Name: proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Yazarlar Masae Ohno ve Kazuya Nishimura deneysel yardım ve tavsiye için teşekkür ederiz. Bu eser PRESTO (JPMJPR15F7), Japonya bilim ve teknoloji ajansı, genç bilim adamları (A) (24687022), araştırmacı araştırma (26650055) zorlu ve yenilikçi alanlara (23115005), Japonya Derneği bilimsel araştırma için Grants-in-aid tarafından desteklenmiştir Bilim ve hibe Takeda Bilim Vakfı ve Mochida Anıtı Vakfı tarafından promosyon Medikal ve ilaç araştırma için. S.L. RIKEN Uluslararası Program ilişkilendirmek (IPA) programından destek kabul eder.

1. hücre hazırlık
<ol><li>HeLa hücreleri 37 ° C'de 10 cm tabak içinde yetiştirmek altında %5 CO2 ' Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum içeren.</li>
	<li>% 70 confluency, ATCC yönergeleri17takip alabilirseniz katlanarak büyüyen hücreleri toplamak.<ol>
<li>1 fosfat tamponlu tuz (PBS) (pH 7,4) x 5 mL hücrelerle durulayın. PBS kaldırın.</li>
		<li>1 mL %0.1 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. 37 ° C'de 5 dk kuluçkaya</li>
		<...

<ol>
	<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome.">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation.">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Background-free,+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex.">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li><li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain:+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection.">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li><li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization.">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines.">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li><li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein.">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li><li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel.">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique.">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li><li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples.">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li><li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Image+Processing.">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding.">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li><li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex.">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li><li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics.">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li><li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures.">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed,+Comprehensive,+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis.">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li></ol>

Bu kağıt ayırma SDS-sayfa (Adım 3) ile sonra etiketleme homojenliği hücrelerdeki her etiketli protein türlerin ölçmek için bir protokol açıklar. Ayırma yöntemi ayrılık ve ayırma proteinlerin yüksek çözünürlüklü, özel ekipman23gerektiren süre izin sıvı Kromatografi veya kapiller Elektroforez, gibi diğer yöntemleri ile yedek olabilir. NHS-ester içinde geçerli protokolü kullanılarak etiketleme yöntemi maleimide-ester veya antikorlar, örneğin kullanarak diğer yön...

