Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

著者らは、実験の支援やアドバイスを大野雅恵と西村和哉をありがとうございます。この作品は、さきがけ (JPMJPR15F7)、日本科学技術振興機構、若い科学者 (A) (24687022)、挑戦的萌芽研究 (26650055)、革新的な領域 (23115005) 会科学研究費補助金に支えられ医療・創薬研究の推進学と武田科学財団持田記念財団からの補助金によって。S. l. は、理化学研究所国際プログラムに関連付ける (IPA) プログラムからのサポートを認めています。

1. セル準備
<ol><li>37 ° C で 10 cm 皿に HeLa 細胞を養う 5% 未満ダルベッコの CO2のイーグル培地 10% 牛胎児血清を含む、変更されました。</li>
	<li>70% の confluency、次の ATCC 手順17に達したら、指数関数的に成長のセルを収集します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4) x 1 の 5 mL の細胞をすすいでください。PBS を削除します。</li>
		<li>0.1% トリプシン エチレンジアミ?...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

本稿では、SDS-PAGE (ステップ 3) を分離した後の分類された蛋白質種のセルのラベルの均質性を定量化するためのプロトコルについて説明します。分離法は、分離と23特別な装置を必要としながら高解像度の細胞蛋白質の分別を許可する液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの他の方法で置き換えることが。現在のプロトコルの NHS エステルを使用してラベリン?...

セルで表されるタンパク質分子の全体セットを定量化することを目的としたプロテオーム解析は、現在の生物学的および薬効がある研究の貴重なアプローチです。この分析は、よくタンパク質イオン1,2,3を介して生成されたスペクトルに基づく蛋白質種を識別する質量に依存します。プロテオーム解析の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を含む電気泳動、キャピラリー電気泳動、二次元 (2 D) ゲルの電気泳動。このメソッドは、非固有電気泳動分離と検出および各蛋白質種の定量化分析の細胞のすべてのタンパク質分子の蛍光標識に依存します。必要な非特異的タンパク質ラベリングを実現、1 つの戦略はブルーと可視ルビー4,5,6 などの静電場と疎水性相互作用によるタンパク質に結合することができます蛍光染料を使用するには.代替戦略 N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルまたはマレイミド、第一級アミン、チオールなど一般的な残基をタンパク質に結合することができます共有、それぞれ7,を含む染料で共有結合性ラベリングを使用することです。8。
一方、蛍光検出の感度は、低豊富なタンパク質と細胞の小さな数字の分析に最適です。単一分子蛍光イメージングは個々 の蛍光染料と in vitro 試験および in vivo9,10、11,12、分類された蛋白質の検出を可能にする最も敏感な方法の一つです。 13,14,15。このイメージング法の電気泳動を用いたプロテオーム解析への応用は、個々 の蛍光標識したタンパク質をカウントすることにより高感度・定量的アッセイを有効にする予定です。ただし、不明のままかどうか蛍光染料と分類は十分なすべての蛋白質分子の間で、種のタンパク質 (図 1) は、この均質性の影響について。単純なバルク溶液測定を使用して、'結合効率'8または 『 効率をラベリング 』 と呼ばれるタンパク質に蛍光染料のモル比を取得できますが、このプロパティ間ラベルの均質性に関する情報は提供しません蛋白質分子。
ここでは、セル (図 2)16のすべての蛋白質種のラベリングの均質性を調査するための試金のためのプロトコルについて述べる。この試金の 2 つの手順では、蛋白質の浄化およびイメージング。最初のステップで、細胞のすべてのタンパク質を蛍光に分類し、ビオチン化、個別に電気泳動を使用して得られる electroelution が続きます。2 番目の手順では、単一分子イメージングに基づく抽出サンプル中の個々 のタンパク質分子の蛍光特性が評価されます。このデータからタンパク質の割合が少なくとも 1 つ付いたようカウント分析の重要なパラメーターを染める、これラベリング占有 (LO)16と呼んで、蛍光染料の平均数は単一のタンパク質分子にバインド (n̄色素)、特徴付けることができます。プロトコルでは、NHS エステル系シアニン 3 (Cy3) 染料と HeLa 細胞のプロテオームの分類のための最適化されたプロシージャは、例として提示し、希望する研究の目標によると他のラベルの手順で変更できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

