Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

저자 감사 Masae 오노와 카즈야 니시무라 실험적인 지원 및 조언. 이 작품은 프레스 토 (JPMJPR15F7), 일본 과학 및 기술 기관, 젊은 과학자 (A) (24687022), 도전 탐구 연구 (26650055), 및 혁신적인 지역 (23115005), 일본 학회에 과학 연구에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 승진의 과학, 그리고 다케다 과학 재단 및 모 기념 재단에서 교부 금에 의해 의료 및 제약 연구에 대 한. S.L. 인정 RIKEN 국제 프로그램 연결 (IPA) 프로그램에서 지원 합니다.

1. 세포 준비
<ol><li>37 ° C에서 10 cm 접시에 HeLa 세포 배양 미만 5% CO2 Dulbecco의 수정 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 글의 중간.</li>
	<li>그들은 70 %confluency, ATCC 지침17다음에 도달 되 면 기 하 급수적으로 성장 세포를 수집 합니다.<ol>
<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (pH 7.4) x 1의 5 mL로 세포를 씻어. PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>0.1% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 추?...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

이 문서는 SDS 페이지 (3 단계)와 분리 후 셀에 각 레이블이 단백질 종의 라벨 동질성을 계량 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분리 방법 분리 및 특수 장비23을 요구 하면서 높은 해상도, 세포질 단백질의 분류를 허용 하는 모 세관 전기 이동 법, 액체 크로마토그래피 등 다른 방법으로 교체하실 수 있습니다. 현재 프로토콜에 NHS 에스테 르를 사용 하 여 라벨 메서드 예 maleimide-에스테 ...

프로테옴 분석, 셀에 표시 하는 단백질 분자의 전체 집합을 계량 하는 것을 목표로, 현재 생물의 약 연구에 귀중 한 접근 이다. 이 분석은 일반적으로 단백질 종 단백질 이온화1,2,3를 통해 생성 된 스펙트럼에 따라 식별 하는 질량 분석에 의존 합니다. 프로테옴 분석에 대 한 대체 방법 이며 전기 이동 법, polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 포함 하 여, 모 세관 전기 이동 법 2 차원 (2D) 젤 전기 이동 법. 이 방법은 일반적인 전기 이동 별거 및 탐지 및 정량화 각 단백질의 분석 된 셀에서 모든 단백질 분자의 형광 라벨에 의존 합니다. 달성 하기 위해 필요한 일반적인 단백질 라벨, 하나의 전략 Coomassie Blue와 Sypro-루비4,5,6 등 정전기 및 소수 성 상호 작용을 통해 단백질을 바인딩할 수 있는 형광 염료를 사용 하는 . N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 또는 maleimide, 1 차 아민 및 thiols와 같은 일반적인 잔류물을 통해 단백질에 묶는 covalently 수 있습니다, 각각7, 를 포함 하는 염료와 화학식 라벨을 사용 하는 대체 전략은 8.
한편, 형광 검출의 감도 낮은 풍부한 단백질 및 세포의 작은 숫자 분석에 이상적입니다. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 염료와 생체 외와 생체 조건9,10,,1112, 레이블이 지정 된 단백질의 검출을 허용 하는 가장 중요 한 방법 중 하나는 13,,1415. 응용 프로그램 이미징이 방법의 전기 기반 프로테옴 분석을 개별 붙일 표시 된 단백질을 계산 하 여 매우 민감하고 양적 분석을 사용 예정입니다. 그러나, 남아 있다 불분명 여부 형광 염료로 충분히 균질에 걸쳐 모든 단백질 분자 이며 어떻게이 동질성 다른 단백질 종 (그림 1)에 의해 영향을 받습니다. 간단한 대량 솔루션 측정 '커플링 효율'8 또는 '효율 라벨' 라는 단백질에 형광 염료의 어 금 니 비율을 얻기 위해 사용할 수 있지만이 속성 중 라벨의 동질성에 정보를 제공 하지 않습니다. 단백질 분자입니다.
여기, 우리는 라벨 동질성16셀 (그림 2) 모든 단백질 종에 대 한 조사 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 분석 결과의 두 가지 주요 단계는 단백질 정화 및 이미징. 첫 번째 단계에서 셀에 모든 단백질은 붙일 표시 하 고 biotinylated, 다음 별도로 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 압축을 푼 뒤에 electroelution. 두 번째 단계에서 추출 된 표본에서 개별 단백질 분자의 형광 속성 단일 분자 이미징에 따라 평가 됩니다. 우리가 라벨 인 (LO)16, 전화와 형광 염료의 평균 수는 단일 단백질 분자에 바인딩된는이 데이터를 매개 변수 계산 분석에 대 한 중요 한 단백질의 비율 이라고 적어도 한 같은 염색 (n̄ 염료), 특성화 될 수 있습니다. 프로토콜, NHS 에스테 르 기반 Cyanine 3 (Cy3) 염료와 HeLa 세포 프로테옴을 라벨에 대 한 최적화 절차를 예를 들어, 제시 하 고 원하는 연구 목표에 따라 다른 레이블 프로시저를 수정할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

