Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Авторы благодарят Масаэ Ohno и Нисимура Кадзуя для экспериментальной помощь и консультации. Эта работа была поддержана PRESTO (JPMJPR15F7), Япония агентство по науке и технологии, дотаций для молодых ученых (A) (24687022), сложных поисковых исследований (26650055) и научных исследований в инновационных областях (23115005), общество Японии Продвижение науки и гранты от фонда науки Такэда и Mochida Мемориальный фонд для медицинских и фармацевтических исследований. С.л. признает поддержку от программы RIKEN международной программы связать (IPA).

1. Подготовка клетки
<ol><li>Культивировать клетки HeLa в 10 см блюдо при 37 ° C под 5% CO2 в Дульбекко модифицированная орла в среде, содержащей плода бычьим сывороточным 10%.</li>
	<li>Соберите экспоненциально растущей клетки, как только они достигли 70% confluency, следуя инструкциям ATCC17....

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Этот документ описывает протокол для количественного определения маркировки однородности каждого вида помечены белка в клетках после разделения с SDS-PAGE (шаг 3). Метод разделения может быть заменен с другими методами, такими как жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза, ко...

Протеома анализ, который призван определить весь набор белковых молекул, выраженные в ячейке, является ценным подход в текущих биологических и медицинских исследований. Этот анализ обычно полагается на масс-спектрометрии, который идентифицирует видов белков, основанный на спектры, порожденных через белка ионизации1,2,3. Альтернативный метод для анализа протеома-электрофорез, включая электрофореза геля полиакриламида (страница), капиллярного электрофореза и двухмерные (2D) гель-электрофорез. Этот метод полагается на неспецифические люминесцентные маркировки всех белковых молекул в анализируемом клетках, следуют электрофоретического разделения и обнаружения и количественного определения каждого вида белка. Для достижения требуемых неспецифических белков маркировки, одна из стратегий заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые могут связываться с белками через электростатический и гидрофобных взаимодействий, например Кумасси синим и рубиново-Sypro4,5,6 . Альтернативная стратегия заключается в использовании ковалентных маркировки с красителями, содержащих эфира N-оксисукцинимидного (NHS) или maleimide, который можно ковалентно связывать белков через общие остатков таких первичных аминов и тиолы, соответственно7, 8.
Тем временем чувствительность флуоресценции обнаружения идеально подходит для анализа низкой обилие протеинов и небольшое количество клеток. Одной молекулы флуоресценции изображений является одним из наиболее чувствительных методов, что позволяет обнаружения отдельных флуоресцентных красителей и обозначенные протеины в пробирке и в естественных условиях9,10,11,12, 13,14,15. Ожидается, что применение этого метода визуализации для анализа на основе электрофорез протеома включить весьма деликатного и количественных анализов, считая индивидуальных белков-дневно обозначенных. Однако остается неясным, является ли маркировки с флуоресцентными красителями достаточно однородной во всех белковых молекул, и как эта однородность зависит от видов различных белков (рис. 1). Простые решения массовых измерений могут использоваться для получения молярное соотношение флуоресцентных красителей белков под названием «муфты эффективность»8 или «маркировки эффективности», но это свойство не содержится информации о однородность маркировки среди белковых молекул.
Здесь мы описываем протокол assay расследовать маркировки однородности для всех видов белка в ячейку (рис. 2)16. Два ключевых шагов этот assay очищение протеина и изображений. На первом шаге дневно помечены всех белков в клетках и биотинилированным, затем извлекали отдельно с помощью электрофореза геля следуют electroelution. На втором шаге флуоресценции свойства отдельных белковых молекул в извлеченной образцы оцениваются на основе изображений одной молекулы. Из этих данных, параметры, важные для подсчета анализа, такие, как процент белков помечены с по крайней мере одно краситель, который мы называем маркировки размещение (LO)16, и среднее количество флуоресцентных красителей привязаны к одной белковой молекулы (n̄ краска), можно охарактеризовать. В протоколе оптимизированная процедура для маркировки клеток HeLa протеома краской NHS основе цианиновые 3 (Cy3) представлена в качестве примера и может быть изменен с другими маркировки процедур согласно желаемой исследовательских целей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Клетки протеомов часто характеризуется с помощью электрофореза анализов, где все виды белков в клетках не специально помечены Люминесцентную краску и запятнан фотоприемник после их разъединения. Одной молекулы флуоресценции изображений может обеспечить обнаружение сверхчувствительная белка с его способностью для визуализации отдельных флуоресцентных молекул. Однако применение этого мощного изображений метода для электрофореза анализов препятствует отсутствие способов охарактеризовать однородности люминесцентные маркировки каждого вида белка через протеома. Здесь мы разработали метод оценки маркировки однородности через протеом, основанный на одной молекулы флуоресценции изображений assay. В нашей измерения, используя образец клеток HeLa, доля белков, помечены по крайней мере одна краска, которой мы «размещение маркировки» (LO), было установлено в диапазоне от 50% до 90%, поддерживая высокий потенциал применения одной молекулы изображений для анализ чувствительным и точным протеома.

