Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Forfatterne takker Masae Ohno og Kazuya Nishimura for eksperimentell hjelp og råd. Dette arbeidet ble støttet av PRESTISJE (JPMJPR15F7), Japan vitenskap og teknologi Agency, Grants-in-aid for unge forskere (A) (24687022), utfordrende utforskende forskning (26650055) og vitenskapelig forskning på nyskapende områder (23115005), Japan Society for Fremme av vitenskap, og tilskudd fra Takeda Science Foundation og Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning. S.L. anerkjenner støtte fra RIKEN International Program knytte (IPA) programmet.

1. celle forberedelse
<ol><li>Dyrke HeLa celler i en 10 cm rett på 37 ° C under 5% CO2 i Dulbecco modifiserte Eagle's medium som inneholder 10% fosterets bovin serum.</li>
	<li>Samle eksponentielt voksende celler når de har nådd 70% confluency, etter ATCC instruksjoner17.<ol>
<li>Skyll celler med 5 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) (pH 7.4). Fjerne PBS.</li>
		<li>Legg 1 mL av 0,1% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA). Inkuber 5 min på 37 ° C.</li>
		<li>Overvåke ut...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Dette dokumentet beskriver en protokoll for å kvantifisere merking homogenitet av hver merket protein Art i cellene etter separasjonen SDS-side (trinn 3). Metoden separasjon kan erstattes med andre metoder som flytende kromatografi eller kapillært geleelektroforese, som tillater separasjon og fraksjoneres av mobilnettet proteiner med høy oppløsning, samtidig som den krever spesialutstyr23. Merking metoden bruker NHS-ester i gjeldende protokollen kan bli erstattet med andre metoder med maleimid...

Proteom analyse, som tar sikte på å kvantifisere hele settet med protein molekyler i cellen, er en verdifull tilnærming i gjeldende biologiske og medisinske studier. Denne analysen er vanligvis avhengig av massespektrometri, som identifiserer protein arter basert på spectra generert gjennom protein ionisering1,2,3. En alternativ metode for proteom analyse er geleelektroforese, inkludert polyakrylamid gel geleelektroforese (side), kapillære gelelektroforese og todimensjonal (2D) gel geleelektroforese. Denne metoden bruker ikke-spesifikk fluorescerende merking av alle protein molekyler i analysert cellene, etterfulgt av electrophoretic separasjon og gjenkjenning og måling av hver protein art. For å oppnå den nødvendige uspesifisert protein merking, er en strategi å bruke fluorescerende fargestoffer som kan binde til proteiner via elektrostatisk og hydrofobe interaksjoner, for eksempel Coomassie blå og Sypro-Ruby4,5,6 . En alternativ strategi er å bruke kovalente merking med fargestoffer med N-hydroxysuccinimide (NHS) ester eller maleimide, som kan covalently binde proteiner gjennom felles rester som primære aminer og thiols, henholdsvis7, 8.
Samtidig er følsomheten til fluorescens gjenkjenning ideelle for å analysere lav-overflod proteiner og lite antall celler. Ett molekyl fluorescens imaging er en av de mest følsomme metodene som gjør påvisning av personlige fluorescerende fargestoffer og merket proteiner i vitro og i vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anvendelsen av denne bildebehandling metode til geleelektroforese-baserte proteom analyse forventes å aktivere svært sensitive og kvantitative analyser ved å telle personlige fluorescently-merket proteiner. Men det er fortsatt uklart om merking med fluorescerende fargestoffer er homogen nok over alle protein molekyler, og hvordan dette homogenitet påvirkes av annet protein arter (figur 1). Enkel bulk løsning mål kan brukes til å få molar forholdet fluorescerende fargestoffer proteiner kalt 'kopling effektivitet'8 eller "merking effektivitet", men denne egenskapen gir ikke informasjon på homogenitet av merkingen blant protein molekyler.
Her beskriver vi protokollen for analysen undersøke merking homogenitet for alle protein arter i cellen (figur 2)16. De to viktigste trinnene av denne analysen er protein rensing og bildebehandling. I det første trinnet, alle proteiner i cellene merket fluorescently og biotinylated, så utdraget separat ved hjelp av gel geleelektroforese etterfulgt av electroelution. I det andre trinnet evalueres fluorescens egenskaper for personlige protein molekyler i utdraget prøvene basert på ett molekyl bildebehandling. Fra disse dataene parametere viktig for telling analyse, som andelen proteiner merket med minst en farge, som vi kaller merking belegg (LO)16, og gjennomsnittlig antall fluorescerende fargestoffer bundet til et enkelt protein molekyl (n̄ farge), kan være preget. I protokollen, en optimalisert prosedyre for merking HeLa celle proteom med NHS ester-basert Cyanine 3 (Cy3) fargestoff er presentert som et eksempel og kan endres med andre merking etter ønsket forskning mål.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Celle proteomes er ofte preget med geleelektroforese analyser, hvor alle arter av proteiner i cellene nonspecifically merket med et fluorescerende farge og er oppdaget av en photodetector etter deres atskillelse. Ett molekyl fluorescens bildebehandling kan gi ultrasensitive proteinet oppdagelsen sin evne til å visualisere fluorescerende molekyler. Men er anvendelsen av denne kraftige bildebehandling metode til geleelektroforese analyser hindret av mangelen på måter å karakterisere homogenitet av fluorescerende merking av hver protein Art over proteom. Her utviklet vi en metode for å vurdere merking homogenitet over proteom basert på en enkelt molekyl fluorescens tenkelig analysen. I vår måling ved hjelp av et jakten celle utvalg, andelen av proteiner merket med minst ett fargestoff, som vi kalt 'merking bruk' (LO), identifiserte utvalg fra 50% til 90%, støtter det høye potensialet av ett molekyl avbildning til følsom og presis proteom analyse.

