Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Författarna tackar Masae Ohno och Kazuya Nishimura för experimental stöd och råd. Detta arbete stöddes av PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science och Technology Agency, Grants-in-aid för unga forskare (A) (24687022), utmanande förberedande forskning (26650055) och vetenskaplig forskning på innovativa områden (23115005), Japan Society for Främjande av vetenskap, och genom bidrag från stiftelsen Takeda vetenskap och Mochida Memorial Foundation för medicinsk och farmaceutisk forskning. S.L. erkänner stöd från programmet RIKEN internationella Program Associate (IPA).

1. cell förberedelse
<ol><li>Odla HeLa celler i en 10 cm skålen vid 37 ° C under 5% CO2 i Dulbecco ändrade örnens medium innehållande 10% fetalt bovint serum.</li>
	<li>Samla in exponentiellt växande celler när de har nått 70% konfluens, efter ATCC instruktioner17.<ol>
<li>Skölj celler med 5 mL av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,4). Ta bort PBS.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL 0,1% trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA). Inkubera i 5 minuter vid 37 ?...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Detta dokument beskriver ett protokoll för att kvantifiera märkning homogenitet av varje art som heter protein i cellerna efter separation med SDS-PAGE (steg 3). Metoden separation kan ersättas med andra metoder såsom vätskekromatografi eller kapillär elektrofores, som tillåter separation och fraktionering av cellulära proteiner med hög upplösning, samtidigt som kräver särskild utrustning23. Metoden märkning med NHS-ester i det nuvarande protokollet kan ersättas med andra metoder som...

Proteomet analys, som syftar till att kvantifiera hela uppsättningen av proteinmolekyler uttryckt i cellen, är en värdefull metod i nuvarande biologiska och medicinska studier. Denna analys är vanligen beroende av masspektrometri, som identifierar protein arter baserat på spectra genereras genom protein jonisering1,2,3. En alternativ metod för proteomet analys är elektrofores, inklusive polyakrylamid gelelektrofores (sida), kapillärelektrofores och tvådimensionell (2D) gelelektrofores. Denna metod förlitar sig på icke-specifik fluorescerande märkning av alla proteinmolekyler i de analyserade celler, följt av elektroforetisk separation och detektion och kvantifiering av varje art som protein. För att uppnå krävs icke-specifika protein märkning, är en strategi att använda fluorescerande färgämnen som kan binda till proteiner via elektrostatiska och hydrofoba interaktioner, till exempel Coomassie blå och Sypro-Ruby4,5,6 . En alternativ strategi är att använda kovalent märkning med färgämnen som innehåller N-hydroxysuccinimide (NHS) ester eller maleimide, som kovalent kan bindas till proteiner genom gemensamma rester såsom primära aminer och Tioler, respektive7, 8.
Samtidigt är fluorescens upptäckt känslighet idealisk för att analysera låg-överflöd proteiner och litet antal celler. Enda molekyl fluorescens bildbehandling är en av de mest känsliga metoder som möjliggör upptäckt av individuella fluorescerande färgämnen och märkta proteiner i vitro och in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Tillämpningen av denna bildgivande metod till elektrofores-baserade proteomet analys väntas möjliggöra mycket känsliga och kvantitativa analyser genom att räkna enskilda fluorescently-märkt proteiner. Det är dock fortfarande oklart om märkning med fluorescerande färgämnen är tillräckligt homogena över alla proteinmolekyler, och hur denna homogenitet påverkas av olika protein arter (figur 1). Enkla bulk mätningar kan användas för att erhålla en molar förhållandet av fluorescerande färgämnen till proteiner som kallas 'koppling effektivitet'8 eller 'märkning effektivitet', men detta boende ger inte information om homogenitet märkning bland proteinmolekyler.