Protein molekülleri hücre içinde ifade kümesinin tamamını ölçmek için amaçlayan Proteom analizleri, mevcut biyolojik ve tıbbi çalışmalar değerli bir yaklaşımdır. Bu analizin yaygın spectra protein iyonlaşma1,2,3ile oluşturulan temel protein türü tanımlar kütle spektrometresi kullanır. Elektroforez, polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) dahil olmak üzere, Kapiler Elektroforez ve iki boyutlu (2D) Jel Elektroforez Proteom analizler için alternatif bir yöntem olduğunu. Bu yöntem belirsiz floresan elektroforetik ayrımı ve algılama ve miktar her protein türlerin takip analiz hücrelerdeki tüm protein molekülleri etiketlerine göre üzerinde dayanır. Gerekli non-spesifik protein etiketleme elde etmek için bir strateji proteinler Coomassie mavi ve Sypro Ruby4,gibi5,6 Elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla bağlayabilirsiniz floresan boyalar kullanmaktır . N-hydroxysuccinimide (NHS) ester veya hangi kovalent proteinler Birincil aminler ve thiols gibi ortak artıkları ile bağlayabilirsiniz, maleimide, sırasıyla7, içeren boya ile kovalent etiketleme kullanmak için alternatif bir stratejidir 8.
Bu arada, Floresans algılama hassasiyeti düşük-bereket proteinler ve az sayıda hücre analiz etmek için idealdir. Tek molekül Floresans görüntüleme bireysel floresan boyalar ve in vitro ve içinde vivo9,10,11,12etiketli proteinler algılanmasını sağlayan en önemli yöntemlerinden biridir, 13,14,15. Bu görüntüleme yönteminin uygulamaya Proteom Elektroforez tabanlı analiz bireysel fluorescently etiketli protein sayımı tarafından son derece hassas ve kantitatif testleri etkinleştirmek için bekleniyor. Ancak, bu floresan boyalar ile etiketleme tüm protein molekülleri yeterince homojen olup olmadığı ve nasıl bu homojenliği farklı protein türler (şekil 1) tarafından etkilenir belirsizdir. Basit toplu çözüm ölçümleri8 'verimlilik kaplin' veya 'verimlilik etiketleme' denilen proteinlere floresan boyalar molar oranı elde etmek için kullanılabilir, ancak bu özellik arasında etiketleme homojenliği ilgili bilgi sağlamaz protein molekülleri.
Burada, biz tüm protein türleri16hücre (Şekil 2) için etiketleme homojenliği araştırmak bir tahlil için protokol tanımlamak. Bu testin iki anahtar adım protein saflaştırma ve görüntüleme vardır. İlk adımda, hücrelerdeki tüm proteinler fluorescently etiketlenir ve biotinylated sonra ayrı ayrı Jel Elektroforez kullanarak ayıklanır, electroelution tarafından takip. İkinci adımda, ayıklanan örneklerinde bireysel protein, Floresans özelliklerini tek molekül görüntüleme üzerinde göre değerlendirilir. Bu veri, parametreleri gibi proteinler yüzdesi ile en azından bir tane etiketli sayım çözümleme için önemli boya, hangi etiketleme doluluk (LO)16dediğimiz ve floresan boyalar ortalama sayısı bir tek protein molekülüne bağlı (n̄ boya), karakterize edilebilir. İletişim kuralı ' HeLa hücre Proteom NHS ester tabanlı siyanür 3 (Cy3) boya ile etiketleme için en iyi duruma getirilmiş bir yordam bir örnek olarak sunulur ve istenen araştırma hedeflerine göre etiketleme diğer yordamlar ile değiştirilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">22x22x0.15 mm coverslip</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">470019-004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm Argon laser</td>
			<td style="width:119px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">Innova 70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm dichroic mirror</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF495-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">488 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-520/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm dichroic filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">Di02-R561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">560 nm emission filter</td>
			<td style="width:119px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF02-617/73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">560 nm fiber laser</td>
			<td style="width:119px;">MBP Communications</td>
			<td style="width:136px;">F-04306-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60x oil immersion lens</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">PLAPON 60x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">03553-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-PEG-amine</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">21346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotinylated Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:119px;">Nanocs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borate</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A9547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:119px;">Dojindo</td>
			<td style="width:136px;">C008-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cy3 NHS-ester dye</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">PA13101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dialyzer&#160; - D-tube, 6-8 kDa</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">71507-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;">14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDC</td>
			<td style="width:119px;">Nacalai-tesque</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Andor</td>
			<td style="width:136px;">IiXon 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epi fluorescence microscope</td>
			<td style="width:119px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Gel viewer</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">ImageQuant LAS 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:119px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:119px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">NC0792960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Size purification column 10K</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteome-wide quantification of labeling homogeneity at the single molecule level

Hücre proteomes kez Elektroforez deneyleri, nerede proteinler hücrelerdeki tüm türlerin özellikle sigara floresan bir boya ile etiketlenir ve ayırma takip photodetector tarafından fark kullanarak karakterizedir. Tek molekül Floresans görüntüleme NEMS protein algılama bireysel floresan moleküllerin görüntülenmesi için onun yetenek sağlayabilir. Ancak, bu güçlü görüntüleme yöntemi uygulamaya Elektroforez deneyleri floresan her protein türleri arasında Proteom etiketleme homojenliği karakterize için yollar eksikliği ile engel oluyor. Burada, bir tek molekül Floresans görüntüleme tahlil dayalı Proteom genelinde etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. Bir HeLa hücre örnek, biz 'doluluk etiketleme' olarak adlandırdığı en az bir boya ile etiketli protein oranı kullanarak bizim ölçüm (LO), Aralık için uygulamanın tek molekül görüntüleme için yüksek potansiyel destekleyen %90 %50 belirlendi duyarlı ve hassas Proteom analizleri.