셀 proteomes 전기 이동 법 분석 실험, 세포에 있는 단백질의 모든 종 형광 염료와 레이블이 아닌 구체적으로 하 고 그들의 분리에 따라 매칭에 의해 발견을 사용 하 여 특징. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 분자 시각화 능력 磁 단백질 검출을 제공할 수 있다. 그러나, 전기 이동 법 분석 실험에이 강력한 이미징 방법의 응용은 프로테옴 걸쳐 각 단백질의 형광 라벨의 동질성을 특성화 하는 방법의 부족에 의해 방해 된다. 여기, 우리는 단일 분자 형광 이미징 분석 결과에 따라 프로테옴 걸쳐 라벨 동질성을 평가 하는 방법을 개발 했다. 헬러 세포 샘플, 우리는 '라벨 인' 되 나 적어도 하나의 염료와 함께 표시 하는 단백질의 비율을 사용 하 여 측정에서 (LO), 결정 되었다 범위를 50%에서 90%, 단일 분자 이미징에 응용 프로그램의 높은 잠재력을 지 원하는 민감하고 정확한 프로테옴 분석입니다.

그림 4 는 긍정적이 고 부정적인 제어 뿐 아니라 HeLa 세포, lysate에서 단백질의 다른 분자량 분수에 대 한 원시 이미지 데이터를 나타냅니다. 단백질 견본 및 긍정적인 이미지 당 100-500 전시 명소를 제어 하는 동안 부정적인 컨트롤 없음 또는 프로토콜 충분히 coverslip 표면에 염료의 일반적인 바인딩을 억제를 보여주는 몇 가지 관광 명소를 표시 합니다....

