Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
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Gli autori ringraziano Masae Ohno e Kazuya Nishimura per consulenza e assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, localizzativi per giovani scienziati (A) (24687022), sfidando ricerca esplorativa (26650055) e ricerca scientifica in settori innovativi (23115005), Japan Society for la promozione della scienza e di sovvenzioni da parte della Takeda Science Foundation e la Fondazione Memorial Mochida per il medico e ricerca farmaceutica. S.L. riconosce sostegno dal programma RIKEN associare programma internazionale (IPA).

1. cella preparazione
<ol><li>Coltivare le cellule HeLa in un piatto di 10 cm a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 in Dulbecco s modified mezzo di Eagle contenente 10% siero bovino fetale.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in crescita esponenziale una volta che hanno raggiunto il 70% confluency, seguendo le istruzioni di ATCC17.<ol>
<li>Sciacquare le cellule con 5 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS) (pH 7.4). Rimuovere PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di acido di 0,1% tripsina-etilendia...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Questo articolo descrive un protocollo per quantificare l'omogeneità d'etichettatura di ogni specie di proteina marcata nelle cellule dopo la separazione con SDS-PAGE (passaggio 3). Il metodo di separazione possa essere sostituito con altri metodi come la cromatografia liquida o elettroforesi capillare, che permettono la separazione e frazionamento delle proteine cellulari con alta risoluzione, mentre che richiedono attrezzature speciali23. Il metodo d'etichettatura utilizzando NHS-estere nel pro...

Analisi del proteoma, che mira a quantificare l'intero set di molecole di proteina espressa nella cella, è un valido approccio negli attuali studi biologici e medicinali. Questa analisi si basa comunemente sulla spettrometria di massa, che individua le specie di proteine basato su spettri generati attraverso proteine ionizzazione1,2,3. Un metodo alternativo per analisi del proteoma è l'elettroforesi, tra cui l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE), elettroforesi capillare ed elettroforesi bidimensionale (2D). Questo metodo si basa sull'etichettatura fluorescente non specifici di tutte le molecole di proteina in cellule analizzate, seguite da separazione elettroforetica e la individuazione e la quantificazione di ogni specie di proteina. Per ottenere il contrassegno richiesta non specifico proteina, una strategia è quella di utilizzare tinture fluorescenti che possono legarsi a proteine tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche, come blu di Coomassie e Sypro Ruby4,5,6 . Una strategia alternativa consiste nell'utilizzare etichettatura covalente con coloranti contenenti N-Idrossisuccinimide (NHS) estere o maleimide, che può legare covalentemente alle proteine attraverso comuni residui come primarie ammine e tioli, rispettivamente7, 8.
Nel frattempo, la sensibilità di rilevazione della fluorescenza è ideale per l'analisi di basso-abbondanza proteine e un piccolo numero di cellule. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola è uno dei metodi più sensibili che permette la rilevazione dei singoli coloranti fluorescenti e con etichetta delle proteine in vitro e in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Applicazione di questo metodo di imaging per analisi del proteoma basati su elettroforesi è previsto per consentire analisi altamente sensibili e quantitative contando singole proteine fluorescente etichettati. Tuttavia, rimane poco chiaro se etichettatura con coloranti fluorescenti è abbastanza omogenea in tutte le molecole di proteina, e come questa omogeneità è influenzata da specie differenti della proteina (Figura 1). Rilievi relativi alla soluzione semplice massa possono essere utilizzati per ottenere un rapporto molare di coloranti fluorescenti per proteine chiamate 'efficienza di accoppiamento'8 o 'etichettatura efficienza', ma questa proprietà non fornisce informazioni sull'omogeneità di etichettatura tra molecole di proteina.
Qui, descriviamo il protocollo per un'analisi per indagare l'omogeneità d'etichettatura per tutte le specie di proteine nella cellula (Figura 2)16. I due passaggi chiavi di questo test sono imaging e purificazione della proteina. Nel primo passaggio, tutte le proteine nelle cellule fluorescente sono etichettate e biotinilato, quindi estratta separatamente utilizzando l'elettroforesi del gel seguita da electroelution. Nel secondo passaggio, proprietà di fluorescenza di molecole singole proteine nei campioni estratti vengono valutate in base su formazione immagine singola molecola. Da questi dati, parametri importanti per l'analisi di conteggio, come la percentuale di proteine etichettate con un'almeno una tingono, che noi chiamiamo etichettatura occupazione (LO)16, e il numero medio di coloranti fluorescenti legati ad una molecola singola proteina (n̄ colorante), può essere caratterizzato. Nel protocollo, una procedura ottimizzata per l'etichettatura del proteoma delle cellule HeLa con tintura di cianina 3 (Cy3) a base di estere NHS è presentata come esempio e può essere modificata con altre procedure di etichettatura secondo obiettivi di ricerca desiderato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Proteomi cellulari sono spesso caratterizzati utilizzando dosaggi di elettroforesi, dove tutte le specie delle proteine nelle cellule non specifico sono marcate con un colorante fluorescente e sono individuate da una cellula fotoelettrica dopo la loro separazione. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola può fornire rilevamento ultrasensibile della proteina con la sua capacità per la visualizzazione di singole molecole fluorescenti. Tuttavia, l'applicazione di questo potente metodo di imaging a saggi di elettroforesi è ostacolata dalla mancanza di modi per caratterizzare l'omogeneità dell'etichettatura fluorescente di ogni specie di proteine attraverso il proteoma. Qui, abbiamo sviluppato un metodo per valutare l'omogeneità d'etichettatura attraverso il proteoma basato su un'analisi di formazione immagine di fluorescenza singola molecola. Nella nostra misura utilizzando un campione di cellule HeLa, la proporzione di proteine etichettate con almeno un colorante, che abbiamo chiamato 'etichettatura occupazione' (LO), è stato determinato per gamma dal 50% al 90%, sostenere l'elevato potenziale dell'applicazione di imaging di singola molecola di analisi del proteoma sensibile e precisa.