Här beskriver vi protokollet för ett test att undersöka märkning homogenitet för alla protein arter i cellen (figur 2)16. De två viktigaste stegen av denna analys är protein rening och imaging. I det första steget, alla proteiner i celler märks fluorescently och biotinylerade, sedan extraherade separat med gelelektrofores följt av electroelution. I det andra steget utvärderas fluorescens egenskaper för enskilda proteinmolekyler i de extraherade proverna baserat på enda molekyl imaging. Från dessa data, parametrar viktigt för räknande analysen, såsom andelen proteiner märkt med åtminstone en färga, som vi kallar märkning beläggning (LO)16, och det genomsnittliga antalet fluorescerande färgämnen bunden till en enda proteinmolekyl (n̄ färgämne), kan karakteriseras. I protokollet, en optimerad förfarandet för märkning i HeLa cellen proteomet med NHS esterbaserade cyanin 3 (Cy3) färgämne presenteras som ett exempel, och kan ändras med andra märkning förfaranden enligt önskad forskning mål.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Cell proteom kännetecknas ofta med elektrofores analyser, där alla arter av proteiner i celler är icke-specifikt märkta med ett fluorescerande färgämne och är fläckig av en fotodetektor efter deras separation. Enda molekyl fluorescens imaging kan detektera ultrasensitive protein med dess förmåga för att visualisera individuella fluorescerande molekyler. Tillämpningen av denna kraftfulla bildgivande metod på elektrofores analyser hämmas dock av bristen på sätt att karakterisera homogenitet fluorescerande märkning av varje art som protein över proteomet. Här, utvecklat vi en metod för att utvärdera märkning homogenitet över det proteomet baserat på en enda molekyl fluorescens imaging test. I vår mätning HeLa cellen prov, andelen proteiner märkt med minst ett färgämne, som vi kalla 'märkning beläggning' (LO), var fast besluten att spänna från 50% till 90%, stödja tillämpningen av enda molekyl imaging att hög potential känslig och exakt proteomet analys.

Figur 4 representerar råbilddata för olika molekylvikt fraktioner av proteiner från HeLa cell lysate, liksom positiva och negativa kontrollen. Medan både protein prov och positiv kontroll uppvisar 100 – 500 ställen per bild, visar den negativa kontrollen ingen eller några fläckar, visar att protokollet tillräckligt hämmar icke-specifik bindning av färgämnen på täckglas ytan. Spot intensitet histogram för protein proverna och den positiva kontr...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma märkning homogenitet för varje protein art i ett komplex protein prov på nivån enda molekyl.

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Denna metod visar kalibreringen av kvantifierande proteinmängd i flytande prov med enmolekylprocess för räkning. Specifikt kan det illustrera hur proteinpopulationer kan fluorescerande märkas på varje molekylnivå. Tidigare metoder utförde bulkmätningar för att analysera molarkvoter av fluorescerande och proteinmolekyler, men de kan inte avslöja hur heterogena proteinpopulationer faktiskt är märkta.Våra metoder kan göra det direkt på enmolekylnivå. Vår metod kan utvidgas mot ultrakänsliga och avancerade molekylär koncentrationsanalyser, vilket kommer att leda till framtida diagnostiska metoder, vilket möjliggör effektiva fynd av patogena molekyler i exemplar. Vår metod kan tillämpas på enstaka proteinarter analys med hjälp av fluorescerande antikroppar, samt flera arter analys med hjälp av icke-specifika etiketter för alla de proteiner som separeras av elektrofores eller kromatografi.Den mest kritiska punkten i tekniken är att få data reproducerbarhet. Jag rekommenderar att hålla samma experimentella tillstånd så mycket som möjligt när man mäter flera prover. Visuell demonstration av denna teknik kommer att ge hur man gör varje experimentell steg stabil och reproducerbar.Det kommer också att visa några ovanliga steg i biokemi protokoll, såsom spin-beläggning och tvättning av mikroskop täcken. Påbörja den här proceduren genom att förbereda lysningsbufferten och 1%Tween-20 enligt skiss i textprotokollet. Använd natriumhydroxid för att justera pH-värdet till 12.Blanda 100 mikroliter av lysningsbuffert med en mikroliter av en molar DDT och fyra mikroliter på 50%CHAPS. Lägg till en mikroliter av den förberedda cellkulturen och homogenisera lösningen genom långsam pipettering för att undvika bubblor. Inkubera i mörker i rumstemperatur i fem minuter med mild agitation.Sedan, rehomogenize lösningen genom pipettering det upp och ner långsamt. Tillsätt ett mikrogram Cy3 NHS esterfärg och homogenisera lösningen genom att bromsa pipettering för att undvika bubblor. Inkubera i mörker i rumstemperatur i 10 minuter med mild agitation.Upprepa denna process, lägga till samma mängd färgämne