Figur 4 representerer rå bildedata for ulike molekylvekt fraksjoner av proteiner fra HeLa celle lysate, i tillegg til positive og negative kontrollen. Mens både protein prøve og positivt kontrollere utstillingen 100-500 flekker per bilde, viser kontrollen negative ingen eller noen flekker, viser at protokollen tilstrekkelig hemmer uspesifisert binding av fargestoffer til dekkglassvæske overflaten. Spot intensitet histogrammer for protein prøvene og posit...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere merking homogenitet for hver protein arter i en kompleks protein prøve på ett molekyl nivå.

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Denne metoden demonstrerer kalibreringen av kvantifisering av proteinmengde i væskeprøve med enkeltmolekylprosess for telling. Spesielt kan det illustrere hvordan proteinpopulasjoner kan være fluorescerende merket på hvert molekylnivå. Tidligere metoder utført bulk målinger for å analysere molar prosenter av fluorescerende og proteinmolekyler, men de kan ikke avsløre hvordan heterogent proteinpopulasjoner faktisk er merket.Våre metoder kan gjøre det direkte på enkeltmolekylnivå. Vår metode kan utvides mot ultrasensitive og avanserte molekylære konsentrasjonsanalyser, noe som vil føre til fremtidige diagnostiske metoder, noe som gir effektive funn av patogene molekyler i prøver. Vår metode kan brukes på enkeltprotein arter analyse ved hjelp av fluorescerende antistoffer, samt flere arter analyse ved hjelp av ikke-spesifikke etiketter for alle proteiner atskilt av elektroforese eller kromatografi.Det mest kritiske punktet i teknikken er å skaffe data reproduserbarhet. Jeg anbefaler å holde samme eksperimentelle tilstand så mye som mulig når du måler flere prøver. Visuell demonstrasjon av denne teknikken vil gi hvordan du gjør hvert eksperimentelle trinn stabilt og reproduserbart.Det vil også vise noen uvanlige skritt i biokjemi protokoller, for eksempel spin-belegg og vasking av mikroskop dekkerlips. For å starte denne prosedyren, klargjør lysing buffer og 1% Tween-20 som beskrevet i tekstprotokollen. Bruk natriumhydroksid til å justere pH til 12.Bland 100 mikroliter lysbuffer med en mikroliter av en molar DDT og fire mikroliter på 50% CHAPS. Tilsett en mikroliter av den tilberedte cellekulturen og homogeniser løsningen ved langsom pipettering for å unngå bobler. Inkuber i mørket ved romtemperatur i fem minutter med mild agitasjon.Deretter rehomogenize løsningen ved å pipetting den opp og ned sakte. Tilsett ett mikrogram Cy3 NHS ester fargestoff og homogenisere løsningen ved å bremse pipettering for å unngå bobler. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 10 minutter med mild agitasjon.Gjenta denne prosessen, legg til samme mengde fargestoff og inkuber prøven en gang. Tilsett 100 mikroliter med 0,8 molar HEPES-natriumhydroksid for å justere pH-en til oppløsningen til 7,2 og for å slukke reaksjonen. Pipette sakte opp og ned for å homogenisere løsningen.Deretter legger du til 20 mikroliter biotin-2-amin og fem mikroliter EDC. Homogeniser løsningen ved å pipetter opp og ned sakte. Inkuber i mørket ved romtemperatur i en time med mild agitasjon.Etter dette bruker du en ultrafiltreringskolonne med en 10 kiloDalton-avskjæring for å fjerne eventuelle uacted merking reagenser og konsentrere prøven. Etter å ha utført standard SDS-PAGE for proteinprøven og en molekylær stige, bilde gelen for å identifisere plasseringen av proteinbåndene. Bruk et skarpt blad til å kutte ut geldelene som inkluderer proteinfraksjoner av interesse basert på båndenes steder.Først, sette ut coverslips som er 22 millimeter med 22 millimeter og er 0,15 millimeter tykk. Bruk en plasmarenser til å utsette dekkglassene for luftplasma i ett minutt for å rengjøre og aktivere overflatene. Deretter bruker du en spin coater til å spinne dekk dekkglassene med 200 mikroliter av avadin buffer i fem sekunder ved 500RPM, etterfulgt av 30 sekunder ved 1000RPM.Inkuber dekkslepene ved romtemperatur i 15 minutter for å la dem lufttørke. For å forberede dekkslepper til proteinprøven, bruk en proteinprøve som er fortynnet. Plasser 100 mikroliter av den fortynnede prøven på midten av de avadinbelagte dekkslipsene.Inkuber i mørket ved romtemperatur i 15 minutter. For å forberede den positive kontrollen, plasser 100 mikroliter renset fluorescerende biotin i fem mikromolar HEPES-natriumhydroksid ved pH 7.2 i midten av en avadinbelagt dekkslips. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 15 minutter.For å forberede den negative kontrollen, spin coat plasma dekkerlips med 200 mikroliter av fem HEPES-natriumhydroksid med to milligram per milliliter BSA uten avadin. Tilsett 100 mikroliter til renset fluorescerende biotin i fem mikromolar HEPES-natriumhydroksid ved pH 7.2. Inkuber i mørket i 15 minutter ved romtemperatur.Etter dette skyller du hver dekkslipp med 200 mikroliter destillert vann ved å pipettere på kantene, og pass på å ikke berøre midten av dekkslipsen med pipettespissen. Gjenta denne vasken tre ganger. Deretter eksponerer du like mange nye dekkslepper for luftplasma i ett minutt.Plasser en rengjort dekkslipp oppå hver prøvebundet dekkslips for å unngå tørking. Start opp et bredt felt eller evanescent felt fluorescens mikroskop. Sett en dekkslip på mikroskopet og finn fokus.Deretter utfører du en flisskanning for å få minst 100 bilder. I denne studien kvantifiseres merkingen homogenitet av hver merkede proteinart i celler etter separasjon med SDS-PAGE. Råbildedataene for ulike molekylære vektfraksjoner av proteiner fra HeLa-cellelylat, samt de positive og negative kontrollene, ses her.Mens både proteinprøven og den positive kontrollen viser mellom 100 og 500 flekker per bilde, viser den negative kontrollen svært få eller ingen. Dette viser at prosessen tilstrekkelig hemmer uforspesifikk binding av fargestoffer til dekkglassoverflaten. Spotintensitet histogrammer for proteinprøver og positiv kontroll presentere flere topper, som representerer stokastisk binding av fargestoffer til primære aminer i proteiner og avadin tetramer strukturer henholdsvis.Alle flekker viste blinkende og trinnvis fotobleaching med kontinuerlig laser eksitasjon, fremhever observasjon på enkelt molekylnivå. Merking belegg, eller LO, beregnes deretter fra forholdet mellom antall flekker i hver proteinprøve til det i den positive kontrollen. LO målt fra HeLa cellelylat prøven varierer fra 50%for mindre molekylvektfraksjon, til 90%for høyere molekylvektfraksjon.LO for hele proteomprøven uten separasjon er sett på som 72%Det er viktig å bruke nybakte reagenser og for å unngå støv, spesielt under utarbeidelsen av dekkslips. Etter denne prosedyren kan enkeltmolekyltellingsanalyse i et bestemt volum utføres for å kvantifisere hvert proteins konsentrasjoner. For eksempel kan analyse på et hvert råprodukt, eller gel og kapillær elektroforeseprodukter, utføres.Denne teknikken baner vei for å utnytte enkeltmolekyl fluorescensavbildning til molekylær medisin, organisk kjemi og omics analyse. Ved å bygge bro mellom konsentrasjon og tall. Konsentrert natriumhydroksid er etsende, og tilstrekkelig beskyttelse bør brukes ved håndtering av den.Høy effekt laserstråling kan også forårsake øyeskade, slik at vernebriller kan brukes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturell Informasjon fra Single-molekyl FRET Eksperimenter Bruke Fast Nano-posisjonering System

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Sample Multiplexing av vev ved hjelp Kombinert Precursor Isotop Merking og isobariske Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro single-molecule imaging assay for analyse av cap-avhengig oversettelse kinetikk

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...