Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
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लेखक प्रयोगात्मक सहायता और सलाह के लिए Masae Ohno और Kazuya निशिमुरा धंयवाद । यह काम PRESTO (JPMJPR15F7), जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था, युवा वैज्ञानिकों के लिए सहायता अनुदान (ए) (२४६८७०२२), चुनौतीपूर्ण अन्वेषणात्मक अनुसंधान (२६६५००५५), और अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान (२३११५००५), जापान समाज के लिए विज्ञान के संवर्धन, और Takeda विज्ञान फाउंडेशन और चिकित्सा और औषधीय अनुसंधान के लिए Mochida मेमोरियल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा । एसएल RIKEN अंतर्राष्ट्रीय कार्यक्रम एसोसिएट (आईपीए) कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

1. सेल तैयारी
<ol><li>HeLa कोशिकाओं को 10 सेमी पकवान में ३७ डिग्री सेल्सियस में 5% के तहत2 Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त में खेती ।</li>
	<li>एक बार वे ७०% प्रवाह तक पहुंच गए हैं, एटीसीसी के निर्दे?...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

यह कागज SDS-PAGE (चरण 3) के साथ अलगाव के बाद कोशिकाओं में प्रत्येक लेबल प्रोटीन प्रजातियों की लेबलिंग एकरूपता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । पृथक्करण पद्धति को तरल क्रोमेटोग?...

प्रोटियोम विश्लेषण, जिसका उद्देश्य कोशिका में व्यक्त किए गए प्रोटीन अणुओं के पूरे सेट का आकलन करना है, वर्तमान जैविक और औषधीय अध्ययनों में एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । यह विश्लेषण सामान्यतः मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर निर्भर करता है, जो प्रोटीन आयनीकरण1,2,3के माध्यम से उत्पन्न स्पेक्ट्रा पर आधारित प्रोटीन प्रजातियों की पहचान करता है | प्रोटोसोम विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक विधि इलेक्ट्रोफोरेसिस है, polyacrylamide जेल सहित इलेक्ट्रोफोरेसिस (पृष्ठ), केशिका वैद्युतशिराजनन और द्वि आयामी (2D) जेल वैद्युतजनन । इस विधि का विश्लेषण कोशिकाओं में सभी प्रोटीन अणुओं के गैर विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर निर्भर करता है, electrophoretic जुदाई और पहचान और प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों की मात्रा का पालन द्वारा पीछा किया । आवश्यक गैर विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए, एक रणनीति के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करना है जो इलेक्ट्रोस्टेटिक और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से प्रोटीन को बांध सकते हैं, जैसे कि coomassie ब्लू और sypro-रूबी4,5,6 . एक वैकल्पिक रणनीति के लिए N-hydroxysuccimide (एनएचएस) एस्टर या maleimide युक्त रंगों के साथ सहसंयोजक लेबलिंग का उपयोग करें, जो प्राथमिक ऐमीन और thiols, जैसे आम अवशेषों के माध्यम से प्रोटीन को covalently क्रमशः7, बांध सकते है ८।
इस बीच, फ्लोरेसेंस डिटेक्शन की संवेदनशीलता कम प्रचुरता वाले प्रोटीन और कोशिकाओं की छोटी संख्या का विश्लेषण करने के लिए आदर्श है । एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक है जो व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट रंगों और लेबल वाले प्रोटीनों का विट्रो में पता लगाने की अनुमति देता है और वीवो9,10,11,12, 13,14,15. इस इमेजिंग विधि के इलेक्ट्रोफोरेसिस आधारित proteome विश्लेषण करने के लिए आवेदन करने के लिए सक्षम होने की उंमीद है अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक assays हैं, व्यक्तिगत fluorescently-लेबल प्रोटीन की गणना । हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग सभी प्रोटीन अणुओं के पार काफी सजातीय है, और कैसे इस एकरूपता अलग प्रोटीन प्रजातियों से प्रभावित है (चित्रा 1) । साधारण थोक समाधान मापन का उपयोग ' युग्मन दक्षता '8 या ' लेबलिंग दक्षता ' नामक प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का मोलर अनुपात प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह गुण लेबलिंग की एकरूपता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है प्रोटीन अणु ।
यहां, हम एक परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सेल में सभी प्रोटीन प्रजातियों के लिए लेबलिंग एकरूपता की जांच (चित्रा 2)16। इस परख के दो प्रमुख कदम प्रोटीन शुद्धि और इमेजिंग हैं । पहले चरण में, कोशिकाओं में सभी प्रोटीन fluorescently लेबल और biotinylated कर रहे हैं, तो अलग से जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर निकाला electroelल्यूशन के बाद. दूसरे चरण में, निकाले गए नमूनों में वैयक्तिक प्रोटीन अणुओं के प्रतिदीप्ति गुणों का एकल अणु इमेजिंग के आधार पर मूल्यांकन किया जाता है । इस डेटा से, गिनती विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर, जैसे कि प्रोटीन का प्रतिशत कम एक डाई के साथ लेबल किया गया है, जिसे हम लेबलिंग ऑक्यूपेंसी (LO)16कहते हैं, और एक एकल प्रोटीन अणु से बंधे फ्लोरोसेंट रंगों की औसत संख्या (n̄ डाई), विशेषता हो सकती है । प्रोटोकॉल में, एनएचए एस्टर आधारित सायनिन 3 (Cy3) डाई के साथ वाघेला सेल प्रोटीटोम लेबलिंग के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया को एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और वांछित अनुसंधान लक्ष्यों के अनुसार अन्य लेबलिंग प्रक्रियाओं के साथ संशोधित किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