Şekil 4 ham görüntü verilerine HeLa hücre lysate proteinlerin farklı molekül ağırlığı kesirler için hem de pozitif ve negatif Denetim temsil eder. Sergi 100-500 noktalar resim başına protein örnek ve pozitif kontrol, negatif kontrol yok veya birkaç noktalar, protokol yeterince coverslip yüzeye boyalar spesifik olmayan bağlama engeller gösterilen görüntüler. Nokta yoğunluğu histogramlar protein örnekleri ve olumlu denetim boyalar Stok...

Watch this Scientific Journal Video about Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level at JoVE.com

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Bu yöntem, sıvı numunede protein miktarının sayısallaştırılmasının tek moleküllü proses ile sayma için kalibrasyonunu göstermektedir. Özellikle, protein popülasyonlarının her molekül seviyesinde floresan olarak nasıl etiketlenebileceğini gösterebiliyor. Daha önceki yöntemler floresan ve protein moleküllerinin molar oranlarını analiz etmek için toplu ölçümler yapmış, ancak protein popülasyonlarının gerçekte ne kadar heterojen olarak etiketlendiğini ortaya çıkaramamaktadır.Yöntemlerimiz bunu doğrudan tek molekül seviyesinde yapabilir. Yöntemimiz, numunelerde patojenik moleküllerin verimli bulgularına olanak sağlayacak, gelecekteki tanı yöntemlerine yol açacak olan ultra duyarlı ve gelişmiş moleküler konsantrasyon tahlillerine doğru genişletilebilir. Yöntemimiz floresan antikorlar kullanılarak tek protein türleri analizine ve elektroforez veya kromatografi ile ayrılan tüm proteinler için spesifik olmayan etiketler kullanılarak birden fazla tür analizine uygulanabilir.Tekniğin en kritik noktası veri tekrarlanabilirliği elde etmektir. Birden fazla örneği ölçerken aynı deneysel durumu mümkün olduğunca korumanızı öneririm. Bu tekniğin görsel gösterimi, her deneysel adımın kararlı ve tekrarlanabilir hale getirilen nasıl sağlanacaktır.Ayrıca, mikroskop kapaklarının spin kaplaması ve yıkanması gibi biyokimya protokollerinde de nadir bir adım olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi lysing tampon ve%1 Tween-20'yi hazırlayın. pH'ı 12'ye ayarlamak için sodyum hidroksit kullanın.100 mikrolitre lysing tamponu ile bir molar DDT mikrolitresini ve dört mikrolitre %50 CHAPS'yi karıştırın. Hazırlanan hücre kültürünün bir mikrolitre ekleyin ve kabarcıklar önlemek için yavaş pipetleme tarafından çözelti homojenize. Hafif ajitasyon ile beş dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.Daha sonra, yavaş yavaş yukarı ve aşağı borulama tarafından çözelti rehomojenize. Cy3 NHS ester boya bir mikrogram ekleyin ve kabarcıklar önlemek için pipetleme yavaşlatarak çözelti homojenize. Hafif ajitasyon ile 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.Aynı miktarda boya ekleyerek ve numuneyi bir kez kuluçkaya yatırarak bu işlemi tekrarlayın. Çözeltinin pH'ını 7,2'ye ayarlamak ve reaksiyonu gidermek için 100 mikrolitre 0,8 molar HEPES-sodyum hidroksit ekleyin. Çözeltiyi homojenize etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet.Sonra, Biotin-2-amin ve EDC beş mikrolitre 20 mikrolitre ekleyin. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı borular oluşturarak çözeltiyi homojenize edin. Hafif ajitasyon ile bir saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.Bundan sonra, tepkisiz etiketleme reaktiflerini çıkarmak ve numuneyi yoğunolarak konsantre etmek için 10 kiloDalton kesme ile ultrafiltrasyon sütunu kullanın. Protein numunesi ve moleküler merdiven için standart SDS-PAGE yaptıktan sonra, protein bantlarının yerini belirlemek için jeli görüntüleyin. Bantların konumlarına göre protein fraksiyonları içeren jel kısımlarını kesmek için keskin bir bıçak kullanın.