Рисунок 4 представляет изображения raw данные для различных низкомолекулярных фракций белков от lysate клетки HeLa, а также положительной и отрицательной контроля. Хотя как положительные, так и образец протеина управления выставка 100 – 500 пятна на изображени...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Здесь мы представляем протокол для оценки маркировки однородности для каждого вида белка в образце комплекс белков на уровне одной молекулы.

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Этот метод демонстрирует калибровку количественного количества белка в жидком образце с одномекуляторный процесс для подсчета. В частности, он может проиллюстрировать, как популяции белков могут быть флуоресцентно помечены на каждом уровне молекулы. Предыдущие методы проводили объемные измерения для анализа молярных соотношений флуоресцентных и белковых молекул, но они не могут выявить, как неоднородно популяции белков на самом деле помечены.Наши методы могут делать это непосредственно на уровне одной молекулы. Наш метод может быть распространен на сверхчувствительные и передовые молекулярно-концентрационные анализы, что приведет к будущим диагностическим методам, позволяющим эффективно делать выводы о патогенных молекулах в образцах. Наш метод может быть применен к анализу отдельных видов белка с использованием флуоресцентных антител, а также к анализу нескольких видов с использованием неспецифических этикеток для всех белков, разделенных электрофорезом или хроматографией.Наиболее важным моментом метода является получение воспроизводимости данных. Я рекомендую держать то же экспериментальное состояние как можно больше при измерении нескольких образцов. Визуальная демонстрация этого метода обеспечит, как сделать каждый экспериментальный шаг стабильным и воспроизводимым.Он также покажет некоторые необычные шаг в биохимии протоколов, таких как спин-покрытие и мытье микроскопа coverslips. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте обливий буфер и 1%Tween-20, как указано в текстовом протоколе. Используйте гидроксид натрия, чтобы настроить рН до 12.Смешайте 100 микролитров лизайного буфера с одним микролитером одного молярного ДДТ и четырьмя микролитров 50%CHAPS. Добавьте один микролитер готовой клеточной культуры и гомогенизируйте раствор, медленно трубя, чтобы избежать пузырьков. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение пяти минут с нежным возбуждением.Затем рехомогенизировать раствор, медленно промокая его вверх и вниз. Добавьте один микрограмм ester красителя Cy3 NHS и гомогенизируйте раствор, замедляя трубчатые трубы, чтобы избежать пузырьков. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут с нежным возбуждением.Повторите этот процесс, добавляя одинаковое количество красителя и инкубации образца один раз. Добавьте 100 микролитров 0,8 молярного гидроксида HEPES-натрия, чтобы настроить рН раствора до 7,2 и утолить реакцию. Медленно пипетки вверх и вниз, чтобы гомогенизировать раствор.Далее добавьте 20 микролитров биотина-2-амина и пять микролитров ЭОК. Гомогенизировать раствор, трубя вверх и вниз медленно. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение одного часа с нежным возбуждением.После этого используйте ультрафильтрационный столбец с 10-килограммовым вырезом, чтобы удалить неотредактированные реагенты маркировки и сконцентрировать образец. После выполнения стандартного SDS-PAGE для образца белка и молекулярной лестницы, изображение геля для определения местоположения белковых полос. Используйте острый лезвие, чтобы вырезать гель части, которые включают белковые фракции интереса на основе bands'locations.Во-первых, установлены крышки толщиной 22 миллиметра на 22 миллиметра и толщиной 0,15 миллиметра. Используйте плазменный очиститель, чтобы подвергать крышки плазме воздуха в течение одной минуты, чтобы очистить и активировать их поверхности. Далее, используйте спин пальто, чтобы вращать пальто coverslips с 200 микролитров буфера авадина в течение пяти секунд при 500RPM, а затем 30 секунд при 1000RPM.