och inkubera provet en gång. Tillsätt 100 mikroliter med 0,8 molar HEPES-natriumhydroxid för att justera lösningens pH-värde till 7,2 och för att släcka reaktionen. Långsamt pipetter upp och ner för att homogenisera lösningen.Därefter lägger du till 20 mikroliter av Biotin-2-amin och fem mikroliter av EDC. Homogenisera lösningen genom att pipettera upp och ner långsamt. Inkubera i mörker i rumstemperatur i en timme med mild agitation.Efter detta, använd en ultrafiltreringskolumn med en 10 kiloDalton cutoff för att avlägsna eventuella oreagerade märkningsreagenser och koncentrera provet. Efter att ha utfört standard SDS-PAGE för proteinprovet och en molekylär stege, bild gelen för att identifiera platsen för proteinbanden. Använd ett vasst blad för att skära ut gel portioner som inkluderar protein fraktioner av intresse baserat på band'platser.Ställ först ut täcken som är 22 millimeter med 22 millimeter och är 0,15 millimeter tjocka. Använd en plasmarengöringsmedel för att exponera täcken för luftplasma i en minut för att rengöra och aktivera deras ytor. Därefter använder en spin coater för att snurra coat täcken med 200 mikroliter av avadin buffert i fem sekunder vid 500RPM, följt av 30 sekunder vid 1000RPM.Inkubera täcken i rumstemperatur i 15 minuter för att låta dem lufttorka. För att förbereda täckplattor för proteinprovet, använd ett proteinprov som har spädts. Placera 100 mikroliter av det utspädda provet på mitten av de avadinbelagda täcksliparna.Inkubera i mörker i rumstemperatur i 15 minuter. För att förbereda den positiva kontrollen, placera 100 mikroliter av renat fluorescerande biotin i fem mikromolar HEPES-natriumhydroxid vid pH 7,2 i mitten av en avadin-belagda täcks täcks. Inkubera i mörker i rumstemperatur i 15 minuter.För att förbereda den negativa kontrollen, spin coat plasma coverslips med 200 mikroliter av fem HEPES-natriumhydroxid med två milligram per milliliter av BSA utan avadin. Tillsätt 100 mikroliter till renat fluorescerande biotin i fem mikromolar HEPES-natriumhydroxid vid pH 7.2. Inkubera i mörker i 15 minuter i rumstemperatur.Efter detta, skölj varje coverslip med 200 mikroliter av destillerat vatten genom pipettering i kanterna, se till att inte röra vid mitten av täcket med pipettspetsen. Upprepa denna tvätt tre gånger. Sedan, exponera lika många nya coverslips till luft plasma i en minut.Placera en rengjord täckplatta ovanpå varje prov-bunden täck för att undvika torkning. Starta upp ett brett fält eller evanescent fält fluorescens mikroskop. Ställ in ett täckskydd på mikroskopet och hitta fokus.Sedan, utföra en kakel skanning för att få minst 100 bilder. I denna studie kvantifieras märkningen homogenitet för varje märkt proteinart i celler efter separation med SDS-PAGE. De råa bilddata för olika molekylviktsfraktioner av proteiner från HeLa cell lysate, samt de positiva och negativa kontrollerna, ses här.Medan både proteinprovet och den positiva kontrollen uppvisar mellan 100 och 500 fläckar per bild, uppvisar den negativa kontrollen mycket få till ingen. Detta visar att processen tillräckligt hämmar icke-specifik bindning av färgämnen till täckunderlaget. Spotintensitetshistoogram för proteinproverna och den positiva kontrollen presenterar flera toppar, som representerar den stokastiska bindningen av färgämnen till primära aminer i proteiner respektive avadin tetramerstrukturer.Alla fläckar visade blinkande och stegvis photobleaching med kontinuerlig laser excitation, belyser observation på den enda molekylen nivå. Märkningen beläggning, eller LO, beräknas sedan från förhållandet mellan antalet fläckar i varje proteinprov till det i den positiva kontrollen. LO mätt från HeLa cellen lysate provet varierar från 50%för den mindre molekylvikt fraktion, till 90%för högre molekylvikt fraktion.LO för hela proteomprovet utan separation ses som 72%Det är kritiskt att använda nygråta reagenser och för att undvika eventuellt damm, särskilt under beredningen av täcksliparna. Efter denna procedur kan enstaka molekylräkningsanalys i en viss volym utföras för att kvantifiera varje proteins koncentrationer. Till exempel kan analys på någon rå produkt, eller gel och kapillärelektroforesprodukter, utföras.Denna teknik banar väg för att utnyttja enstaka molekyl fluorescens imaging till molekylär medicin, organisk kemi, och omics analys. Genom att överbrygga konceptet mellan koncentration och tal. Koncentrerad natriumhydroxid är frätande, och tillräckligt skydd bör användas vid hantering av den.Också, hög effekt laserstrålning kan orsaka ögonskador, så skyddsglasögon kan bäras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturell information från enda molekyl FRET Experiment Använda Fast Nano-positioneringssystem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...