteine in den Zellen sind Eindringmittel beschriftet und biotinylierte, dann extrahiert separat mit Gelelektrophorese gefolgt von Electroelution. Im zweiten Schritt sind Fluoreszenzeigenschaften von einzelnen Protein-Moleküle in den entnommenen Proben anhand des Einzelmolekül-Bildgebung. Aus diesen Daten, Parameter, die wichtig für die Zählung Analyse, wie z. B. der Anteil der Proteine mit mindestens einem beschriftet färben, die wir fordern Kennzeichnung Auslastung (LO)16, und die durchschnittliche Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gebunden an ein einziges Protein-Molekül (N̄ Farbstoff), charakterisiert werden können. In das Protokoll ein optimiertes Verfahren zur Kennzeichnung der HeLa-Zelle Proteome mit NHS Ester-basierte Cyanin 3 (Cy3) Farbstoff wird exemplarisch dargestellt und kann mit anderen Kennzeichnung Verfahren nach gewünschten Forschungsziele geändert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Zelle Proteome zeichnen sich oft mit Elektrophorese-Assays, wo alle Arten von Proteinen in den Zellen sind unspezifisch mit einer Leuchtstofffärbung beschriftet und sind von einem Photodetektor nach ihrer Trennung entdeckt. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung bieten Gromer Proteindetektion mit seiner Fähigkeit zur Visualisierung von einzelnen fluoreszierende Moleküle. Allerdings wird die Anwendung dieser leistungsstarke bildgebende Methode Elektrophorese-Assays durch den Mangel an Möglichkeiten, um die Homogenität der fluoreszierenden Kennzeichnung der einzelnen Protein-Arten über das Proteom charakterisieren behindert. Hier haben wir eine Methode zur Evaluierung der Kennzeichnung Homogenität über das Proteom basierend auf ein einzelnes Molekül Fluoreszenz imaging Assay entwickelt. In unserer Messung mit Hilfe einer Stichprobe von HeLa-Zelle, der Anteil der Proteine, die mit mindestens einem Farbstoff, der wir genannt "Kennzeichnung Belegung" beschriftet (LO), war entschlossen, Auswahl von 50 % bis 90 %, das hohe Potenzial der Anwendung der Einzelmolekül-Bildgebung zu unterstützen sensibel und präzise Proteomanalyse.

Abbildung 4 stellt raw-Bilddaten für Bruchteile von unterschiedlichem Molekulargewicht der Proteine von HeLa-Zelle lysate, sowie die positive und negative Kontrolle. Während der Protein-Probe und Positive Ausstellung 100 – 500 Punkte pro Bild steuern, zeigt die negative-Kontrolle keine oder wenige stellen, zeigen, dass das Protokoll ausreichend unspezifische Bindung der Farbstoffe auf der Oberfläche des Deckglases hemmt. Vor Ort Intensität Histogramme f...