Figura 4 rappresenta i dati di immagine raw per frazioni di diverso peso molecolare delle proteine da lysate delle cellule HeLa, come pure il controllo positivo e negativo. Mentre il campione della proteina e il positivo controllo esposizione 100 – 500 punti per ogni immagine, viene visualizzato il controllo negativo nessuno o pochi punti, mostrando che il protocollo sufficientemente inibisce il legame non specifico di coloranti alla superficie del vetrino ...

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Questo metodo dimostra la calibrazione della quantità di proteine quantificanti nel campione liquido con processo a singola molecola per il conteggio. In particolare, può illustrare come le popolazioni proteiche possono essere etichettate fluorescentmente ad ogni livello di molecola. I metodi precedenti hanno eseguito misurazioni alla rinfusa per analizzare i rapporti molari delle molecole fluorescenti e proteiche, ma non possono rivelare come le popolazioni di proteine eterogenee siano effettivamente etichettate.I nostri metodi possono farlo direttamente a livello di singola molecola. Il nostro metodo può essere esteso verso test di concentrazione molecolare ultrasensibili e avanzati, che porteranno a futuri metodi diagnostici, consentendo risultati efficienti di molecole patogene nei campioni. Il nostro metodo può essere applicato all'analisi di singole specie proteiche utilizzando anticorpi fluorescenti, nonché all'analisi di più specie utilizzando etichette non specifiche per tutte le proteine separate da elettroforesi o cromatografia.Il punto più critico della tecnica è ottenere la riproducibilità dei dati. Consiglio di mantenere la stessa condizione sperimentale il più possibile quando si misurano più campioni. La dimostrazione visiva di questa tecnica fornirà come rendere ogni fase sperimentale stabile e riproducibile.Mostrerà anche alcuni passaggio non comuni nei protocolli biochimici, come lo spin-coating e il lavaggio dei copripiscopio. Per iniziare questa procedura, preparare il buffer di lysing e l'1%Tween-20 come indicato nel protocollo di testo. Utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH a 12.Mescolare 100 microlitri di tampone di lysing con un microliter di un DDT molare e quattro microlitri del 50%CHAPS. Aggiungere un microlitro della coltura cellulare preparata e omogeneizzare la soluzione mediante pipettazione lenta per evitare bolle. Incubare al buio a temperatura ambiente per cinque minuti con delicata agitazione.Quindi, disomogeneizzare la soluzione coniarla su e giù lentamente. Aggiungere un microgrammo di colorante estere Cy3 NHS e omogeneizzare la soluzione rallentando la pipettazione per evitare bolle. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti con delicata agitazione.Ripetere questo processo, aggiungendo la stessa quantità di colorante e incubando il campione una volta. Aggiungere 100 microlitri di idrossido molare HEPES-sodio per regolare il pH della soluzione a 7,2 e per spegnere la reazione. Pipettare lentamente su e giù per omogeneizzare la soluzione.Successivamente, aggiungere 20 microlitri di Biotina-2-ammina e cinque microlitri di EDC. Omogeneizzare la soluzione tubazione su e giù lentamente. Incubare al buio a temperatura ambiente per un'ora con delicata agitazione.Successivamente, utilizzare una colonna di ultrafiltrazione con un cutoff di 10 kiloDalton per rimuovere eventuali reagenti di etichettatura non reagenti e concentrare il campione. Dopo aver eseguito SDS-PAGE standard per il campione proteico e una scala molecolare, immagini il gel per identificare la posizione delle bande proteiche. Utilizzare una lama affilata per tagliare le porzioni di gel che includono frazioni proteiche di interesse in base alle posizioni delle bande.In primo luogo, impostare le copertine che sono 22 millimetri per 22 millimetri e hanno uno spessore di 0,15 millimetri. Utilizzare un detergente al plasma per esporre i coprispavimenti al plasma dell'aria per un minuto per pulire e attivare le loro superfici. Successivamente, utilizzare uno spin coater per ruotare le coverlips con 200 microlitri di tampone di avadina per cinque secondi a 500 RPM, seguito da 30 secondi a 1000 RPM.Incubare i copricapo a temperatura ambiente per 15 minuti per lasciarli asciugare all'aria. Per preparare le coverlips per il campione proteico, utilizzare un campione proteico che è stato diluito. Posizionare 100 microlitri del campione diluito al centro delle copertine rivestite di avadina.Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Per preparare il controllo positivo, posizionare 100 microlitri di biotina fluorescente purificata in cinque idrossido di HEPES-sodio micromolare a pH 7.2 al centro di un coverslip rivestito di avadina. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.Per preparare il controllo negativo, spin coat plasma coverslips con 200 microlitri di cinque idrossido HEPES-sodio con due milligrammi per millilitro di BSA senza avadina. Aggiungere 100 microlitri alla biotina fluorescente purificata in cinque idrossido micromolare HEPES-sodio a pH 7.2. Incubare al buio per 15 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, sciacquare ogni coverlip con 200 microlitri di acqua distillata pipettando ai bordi, assicurandosi di non toccare il centro del coperchio con la punta della pipetta. Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi, esporre un numero uguale di nuove copertine al plasma dell'aria per un minuto.Posizionare un coverslip pulito sopra ogni coverslip rilegato a campione per evitare l'asciugatura. Avviare un microscopio a fluorescenza a campo largo o evanescente. Impostare un coverslip sul microscopio e trovare la messa a fuoco.Quindi, esegui una scansione dei riquadri per ottenere almeno 100 immagini. In questo studio, l'omogeneità di etichettatura di ogni specie proteica etichettata nelle cellule viene quantificata dopo la separazione con SDS-PAGE. I dati delle immagini grezze per diverse frazioni di peso molecolare delle proteine del lisato cellulare HeLa, così come i controlli positivi e negativi, sono visti qui.Mentre sia il campione proteico che il controllo positivo mostrano tra 100 e 500 punti per immagine, il controllo negativo mostra pochissimi a nessuno. Ciò dimostra che il processo inibisce sufficientemente il legame non specifico dei coloranti alla superficie del coverslip. Gli istogrammi di intensità spot per i campioni proteici e il controllo positivo presentano picchi multipli, che rappresentano il legame stocastico dei coloranti alle ammine primarie rispettivamente nelle proteine e nelle strutture tetrameriche avadine.Tutti i punti mostravano lampeggianti e fotobleaching graduale con eccitazione laser continua, evidenziando l'osservazione a livello di singola molecola. L'occupazione dell'etichettatura, o LO, viene quindi calcolata dal rapporto tra il numero di macchie in ogni campione proteico e quello nel controllo positivo. Il LO misurato dal campione di lisato a cellule HeLa varia dal 50% per la frazione di peso molecolare più piccola, al 90% per la frazione a peso molecolare più elevato.Il LO per l'intero campione di proteoma senza separazione è considerato al 72%È fondamentale utilizzare reagenti appena fatti ed evitare qualsiasi polvere, specialmente durante la preparazione dei copripavimenti. Seguendo questa procedura, l'analisi del conteggio di singole molecole in un determinato volume può essere eseguita per quantificare le concentrazioni di ciascuna proteina. Ad esempio, è possibile eseguire analisi su qualsiasi prodotto grezzo, o prodotti di gel ed elettroforesi capillare.Questa tecnica apre la strada all'utilizzo dell'imaging a fluorescenza a singola molecola per la medicina molecolare, la chimica organica e l'analisi omica. Colmando il concetto tra concentrazione e numeri. L'idrossido di sodio concentrato è corrosivo e deve essere indossata un'adeguata protezione durante la manipolazione.Inoltre, la radiazione laser ad alta potenza può causare danni agli occhi, quindi gli occhiali protettivi possono essere indossati.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Ricerca

Biochimica

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

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