Инкубировать крышки при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы дать им высохнуть. Чтобы подготовить крышки для образца белка, используйте образец белка, который был разбавлен. Поместите 100 микролитров разбавленного образца на центр крышки с покрытием авадина.Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Чтобы подготовить положительный контроль, поместите 100 микролитров очищенного флуоресцентного биотина в пять микромолейных гидроксида HEPES-натрия при рН 7.2 в центре крышки с авадином покрытием. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.Для подготовки отрицательного контроля, спин пальто плазмы coverslips с 200 микролитров из пяти HEPES-гидроксида натрия с двумя миллиграммами на миллилитр BSA без авадина. Добавьте 100 микролитров к очищенной флуоресцентной биотину в пяти микромоляных гидроксидах HEPES-натрия при рН 7.2. Инкубировать в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.После этого, промыть каждый coverslip с 200 микролитров дистиллированной воды путем трубопроводов по краям, убедившись, что не прикасайтесь к середине крышки с наконечником пипетки. Повторите эту стирку три раза. Затем, подвергать равное количество новых coverslips в плазме воздуха в течение одной минуты.Поместите очищенный крышку поверх каждого образца связанных coverslip, чтобы избежать высыхания. Запустите широкое поле или evanescent поле флуоресценции микроскопа. Установите крышку на микроскоп и найдите фокус.Затем выполните сканирование плитки, чтобы получить не менее 100 изображений. В этом исследовании, маркировка однородности каждого помеченного вида белка в клетках количественно после разделения с SDS-PAGE. Здесь видны необработанные данные изображений для различных молекулярных фракций белков из ликата клеток HeLa, а также положительные и отрицательные элементы управления.Пока и образец протеина и положительный экспонат управления между 100 и 500 пятнами в изображение, отрицательный контроль exhibits очень немногие к никаким. Это показывает, что процесс достаточно подавляет неспецифическую привязку красителей к поверхности крышки. Гистограммы интенсивности пятна для образцов протеина и положительного управления представляют множественные пики, которые представляют стохастическое связывание красителей к главным amines в протеинах и структурах тетрамера avadin соответственно.Все пятна показали мигание и пошаговую фотоотчет с непрерывным лазерным возбуждением, подчеркивая наблюдение на уровне одной молекулы. Заполняемость маркировки, или LO, затем рассчитывается из соотношения количества пятен в каждом образце белка к положительному контролю. LO измеряется из образца лизата клетки HeLa колеблется от 50% для меньшей молекулярной фракции веса, до 90% для более высокой молекулярной фракции веса.LO для всего образца протеома без разделения считается 72%Очень важно использовать свежеприготовленные реагенты и избегать пыли, особенно во время подготовки coverslips. После этой процедуры, анализ подсчета одной молекулы в определенном объеме может быть выполнен для количественной оценки концентраций каждого белка. Например, анализ любого сырого продукта, или гель и капиллярные продукты электрофорез, могут быть выполнены.Этот метод прокладывает путь для использования одной молекулы флуоресценции изображений молекулярной медицины, органической химии и анализа омиков. Преодолевая концепцию между концентрацией и числами. Концентрированный гидроксид натрия является коррозионным, и адекватную защиту следует носить при обращении с ним.Кроме того, высокой мощности лазерного излучения может привести к повреждению глаз, так что защитные очки могут носить.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Структурная информация от одной молекулы FRET Эксперименты с помощью быстрого нано-системы позиционирования

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...