Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

המחברים מודים Masae אונו, Kazuya נישימורה על ניסיוני סיוע וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי אוטם (JPMJPR15F7), יפן המדע, הטכנולוגיה סוכנות, Grants-in-aid יאנג מדענים (א) (24687022), מאתגר מחקר גישוש (26650055) של מחקר מדעי בתחומים חדשניים (23115005), יפן האגודה קידום המדע, ועל ידי המענקים של קרן המדע טקדה וקרן ההנצחה Mochida רפואי ומחקר התרופות. ס מאשר תמיכה מתוכנית RIKEN הבינלאומי תוכנית לשייך (IPA).

1. תא הכנה
<ol><li>לטפח הלה תאים בצלחת 10 ס מ- 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 ב- Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר המכיל 10% סרום שור בעובר.</li>
	<li>איסוף תאים גדל אקספוננציאלית, ברגע שהם הגיעו 70% confluency, בעקבות ההוראות בקרת האוויר17.<ol>
<li>לשטוף תאים עם 5 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (pH 7.4). הסר PBS.</li...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

מאמר זה מתאר פרוטוקול לכמת אחידות תיוג כל מין שכותרתו החלבון בתאים לאחר ההפרדה עם מרחביות-דף (שלב 3). ניתן להחליף את שיטת ההפרדה עם שיטות אחרות כגון כרומטוגרפיה נוזלית או אלקטרופורזה נימי, המאפשרים הפרדה, fractionation של החלבונים עם רזולוציה גבוהה, תוך דרישת ציוד מיוחד23. ניתן להחליף ...

פרוטאום ניתוח, שמטרתו לכמת את כל סידרת מולקולות חלבון הביע בתא, היא גישה יקר במחקרים עדכניים ביולוגי ורפואי. ניתוח זה נפוץ מסתמך על ספקטרומטר מסה, אשר מזהה מינים חלבון מבוסס על הספקטרום שנוצר באמצעות חלבון יינון1,2,3. שיטה חלופית לניתוח פרוטאום הוא אלקטרופורזה, כולל לזיהוי בג'ל (עמוד), נימי אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל (2D). שיטה זו מתבססת על תיוג פלורסנט שאינם ספציפיים של כל מולקולות חלבון בתאים שנותחה, ואחריו electrophoretic ההפרדה, זיהוי, כימות של כל מיני חלבונים. כדי להשיג חלבון שאינם ספציפיים נדרש תיוג, אסטרטגיה אחת היא להשתמש צבעי פלורסנט ניתן לאגד חלבונים באמצעות אינטראקציות הידרופוביות אלקטרוסטטית, כגון כחול Coomassie ועברית4,5,6 . אסטרטגיית חלופית היא להשתמש תיוג קוולנטיות עם צבעי המכיל N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר או maleimide, אשר באפשרותך לאגוד covalently חלבונים באמצעות משקעים נפוצות כגון אמינים העיקרי תיולים, בהתאמה7, 8.
בינתיים, הרגישות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית הינו אידיאלי עבור ניתוח נמוכה-שפע חלבונים מספר קטן של תאים. מולקולה בודדת פלורסצנטיות הדמיה היא אחת מהשיטות הרגישים ביותר המאפשר זיהוי הפרט צבעי פלורסנט, שכותרתו חלבונים חוץ גופית ו ויוו9,10,11,12, 13,14,15. היישום של שיטת ההדמיה מבוססת-אלקטרופורזה פרוטאום ניתוח צפוי לאפשר מבחני רגישה מאוד ומלאת כמותיים על ידי ספירת חלבונים בודדים עם התווית fluorescently. עם זאת, עדיין לא ברור תיוג עם צבעי פלורסנט היא הומוגנית מספיק על פני כל מולקולות חלבון, ואת ההשפעה הומוגניות זו על ידי חלבונים שונים מינים (איור 1). מדידות פתרון פשוט בצובר יכול לשמש כדי לקבל יחס טוחנת של צבעי פלורסנט כדי הנקרא "צימוד יעילות"8 או 'תיוג יעילות', אך מאפיין זה אינו מספק מידע על אחידות בין תיוג מולקולות חלבון.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול assay לחקור את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון בה תא (איור 2)16. שני השלבים המפתח הזה assay הם הדמיה וטיהור חלבונים. בשלב הראשון, כל החלבונים בתאים מסומנות fluorescently, biotinylated, ואז חילוץ בנפרד באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ואחריו electroelution. בשלב השני, קרינה פלואורסצנטית המאפיינים של מולקולות חלבון בודדים הדגימות שחולצו מוערכים בהתבסס על הדמיה מולקולה בודדת. מנתוני הזה, לצבוע פרמטרים חשובים לניתוח ספירה, כגון אחוז חלבונים המסומנת אחד לפחות, אשר אנו קוראים תפוסה (LO) תיוג16, המספר הממוצע של צבעי פלורסנט מאוגדים מולקולה של חלבון יחיד (n̄ צבע), ניתן לאפיין. בפרוטוקול, שגרת ממוטב עבור תיוג של פרוטאום הלה תא עם צבע 3 Cyanine (Cy3) המבוסס על אסתר NHS מוצג בתור דוגמה, שניתן יהיה לשנותה באמצעות הליכים אחרים תיוג בהתאם ליעדי המחקר הרצוי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