İlk olarak, 22 milimetre tarafından 22 milimetre ve 0.15 milimetre kalınlığında kapakları dışarı ayarlayın. Yüzeylerini temizlemek ve etkinleştirmek için kapakları hava plazmasına bir dakika lığına maruz bırakmak için bir plazma temizleyicikullanın. Daha sonra, 500RPM beş saniye için avadin tampon 200 mikrolitre ile coverlips spin için bir spin coater kullanın, 1000RPM 30 saniye takip.Kapak dudaklarını oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırArak havanın kurumasını bekleyin. Protein örneği için kapak lar hazırlamak için seyreltilmiş bir protein örneği kullanın. Seyreltilmiş numunenin 100 mikrolitresini avadin kaplı kapakların ortasına yerleştirin.15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Pozitif kontrolü hazırlamak için, pH 7.2'de beş mikromolar HEPES-sodyum hidroksite 100 mikrolitre saflaştırılmış floresan biyotin yerleştirin. 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.Negatif kontrolü hazırlamak için spin coat plazma, avadin olmadan mililitre başına iki miligram olan beş HEPES-sodyum hidroksitin 200 mikrolitresi ile kapakları kapsamaktadır. PH 7.2'de beş mikromolar HEPES-sodyum hidroksitte saflaştırılmış floresan biyotine 100 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika karanlıkta kuluçkaya yat.Bundan sonra, her coverslip'i 200 mikrolitre distile su ile durulayın, kenarlarında borular ile tutarak, pipet ucuyla kapak kaymanın ortasına dokunmamaya özen. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Daha sonra, bir dakika lığına eşit sayıda yeni kapak dudakını hava plazmasına maruz bırakın.Kurumasını önlemek için numuneye bağlı her kapak lı nın üzerine temizlenmiş bir kapak fişi yerleştirin. Geniş alan veya evanescent alan floresan mikroskobu başlatın. Mikroskoba bir kapak kayması ayarlayın ve odak noktasını bulun.Ardından, en az 100 görüntü elde etmek için bir döşeme tayini gerçekleştirin. Bu çalışmada, hücrelerde etiketlenmiş her protein türünün etiketleme homojenliği SDS-PAGE ile ayrıldıktan sonra ölçüldü. HeLa hücre lisatından proteinlerin farklı molekül ağırlıklı fraksiyonlarının ham görüntü verilerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de burada görülmektedir.Hem protein örneği hem de pozitif kontrol görüntü başına 100 ile 500 nokta arasında sergilenirken, negatif kontrol çok az ıstabiri yok. Bu, sürecin boyaların kapak yüzeyine spesifik olmayan bağlanmasını yeterince engellediğini gösterir. Protein örnekleri ve pozitif kontrol için spot yoğunluklu histogramlar, boyaların proteinlerdeki primer aminlere ve avadin tetramer yapılarına stokstik bağlanmasını temsil eden birden fazla tepe yi tir.Tüm noktalar sürekli lazer uyarma ile yanıp sönen ve adım adım fotobeyazlatma gösterdi, tek molekül düzeyinde gözlem vurgulayarak. Etiketleme doluluk, ya da LO, daha sonra pozitif kontrol de her protein örnekleke lerinin oranı hesaplanır. HELa hücreli lysate numunesinden ölçülen LO, daha küçük molekül ağırlık fraksiyonu için %50 ile daha yüksek molekül ağırlık fraksiyonu için %90 arasında değişmektedir.Tüm proteom numunesinin ayrıştırılmadan LO'su %72 olarak görülür Özellikle kapak kapaklarının hazırlanması sırasında taze yapılmış reaktiflerin kullanılması ve tozdan kaçınmak önemlidir. Bu işlemden sonra, her proteinin konsantrasyonlarını ölçmek için belirli bir hacimde tek molekül sayma analizi yapılabilir. Örneğin, herhangi bir ham ürün veya jel ve kılcal elektroforez ürünleri üzerinde analiz yapılabilir.Bu teknik, tek moleküllü floresan görüntülemenin moleküler tıp, organik kimya ve omik analizine kullanılmasının önünü açar. Konsantrasyon ve sayılar arasındaki kavramı birleştirerek. Konsantre sodyum hidroksit aşındırıcıdır ve kullanım sırasında yeterli koruma takılmalıdır.Ayrıca, yüksek güçlü lazer radyasyongöz hasarına neden olabilir, bu yüzden koruyucu gözlük takılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...