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Diese Methode demonstriert die Kalibrierung der Quantifizierung der Proteinmenge in flüssigen Proben mit einem Einzelmolekülverfahren zum Zählen. Insbesondere kann es veranschaulichen, wie Proteinpopulationen auf jeder Molekülebene fluoreszierend gekennzeichnet werden können. Frühere Methoden führten Massenmessungen durch, um molare Verhältnisse von fluoreszierenden und Proteinmolekülen zu analysieren, aber sie können nicht aufzeigen, wie heterogen Proteinpopulationen tatsächlich gekennzeichnet sind.Unsere Methoden können es direkt auf der Einmolekülebene tun. Unsere Methode kann auf ultrasensible und fortgeschrittene molekulare Konzentrationstests ausgedehnt werden, was zu zukünftigen diagnostischen Methoden führen wird, die effiziente Ergebnisse pathogener Moleküle in Proben ermöglichen. Unsere Methode kann auf die Analyse einzelner Proteinarten mit fluoreszierenden Antikörpern sowie auf die Analyse mehrerer Arten mit unspezifischen Etiketten für alle durch Elektrophorese oder Chromatographie getrennten Proteine angewendet werden.Der kritischste Punkt der Technik ist die Reproduzierbarkeit von Daten. Ich empfehle, den gleichen experimentellen Zustand so weit wie möglich bei der Messung mehrerer Proben zu halten. Die visuelle Demonstration dieser Technik wird zeigen, wie jeder experimentelle Schritt stabil und reproduzierbar wird.Es wird auch einige ungewöhnliche Schritte in der Biochemie Protokolle zeigen, wie die Spin-Beschichtung und Waschen von Mikroskop Abdeckungen. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens den Lysingpuffer und 1%Tween-20 wie im Textprotokoll beschrieben vor. Verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 12 einzustellen.Mischen Sie 100 Mikroliter Lysingpuffer mit einem Mikroliter eines Molaren DDT und vier Mikroliter 50%CHAPS. Fügen Sie einen Mikroliter der vorbereiteten Zellkultur hinzu und homogenisieren Sie die Lösung durch langsames Pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit sanfter Rührung.Rehomogenisieren Sie dann die Lösung, indem Sie sie langsam nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie ein Mikrogramm Cy3 NHS EsterFarbstoff hinzu und homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie die Pipettierung verlangsamen, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit sanfter Rührung.Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die gleiche Menge Farbstoff hinzufügen und die Probe einmal inkubieren. Fügen Sie 100 Mikroliter 0,8 Mol HEPES-Natriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung auf 7,2 einzustellen und die Reaktion zu löschen. Langsam Pipetten nach oben und unten, um die Lösung zu homogenisieren.Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter Biotin-2-Amin und fünf Mikroliter EDC hinzu. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde mit sanfter Rührung.Verwenden Sie danach eine Ultrafiltrationssäule mit einem 10-Kilo-Dalton-Cutoff, um unreagierte Etikettierungsreagenzien zu entfernen und die Probe zu konzentrieren. Nach der Ausführung von Standard-SDS-PAGE für die Proteinprobe und einer molekularen Leiter, bilde das Gel ab, um die Position der Proteinbänder zu identifizieren. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um die Gelportionen auszuschneiden, die Proteinfraktionen enthalten, die auf den Standorten der Bänder basieren.Legen Sie zunächst Abdeckungen fest, die 22 mal 22 Millimeter groß und 0,15 Millimeter dick sind. Verwenden Sie einen Plasmareiniger, um die Abdeckungen für eine Minute dem Luftplasma auszusetzen, um ihre Oberflächen zu reinigen und zu aktivieren. Als nächstes verwenden Sie einen Spin Coater, um die Abdeckungen mit 200 Mikroliter Avadin-Puffer für fünf Sekunden bei 500RPM zu schichten, gefolgt von 30 Sekunden bei 1000U/min.Inkubieren Sie die Abdeckungen bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um sie an der Luft trocknen zu lassen. Verwenden Sie zur Herstellung von Coverlips für die Proteinprobe eine Proteinprobe, die verdünnt wurde. 100 Mikroliter der verdünnten Probe auf die Mitte der avadinbeschichteten Abdeckungen legen.Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Zur Vorbereitung der Positivkontrolle 100 Mikroliter gereinigtes fluoreszierendes Biotin in fünf mikromolareHEPES-Natriumhydroxid bei pH 7,2 in die Mitte eines avadinbeschichteten Abdeckrutsches geben. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten.Zur Vorbereitung der Negativkontrolle, Spin-Schicht-Plasma Abdeckungenmitlipsmitlips mit 200 Mikroliter von fünf HEPES-Natriumhydroxid mit zwei Milligramm pro Milliliter BSA ohne Avadin. Fügen Sie 100 Mikroliter zu gereinigtem fluoreszierendem Biotin in fünf mikromolarem HEPES-Natriumhydroxid bei pH 7,2 hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Danach spülen Sie jeden Deckelschlupf mit 200 Mikroliter destilliertem Wasser durch Pipettieren an den Rändern, um sicherzustellen, dass die Mitte des Deckels nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Setzen Sie dann eine Minute lang eine gleiche Anzahl neuer Abdeckungen dem Luftplasma aus.Legen Sie einen gereinigten Deckelaufschlag auf jeden probengebundenen Deckel, um eine Trocknung zu vermeiden. Starten Sie ein Weitfeld- oder Evaneszenzfluoreszenzmikroskop. Stellen Sie einen Deckelschlupf auf das Mikroskop und finden Sie den Fokus.Führen Sie dann einen Kachelscan durch, um mindestens 100 Bilder zu erhalten. In dieser Studie wird die Kennzeichnungshomogenität jeder markierten Proteinart in Zellen nach Trennung mit SDS-PAGE quantifiziert. Die Rohbilddaten für verschiedene Molekulargewichtsfraktionen von Proteinen aus HeLa-Zelllysat sowie die positiven und negativen Kontrollen sind hier zu sehen.Während sowohl die Proteinprobe als auch die Positivkontrolle zwischen 100 und 500 Flecken pro Bild aufweisen, weist die Negativkontrolle nur sehr wenige bis gar keine auf. Dies zeigt, dass der Prozess die unspezifische Bindung von Farbstoffen an die Deckgerade ausreichend hemmt. Spot-Intensitätshistogramme für die Proteinproben und die Positivkontrolle stellen mehrere Spitzen dar, die die stochastische Bindung von Farbstoffen an primäre Amen in Proteinen bzw. Avadin-Tetramerstrukturen darstellen.Alle Flecken zeigten blinkendes und stufenweises Photobleaching mit kontinuierlicher Lasererregung, wobei die Beobachtung auf der Ebene des einzelnen Moleküls hervorgehoben wurde. Die Etikettierungsbelegung oder LO wird dann aus dem Verhältnis der Anzahl der Flecken in jeder Proteinprobe zu dem in der Positivkontrolle berechnet. Die aus der HeLa-Zelllysatprobe gemessene LO reicht von 50 % für die kleinere Molekulargewichtsfraktion bis zu 90 % für die Fraktion mit höherem Molekulargewicht.Die LO für die gesamte Proteomprobe ohne Trennung ist 72%Es ist wichtig, frisch hergestellte Reagenzien zu verwenden und Staub zu vermeiden, insbesondere bei der Herstellung der Deckellipsen. Nach diesem Verfahren kann eine Analyse der Einzelmolekülzählung in einem bestimmten Volumen durchgeführt werden, um die Konzentrationen jedes Proteins zu quantifizieren. Beispielsweise kann eine Analyse an jedem Rohprodukt oder Gel- und Kapillarelektrophoreseprodukten durchgeführt werden.Diese Technik ebnet den Weg für die Verwendung von Einzelmolekülfluoreszenz-Bildgebung für molekulare Medizin, organische Chemie und Omics-Analyse. Durch überbrücken des Konzepts zwischen Konzentration und Zahlen. Konzentriertes Natriumhydroxid ist korrosiv, und bei der Handhabung sollte ein ausreichender Schutz getragen werden.Auch Hochleistungs-Laserstrahlung kann Augenschäden verursachen, so schutzweise Brille nimmern.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Forschung

Biochemie

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...