תא proteomes מאופיינים לעיתים קרובות באמצעות מבחני אלקטרופורזה, שבו כל המינים של חלבונים בתאי מסומנים בכיתוב הלא ספציפית הפלורסנט, הם הבחינו מאת photodetector בעקבות הפירוד שלהם. מולקולה בודדת פלורסצנטיות הדמיה יכולים לספק זיהוי חלבונים העדינה יכולתה להמחשת מולקולות בודדות פלורסנט. עם זאת, היישום של שיטת הדמיה עוצמה אלקטרופורזה מבחני היא הקשו על ידי חוסר של דרכים כדי לאפיין את ההומוגניות של תיוג פלורסנט של כל מיני חלבונים על פני פרוטאום. . הנה, פיתחנו שיטה כדי להעריך את ההומוגניות תיוג פרוטאום בהתבסס על assay הדמיה קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת. במדידה שלנו באמצעות מדגם הלה תא, היחס של חלבונים עם צבע אחד לפחות, שבו אנחנו כינה 'תיוג תפוסה' תוויות (לו), היה נחוש בדעתו טווח של 50% ל 90%, תומך הפוטנציאל הגבוה של היישום מולקולה בודדת הדמיה כדי ניתוח פרוטאום רגיש ומדויק.

איור 4 מייצג את נתוני התמונה הגולמיים לשברים שונים משקל מולקולרי של חלבונים מן התא הלה lysate, כמו גם את הפקד חיוביים ושליליים. בעוד חלבון לדוגמה והן חיוביות לשלוט בנספח 100 – 500 נקודות לכל תמונה, הפקד שלילי מציג אף אחד או כמה נקודות, מראה כי הפרוטוקול מעכב מספי?...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