細胞のプロテオームは細胞内蛋白質のすべての種が非具体的蛍光染料と分類され、次の彼らの分離器によって斑点を付けられる電気泳動法の試金を使用して頻繁に特徴付けられます。単一分子蛍光イメージングは、個々 の蛍光分子を可視化するための能力を超高感度タンパク質検出を提供できます。ただし、この強力なイメージング法の電気泳動の試金への応用はプロテオームの間でそれぞれの蛋白質種の蛍光標識の均一性を特徴付ける方法の欠乏によって妨げられます。ここでは、単一分子蛍光イメージング法に基づくプロテオームのラベリングの均質性を評価する方法を開発しました。HeLa 細胞サンプル、我々 は '占有ラベル' と呼ばれる少なくとも 1 つの色素の付いたタンパク質の割合を使用して私たちの測定 (LO)、決定された範囲に 50% から 90%、サポートする単一分子イメージングの応用の可能性が高いから高感度・高精度のプロテオーム解析。

図 4は、正と負のコントロールと同様に、HeLa 細胞の lysate からの蛋白質の分子量の異なる分数の raw 画像データを表します。蛋白質のサンプルとポジティブの両方は、画像ごとの 100-500 の展示スポットを制御、ネガティブ コントロールはどれもまたは coverslip の表面に十分に染料の非特異的結合が阻害するようにプロトコルを示すいくつかのス?...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