सेल proteomes अक्सर वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करने की विशेषता है assays हैं, जहां कोशिकाओं में प्रोटीन की सभी प्रजातियों के गैर विशेष रूप से एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल रहे है और एक photodetector द्वारा उनके अलगाव के बाद देखा जाता है । एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट अणुओं visualizing के लिए अपनी क्षमता के साथ ultrasensitive प्रोटीन का पता लगाने प्रदान कर सकते हैं । हालांकि, इस शक्तिशाली इमेजिंग विधि के आवेदन के लिए वैद्युतकणसंचलन assays हैं, तरीकों की कमी से proteome भर में प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की एकरूपता विशेषता के लिए बाधा है । यहाँ, हम एक एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग परख के आधार पर proteome भर में लेबलिंग एकरूपता का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि विकसित की है । हमारी माप में एक HeLa सेल नमूना का उपयोग कर, प्रोटीन का अनुपात कम से एक डाई, जो हम ' करार लेबलिंग (लो) के साथ लेबल, ५०% से ९०% करने के लिए सीमा निर्धारित किया गया था, एकल अणु इमेजिंग के आवेदन की उच्च क्षमता का समर्थन संवेदनशील और सटीक proteome विश्लेषण ।

4 चित्रा HeLa सेल lysate से प्रोटीन के विभिंन आणविक वजन भागों के लिए कच्चे छवि डेटा का प्रतिनिधित्व करता है, साथ ही साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण । जबकि दोनों प्रोटीन नमूना और सका...

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

यहाँ, हम एकल अणु स्तर पर एक जटिल प्रोटीन नमूने में प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों के लिए लेबलिंग एकरूपता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