שיטה זו מדגימה את הכיול של כימות כמות החלבון בדגימה נוזלית עם תהליך מולקולה אחת לספירה. באופן ספציפי, זה יכול להמחיש כיצד אוכלוסיות חלבון ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי בכל רמת מולקולה. שיטות קודמות ביצעו מדידות בתפזורת כדי לנתח את היחסים הטוחנות של מולקולות פלואורסצנטיות וחלבונים, אך הן אינן יכולות לחשוף כיצד אוכלוסיות חלבונים הטרוגניות מסומנות בפועל.השיטות שלנו יכולות לעשות את זה ישירות ברמת המולקולה הבודדת. השיטה שלנו יכולה להיות מורחבת לכיוון בדיקות ריכוז מולקולריות רגישות ומתקדמות, שיובילו לשיטות אבחון עתידיות, ויאפשרו ממצאים יעילים של מולקולות פתוגניות בדגימות. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניתוח מיני חלבון יחיד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים, כמו גם ניתוח מינים מרובים באמצעות תוויות לא ספציפיות עבור כל החלבונים המופרדים על ידי אלקטרופורזה או כרומטוגרפיה.הנקודה הקריטית ביותר של הטכניקה היא קבלת שכפול נתונים. אני ממליץ לשמור על אותו מצב ניסיוני ככל האפשר בעת מדידת דגימות מרובות. הדגמה חזותית של טכניקה זו תספק כיצד להפוך כל צעד ניסיוני ליציב ובלתי ניתן לשחזור.זה גם יראה כמה צעד נדיר בפרוטוקולים ביוכימיה, כגון ספין ציפוי וכביסה של כיסויי מיקרוסקופ. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מאגר ה- lysing ואת 1%Tween-20 כמפורט בפרוטוקול הטקסט. השתמש נתרן הידרוקסידי כדי להתאים את ה- pH ל 12.מערבבים 100 מיקרוליטרים של חיץ ליאזינג עם מיקרוליטר אחד של DDT טוחן אחד וארבעה מיקרוליטרים של 50% CHAPS. הוסף מיקרוליטר אחד של תרבות התאים המוכנים והומוגניזציה של הפתרון על ידי צינור איטי כדי למנוע בועות. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם תסיסה עדינה.לאחר מכן, rehomogenize הפתרון על ידי צינורות אותו למעלה ולמטה לאט. הוסף מיקרוגרם אחד של צבע אסתר NHS Cy3 ו homogenize הפתרון על ידי האטת צינורות כדי למנוע בועות. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.חזור על תהליך זה, הוספת אותה כמות של צבע דגירה המדגם פעם אחת. הוסף 100 microliters של 0.8 טוחן HEPES-נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH של הפתרון ל 7.2 ולהרוות את התגובה. לאט לאט פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה הפתרון.לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של ביוטין-2-אמין וחמישה microliters של EDC. הומוגניזציה הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה לאט. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עם תסיסה עדינה.לאחר מכן, השתמש בעמודת סינון במיוחד עם ניתוק של 10 קילוDalton כדי להסיר את כל מגיבי התיוג שלא נתיגו ולרכז את הדגימה. לאחר ביצוע SDS-PAGE סטנדרטי עבור דגימת החלבון וסולם מולקולרי, תדמיין את הג'ל כדי לזהות את מיקום רצועות החלבון. השתמש בלהב חד כדי לחתוך את מנות הג'ל הכוללות שברי חלבון של עניין בהתבסס על מיקומי הלהקות.ראשית, להגדיר כיסויים כי הם 22 מילימטרים על ידי 22 מילימטרים והם 0.15 מילימטרים עבה. השתמש מנקה פלזמה לחשוף את הכיסויים לפלזמה אוויר במשך דקה אחת כדי לנקות ולהפעיל את המשטחים שלהם. לאחר מכן, השתמש במעיל ספין כדי לסובב את הכיסויים עם 200 מיקרוליטרים של מאגר אוודין למשך חמש שניות ב- 500 סל"ד, ואחריו 30 שניות ב- 1000 סל"ד.דגירה של כיסויים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר להם אוויר יבש. להכנת כיסויים לדגימה של החלבון, השתמשו בדגימה חלבון שדוללה. מניחים 100 מיקרוליטרים של המדגם המדולל על מרכז כיסויים מצופים אוודין.דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. כדי להכין את השליטה החיובית, מניחים 100 מיקרוליטרים של ביוטין פלואורסצנטי מטוהר בחמישה מיקרומולרים HEPES-נתרן הידרוקסיד ב pH 7.2 במרכז כיסוי מצופה אוודין. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.כדי להכין את השליטה השלילית, פלזמה מעיל ספין מכסה עם 200 microliters של חמישה הידרוקסיד HEPES-נתרן עם שני מיליגרם למיליליטר של BSA ללא אוודין. הוסף 100 microliters ביוטין פלואורסצנטי מטוהרים בחמישה micromolar HEPES-נתרן הידרוקסיד ב pH 7.2. דגירה בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לשטוף כל coverslip עם 200 microliters של מים מזוקקים על ידי צינורות בקצוות, הקפדה לא לגעת באמצע coverslip עם קצה פיפטה. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאחר מכן, לחשוף מספר שווה של כיסויים חדשים לפלזמה אוויר לדקה אחת.מניחים כיסוי מנוקה על גבי כל כיסוי כרוך מדגם, כדי למנוע ייבוש. התחל מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב או אוונסנטי. הגדר כיסוי על המיקרוסקופ ולמצוא את המוקד.לאחר מכן, בצע סריקת אריחים כדי להשיג לפחות 100 תמונות. במחקר זה, הומוגניות התיוג של כל מין חלבון שכותרתו בתאים הוא לכמת לאחר ההפרדה עם SDS-PAGE. נתוני התמונה הגולמית עבור שברי משקל מולקולריים שונים של חלבונים מ ליזאט תא HeLa, כמו גם את הפקדים החיוביים ושליליים, נראים כאן.בעוד שגם דגימת החלבון וגם תערוכת הבקרה החיובית בין 100 ל-500 כתמים לתמונה, הבקרה השלילית מציגה מעט מאוד עד אף אחד. זה מראה כי התהליך מספיק מעכב כריכה לא ספציפית של צבעים על פני השטח coverslip. היסטוגרמות עוצמת ספוט עבור דגימות החלבון ואת השליטה החיובית להציג פסגות מרובות, המייצגים את הכריכה סטוכססטית של צבעים אמינים ראשוניים חלבונים ומבנים טטרמר אוודין בהתאמה.כל הכתמים הראו מהבהבים ו photobleaching צעד עם עירור לייזר מתמשך, הדגשת תצפית ברמת מולקולה אחת. לאחר מכן מחושבת תפוסת התיוג, או LO, מיחס בין מספר הנקודות בכל דגימת חלבון לזה שבבקרה החיובית. LO נמדד מן תא HeLa ליסאט מדגם נע בין 50% עבור שבר משקל מולקולרי קטן יותר, כדי 90% עבור שבר משקל מולקולרי גבוה יותר.LO עבור מדגם פרוטיום כולו ללא הפרדה נתפסת להיות 72%זה קריטי להשתמש reagents טריים כדי למנוע כל אבק, במיוחד במהלך הכנת coverslips. בעקבות הליך זה, ניתוח ספירת מולקולות בודדות בנפח מסוים יכול להתבצע כדי לכמת את הריכוזים של כל חלבון. לדוגמה, ניתוח על כל מוצר גלם, או ג'ל ומוצרי אלקטרופורזה נימי, ניתן לבצע.טכניקה זו סוללת את הדרך לניצול הדמיית פלואורסצנטיות של מולקולה יחידה לרפואה מולקולרית, כימיה אורגנית וניתוח אומיקה. על ידי גישור המושג בין ריכוז למספרים. נתרן הידרוקסידי מרוכז הוא מאכל, ויש ללבוש הגנה נאותה בעת הטיפול בו.כמו כן, קרינת לייזר בה הספק גבוה עלולה לגרום נזק לעיניים, ולכן ניתן ללבוש משקפי מגן.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...