この方法は、液体サンプル中の定量タンパク質量を、カウント用の単一分子プロセスで較正する方法を示す。具体的には、タンパク質集団が各分子レベルで蛍光標識できる方法を示すことができる。これまでの方法では、蛍光分子とタンパク質分子のモル比を分析するためにバルク測定を行っていましたが、タンパク質集団が実際にどのように標識されているかを明らかにすることはできません。我々の方法は、単一分子レベルで直接それを行うことができます。我々の方法は、超高感度かつ高度な分子濃度アッセイに拡張することができ、将来の診断方法につながり、検体中の病原性分子の効率的な発見を可能にする。我々の方法は、蛍光抗体を用いた単一タンパク質種分析、および電気泳動またはクロマトグラフィーによって分離されたすべてのタンパク質に対する非特異的標識を用いた複数種の分析に適用することができる。この技術の最も重要なポイントは、データの再現性を得るです。複数のサンプルを測定する場合は、できるだけ同じ実験条件を維持することをお勧めします。この手法の視覚的なデモンストレーションは、各実験ステップを安定して再現可能にする方法を提供します。また、顕微鏡カバーリップのスピンコーティングや洗浄など、生化学プロトコルの珍しいステップも示します。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているように、ライジング バッファーと 1%Tween-20 を準備します。水酸化ナトリウムを使用して、pHを12に調整します。1マイクロリットルのモルDDTと50%CHAPSの4マイクロリットルを1マイクロリットルと100マイクロリットルのライジングバッファーを混合します。調製した細胞培養液の1マイクロリットルを加え、気泡を避けるためにゆっくりとピペット処理することによって溶液を均質化する。穏やかな攪拌で5分間室温で暗闇の中でインキュベート。次に、溶液をゆっくり上下にピペット化して再均質化する。Cy3 NHSエステル染料のマイクログラムを1マイクログラム追加し、気泡を避けるためにピペットを遅くすることによって溶液を均質化します。穏やかな攪拌で10分間室温で暗闇の中でインキュベート。同じ量の染料を加え、サンプルを1回インキュベートして、このプロセスを繰り返します。0.8モルHEPES-水酸化ナトリウムの100マイクロリットルを加え、溶液のpHを7.2に調整し、反応を焼き付けます。溶液を均質化するためにゆっくりとピペットを上下に。次に、20マイクロリットルのビオチン-2アミンと5マイクロリットルのEDCを加えます。ゆっくりと上下にピペットを使用して溶液を均質化します。穏やかな攪拌で1時間室温で暗闇の中でインキュベート。この後、10キロダルトンカットオフの限外濾過カラムを使用して、未反応の標識試薬を除去し、サンプルを濃縮します。タンパク質サンプルと分子ラダーに対して標準SDS-PAGEを実行した後、ゲルを画像化してタンパク質バンドの位置を特定します。鋭利な刃を使用して、バンドの位置に基づいて目的のタンパク質画分を含むゲル部分を切り取ります。まず、22ミリメートル×22ミリメートルで、厚さ0.15ミリメートルのカバーリップを設定します。プラズマクリーナーを使用して、カバースリップを空気プラズマに1分間露出させ、表面をきれいにして活性化させます。次に、スピンコーターを使用して、200マイクロリットルのアバディンバッファーを500RPMで5秒間スピンコートし、続いて1000RPMで30秒を続けます。室温で15分間カバーリップをインキュベートし、空気を乾燥させます。タンパク質サンプルのカバーリップを調製するには、希釈したタンパク質サンプルを使用します。希釈したサンプルの100マイクロリットルを、アバディンコーティングされたカバーリップの中央に置きます。室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。陽性対照を調製するために、精製蛍光ビオチン100マイクロリットルを、アバディンコーティングカバースリップの中央にpH 7.2の5マイクロモルHEPES-水酸化ナトリウムに入れる。室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。負のコントロールを調製するために、スピンコートプラズマは、5つのHEPES-水酸化ナトリウムを200マイクロリットル、BSAの1ミリリットルあたり2ミリグラムのアバディンを使用せずにカバーリップを行った。pH 7.2で5マイクロモルHEPES-水酸化ナトリウムに100マイクロリットルを精製蛍光ビオチンを加えます。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。この後、各カバースリップを200マイクロリットルの蒸留水でリンスし、ピペットチップでカバースリップの真ん中に触れないようにします。この洗浄を3回繰り返します。その後、同数の新しいカバーリップを空気プラズマに1分間露出させます。乾燥を避けるために、各サンプルバウンドカバースリップの上にクリーニングカバースリップを置きます。広視野またはエバネッセントフィールド蛍光顕微鏡を起動します。顕微鏡にカバースリップをセットし、焦点を見つけます。次に、タイルスキャンを実行して、少なくとも100個の画像を取得します。本研究では、細胞内の標識タンパク質種ごとに標識均質性をSDS-PAGEで分離した後に定量化した。HeLa細胞ライセートのタンパク質の異なる分子量画分、ならびに陽性および陰性の対照の生画像データがここに見られる。タンパク質サンプルと陽性対照の両方が画像あたり100〜500のスポットの間を示すが、陰性対照は非常に少数からなしを示す。これは、このプロセスがカバースリップ表面への染料の非特異的結合を十分に阻害することを示す。タンパク質サンプルおよび陽性対照のスポット強度ヒストグラムは、タンパク質およびアバジン四量体構造における一次アミンへの色素の確率的結合をそれぞれ表す複数のピークを提示する。すべてのスポットは、連続的なレーザー励起で点滅と段階的な光漂白を示し、単一分子レベルでの観察を強調した。次に、ラベリング占有率(LO)は、陽性対照におけるすべてのタンパク質サンプルのスポット数の比率から計算されます。HeLa細胞のライセートサンプルから測定したLOは、分子量の小さい分率では50%から、分子量が高い分率では90%の範囲です。分離せずに全体のプロテオームサンプルのLOは72%と見られる試薬を使用し、特にカバーリップの調製中に、任意のほこりを避けるために重要です。この手順に従って、一定の体積での単一分子計数分析を行い、各タンパク質の濃度を定量化することができます。例えば、任意の生製品、またはゲルおよび毛細管電気泳動産物に対する分析を行うことができる。この技術は、分子医学、有機化学、およびオミックス分析に単一分子蛍光イメージングを利用するための道を開きます。集中力と数字の間の概念をつなぎます。水酸化ナトリウムは腐食性であり、それを取り扱う際には適切な保護を着用する必要があります。また、高出力レーザー放射は目の損傷を引き起こす可能性があるため、保護ゴーグルが着用される場合があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...