यह विधि गिनती के लिए एकल अणु प्रक्रिया के साथ तरल नमूने में प्रोटीन राशि की मात्रा निर्धारित करने के अंशांकन को दर्शाती है। विशेष रूप से, यह वर्णन कर सकता है कि प्रोटीन की आबादी को प्रत्येक अणु स्तर पर फ्लोरोसेंट रूप से कैसे लेबल किया जा सकता है। पिछले तरीकों ने फ्लोरोसेंट और प्रोटीन अणुओं के मोलर अनुपात का विश्लेषण करने के लिए थोक माप किए, लेकिन वे यह प्रकट नहीं कर सकते कि विषाणुओं की आबादी वास्तव में कैसे लेबल की जाती है।हमारे तरीके इसे सीधे एकल अणु स्तर पर कर सकते हैं । हमारी विधि को अतिसंवेदनशील और उन्नत आणविक एकाग्रता परख की ओर बढ़ाया जा सकता है, जिससे भविष्य के नैदानिक तरीकों को बढ़ावा मिलेगा, जिससे नमूनों में रोगजनक अणुओं के कुशल निष्कर्षों की अनुमति मिलेगी। हमारी विधि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करके एकल प्रोटीन प्रजातियों के विश्लेषण के साथ-साथ इलेक्ट्रोफोरेसिस या क्रोमेटोग्राफी द्वारा अलग किए गए सभी प्रोटीन के लिए गैर-विशिष्ट लेबल का उपयोग करके कई प्रजातियों के विश्लेषण पर लागू की जा सकती है।तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण बिंदु डेटा प्रजनन क्षमता प्राप्त करना है। मैं एक ही प्रयोगात्मक हालत के रूप में ज्यादा संभव के रूप में रखने की सलाह देते है जब कई नमूनों को मापने । इस तकनीक का दृश्य प्रदर्शन प्रत्येक प्रयोगात्मक कदम को स्थिर और प्रजनन योग्य बनाने का तरीका प्रदान करेगा।यह बायोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल में कुछ असामान्य कदम भी दिखाएगा, जैसे स्पिन-कोटिंग और माइक्रोस्कोप कवरस्लिप की धुलाई। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित lysing बफर और 1% ट्वीन-20 तैयार करें। पीएच को 12 में समायोजित करने के लिए सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग करें।एक मोलर डीडीटी के एक माइक्रोलीटर और 50% चैप्स के चार माइक्रोलीटर के साथ lysing बफर के 100 माइक्रोलीटर मिलाएं। तैयार सेल कल्चर का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और बुलबुले से बचने के लिए धीमी पाइपिंग करके समाधान को समरूप करें। कोमल आंदोलन के साथ पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट ।फिर, इसे धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान को फिर से समाप्त करें। Cy3 एनएचएस एस्टर डाई का एक माइक्रोग्राम जोड़ें और बुलबुले से बचने के लिए पाइपिंग को धीमा करके समाधान को समरूप करें। कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट।इस प्रक्रिया को दोहराएं, डाई की एक ही मात्रा में जोड़ते हैं और एक बार नमूना इनक्यूबेटिंग करते हैं। समाधान के पीएच को 7.2 में समायोजित करने और प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए 0.8 मोलर एचईपी-सोडियम हाइड्रोक्साइड के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे समाधान को समरूप बनाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।इसके बाद, बायोटिन-2-अमीन के 20 माइक्रोलीटर और ईडीसी के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान को समरूप करें। कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट।इसके बाद, किसी भी अप्रतिक्रिया लेबलिंग रिएजेंट्स को हटाने और नमूने को केंद्रित करने के लिए 10 किलोडलेटन कटऑफ के साथ एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन कॉलम का उपयोग करें। प्रोटीन नमूने और एक आणविक सीढ़ी के लिए मानक एसडीएस-पेज प्रदर्शन करने के बाद, प्रोटीन बैंड के स्थान की पहचान करने के लिए जेल की छवि। जेल भागों को काटने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें जिसमें बैंड के स्थानों के आधार पर ब्याज के प्रोटीन अंश शामिल हैं।सबसे पहले, 22 मिलीमीटर तक 22 मिलीमीटर वाले कवरस्लिप सेट करें और 0.15 मिलीमीटर मोटी हैं। एक प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करने के लिए एक मिनट के लिए एयर प्लाज्मा को कवरस्लिप का पर्दाफाश करने के लिए साफ और उनकी सतहों को सक्रिय । इसके बाद, 500RPM पर पांच सेकंड के लिए एवाडिन बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ कवरस्लिप को कोट करने के लिए स्पिन कोटर का उपयोग करें, इसके बाद 1000RPM पर 30 सेकंड।उन्हें हवा सूखने देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कवरस्लिप को इनक्यूबेट करें। प्रोटीन नमूने के लिए कवरस्लिप तैयार करने के लिए, एक प्रोटीन नमूना है कि पतला किया गया है का उपयोग करें । एवडिन-लेपित कवर्लिप्स के केंद्र पर पतला नमूने के 100 माइक्रोलीटर रखें।15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट। सकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए, एक एवाडिन-कोटेड कवरस्लिप के केंद्र में पीएच 7.2 पर पांच माइक्रोमोलर एचईपीई-सोडियम हाइड्रोक्साइड में शुद्ध फ्लोरोसेंट बायोटिन के 100 माइक्रोलीटर रखें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट।नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए, स्पिन कोट प्लाज्मा पांच HEPES-सोडियम हाइड्रोक्साइड के २०० माइक्रोलीटर के साथ कवरलिप्स बिना एवडिन के बीएसए के दो मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ । पीएच 7.2 पर पांच माइक्रोमोलर एचईपी-सोडियम हाइड्रोक्साइड में फ्लोरोसेंट बायोटिन को शुद्ध करने के लिए 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।इसके बाद, किनारों पर पाइपिंग करके आसुत पानी के 200 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक कवरस्लिप को कुल्ला करें, जिससे पिपेट टिप के साथ कवरस्लिप के बीच को छूना सुनिश्चित न हो। इस वॉश को तीन बार दोहराएं। फिर, एक मिनट के लिए एयर प्लाज्मा के लिए नए कवरस्लिप की एक समान संख्या का पर्दाफाश करें।सुखाने से बचने के लिए प्रत्येक नमूना-बाध्य कवरस्लिप के शीर्ष पर एक साफ कवरलिप रखें। एक व्यापक क्षेत्र या इवानसेंट फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप शुरू करें। माइक्रोस्कोप पर एक कवरलिप सेट करें और ध्यान दें।फिर, कम से कम 100 छवियों को प्राप्त करने के लिए एक टाइल स्कैन करें। इस अध्ययन में, कोशिकाओं में प्रत्येक लेबल प्रोटीन प्रजातियों की लेबलिंग एकरूपता एसडीएस-पेज के साथ अलग होने के बाद निर्धारित की जाती है । हेला सेल lysate से प्रोटीन के विभिन्न आणविक वजन अंशों के लिए कच्चे छवि डेटा, साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, यहां देखा जाता है ।जबकि दोनों प्रोटीन नमूना और सकारात्मक नियंत्रण प्रदर्शन छवि प्रति १०० और ५०० स्थानों के बीच, नकारात्मक नियंत्रण किसी को भी बहुत कुछ दर्शाती है । इससे पता चलता है कि यह प्रक्रिया पर्याप्त रूप से कवरस्लिप सतह पर रंगों के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकती है। प्रोटीन नमूनों और सकारात्मक नियंत्रण के लिए स्पॉट तीव्रता हिस्टोग्राम कई चोटियों को पेश करते हैं, जो क्रमशः प्रोटीन और एवाडिन टेट्रामर संरचनाओं में प्राथमिक अमीनों के लिए रंगों के स्टोचस्टिक बाध्यकारी का प्रतिनिधित्व करते हैं।सभी धब्बे पलक और लगातार लेजर उत्तेजन के साथ सौतेली तस्वीर दिखाया, एकल अणु स्तर पर अवलोकन पर प्रकाश डाला । लेबलिंग अधिभोग, या लो, तो सकारात्मक नियंत्रण में है कि हर प्रोटीन नमूने में धब्बे की संख्या के अनुपात से गणना की है । लो HeLa सेल से मापा नमूना छोटे आणविक वजन अंश के लिए ५०% से पर्वतमाला, उच्च आणविक वजन अंश के लिए ९०% के लिए ।जुदाई के बिना पूरे प्रोटेम नमूने के लिए लो 72% देखा जाता है यह हौसले से बनाया अभिकर्दक का उपयोग करने के लिए और विशेष रूप से कवरस्लिप की तैयारी के दौरान किसी भी धूल से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, प्रत्येक प्रोटीन की सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक निश्चित मात्रा में एकल अणु गिनती विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, किसी भी कच्चे उत्पाद, या जेल और केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस उत्पादों पर विश्लेषण किया जा सकता है।यह तकनीक आणविक चिकित्सा, कार्बनिक रसायन और ओमिक्स विश्लेषण के लिए एकल अणु फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करने का मार्ग प्रशस्त करती है। एकाग्रता और संख्याओं के बीच अवधारणा को पाटकर। केंद्रित सोडियम हाइड्रोक्साइड संक्षारक है, और इसे संभालते समय पर्याप्त सुरक्षा पहनी जानी चाहिए।इसके अलावा, हाई पावर लेजर विकिरण आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है, इसलिए सुरक्षात्मक चश्मे पहने जा सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

एकल अणु से जानकारी संरचनात्मक झल्लाहट तेजी से नैनो पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग कर प्रयोगों

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

बढ़ी नमूना संयुक्त पूर्वगामी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग का उपयोग ऊतकों की Multiplexing (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

बायोमोलेस्क्यू संरचना निर्धारण के लिए एकल अणु स्तर पर उच्च शुद्धता FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

तीन रंग एकल अणु झल्लाहट का उपयोग प्रोटीन बातचीत के सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

एक नई Kinase प्रोटीन के मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर विशेषता

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

कैप-डिपेंडेंट ट्रांसल काइनेटिक्स के विश्लेषण के लिए इन विट्रो सिंगल-अणु इमेजिंग परख

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...