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

이 방법은 계수를 위한 단일 분자 공정을 가진 액체 견본에 있는 단백질 양을 정량화의 보정을 보여줍니다. 특히, 단백질 인구가 각 분자 수준에서 형광으로 표시될 수 있는 방법을 설명할 수 있습니다. 이전 방법은 형광 및 단백질 분자의 어금니 비율을 분석하기 위해 대량 측정을 수행했지만 이질적으로 단백질 인구가 실제로 어떻게 표지되는지 밝힐 수 없습니다.우리의 방법은 단일 분자 수준에서 직접 할 수 있습니다. 우리의 방법은 표본에 있는 병원성 분자의 능률적인 사실 인정을 허용하는 미래 진단 방법으로 이끌어 낼 초감도및 향상된 분자 농도 assays를 향해 확장될 수 있습니다. 우리의 방법은 형광 항체를 이용한 단일 단백질 종 분석뿐만 아니라 전기 전구 또는 크로마토그래피로 분리된 모든 단백질에 대한 비특이적 라벨을 사용하여 다중 종 분석에 적용될 수 있습니다.이 기술의 가장 중요한 점은 데이터 재현성을 얻는 것입니다. 여러 샘플을 측정할 때 가능한 한 동일한 실험 상태를 유지하는 것이 좋습니다. 이 기술의 시각적 데모는 각 실험 단계를 안정적이고 재현 가능하게 만드는 방법을 제공합니다.또한 현미경 커버립의 스핀 코팅 및 세척과 같은 생화학 프로토콜에서 몇 가지 드문 단계를 보여줄 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액 버퍼와 1%Tween-20을 준비합니다. 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 12로 조정합니다.1개의 어금니 DDT의 마이크로리터 1개, 50%CHAPS의 4개의 마이크로리터와 100마이크로리터의 리싱 버퍼를 섞는다. 준비된 세포 배양의 마이크로리터 1개를 추가하고 거품을 피하기 위해 느린 파이펫팅으로 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요와 함께 실온에서 5 분 동안 어둠 속에서 배양.그런 다음, 천천히 위아래로 파이프하여 용액을 다시 호질화. Cy3 NHS 에스테르 염료 1 마이크로그램을 추가하고 거품을 피하기 위해 파이프팅을 느리게하여 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요로 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.이 과정을 반복하여 동일한 양의 염료를 추가하고 샘플을 한 번 배양합니다. 용액의 pH를 7.2로 조정하고 반응을 담금질하기 위해 0.8 개의 어금니 HEPES-수산화 나트륨의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 용액을 균질화하기 위해 위아래로 천천히 파이펫을 합니다.다음으로, 비오틴-2-아민 2-아민의 마이크로리터 20개와 EDC 5마이크로리터를 추가합니다. 천천히 위아래로 피펫을 하여 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요와 실온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양.그 후 10킬로달톤 컷오프가 있는 초여열을 사용하여 반응되지 않은 라벨링 시약을 제거하고 시료를 농축합니다. 단백질 샘플 및 분자 사다리에 대한 표준 SDS-PAGE를 수행한 후, 젤을 이미지하여 단백질 밴드의 위치를 식별한다. 날카로운 블레이드를 사용하여 밴드의 위치에 따라 관심있는 단백질 분수를 포함하는 젤 부분을 잘라냅니다.먼저 22mm x 22밀리미터, 두께0.15밀리미터의 커버립을 설정합니다. 플라즈마 클리너를 사용하여 커버립을 공기 플라즈마에 1분 동안 노출하여 표면을 청소하고 활성화합니다. 다음으로 스핀 코터를 사용하여 500RPM에서 5초 동안 200 마이크로리터의 아바딘 버퍼로 커버립을 코팅하고 1000RPM에서 30초가 됩니다.커버립을 실온에서 15분간 배양하여 공기가 건조해질 수 있도록 합니다. 단백질 샘플을 위한 커버립을 준비하려면 희석된 단백질 샘플을 사용하십시오. 희석된 시료 100마이크로리터를 아바딘 코팅 커버립의 중앙에 놓습니다.실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 양성 조절을 준비하려면 정제형 형광 비오틴 100마이크로리터를 5개의 마이크로몰라 HEPES-수산화나트륨에 pH 7.2의 중앙에 배치하여 아바딘 코팅 커버슬립의 중심에 놓습니다. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요.음의 대조를 준비하기 위해 스핀 코트 플라즈마 커버립5 HEPES-나트륨 수산화기의 200 마이크로 리터와 아바딘없이 BSA의 밀리리터 당 2 밀리그램. pH 7.2에서 5개의 마이크로몰라 HEPES-나트륨 수산화제에 100마이크로리터를 정제형 형광 바이오틴에 첨가하십시오. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.그 후, 각 커버슬립을 가장자리에 파이펫으로 200 마이크로리터의 증류수를 헹구고 파이펫 팁으로 커버슬립의 중간을 만지지 않도록 하십시오. 이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 1 분 동안 공기 플라즈마에 동일한 수의 새로운 커버립을 노출하십시오.건조를 피하기 위해 각 샘플 바인딩 커버슬립 위에 청소된 커버슬립을 놓습니다. 넓은 필드 또는 에반에센트 필드 형광 현미경을 시작합니다. 현미경에 커버 슬립을 설정하고 초점을 찾을 수 있습니다.그런 다음 타일 스캔을 수행하여 최소 100개의 이미지를 얻습니다. 이 연구에서는, 세포에 있는 각 표지된 단백질 종의 표기 균질성은 SDS-PAGE로 분리 한 후에 정량화됩니다. HeLa 세포 용해에서 단백질의 다른 분자량 분획뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 대조군을 위한 원시 이미지 데이터는 여기에서 볼 수 있습니다.단백질 샘플과 양성 대조군 모두 이미지당 100~500개의 반점을 나타내지만, 음의 대조는 거의 없는 것으로 나타낸다. 이것은 프로세스가 커버 슬립 표면에 염료의 비특이적 결합을 충분히 억제한다는 것을 보여줍니다. 단백질 샘플과 양성 제어를 위한 반점 강도 히스토그램은 각각 단백질 및 아바딘 테트라머 구조의 1차 아민에 염료의 야상적 결합을 나타내는 여러 봉우리를 제시한다.모든 반점은 연속 레이저 여기와 깜박임과 단계별 광표백을 보여 주었다, 단일 분자 수준에서 관찰을 강조. 라벨링 점유, 또는 LO는, 그 때 양성 대조군에서 모든 단백질 샘플에 있는 반점의 수의 비율에서 계산됩니다. HeLa 세포 용해 샘플에서 측정된 LO는 더 작은 분자량 분획의 경우 50%에서 더 높은 분자량 분획의 경우 90%까지 다양합니다.분리가 없는 전체 프로테오메 시료에 대한 LO는 72%로 볼 수 있으며, 특히 커버립을 준비하는 동안 갓 만든 시약을 사용하고 먼지를 피하는 것이 중요하다. 이 절차에 따라, 특정 부피에서 단일 분자 계수 분석은 각 단백질의 농도를 정량화하기 위해 수행 될 수있다. 예를 들어, 임의의 원료 제품, 또는 겔 및 모세관 전기포고염 제품에 대한 분석은 수행될 수 있다.이 기술은 분자 의학, 유기 화학 및 omics 분석에 단 하나 분자 형광 화상 진찰을 이용하기 위한 도로를 포장합니다. 농도와 숫자 사이의 개념을 연결하는 것입니다. 농축 된 수산화 나트륨은 부식성이며, 그것을 취급할 때 적절한 보호가 착용되어야합니다.또한, 고출력 레이저 방사선은 눈 손상을 일으킬 수 있으므로 보호 고글을 착용 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

연구

생화학

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...