Name: a positioning device for the placement of mice during intranasal sirna delivery to the central nervous system
Uploaded: 2019-08-15T12:30:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System at JoVE.com

इस काम को कोरिया के स्वास्थ्य एवं कल्याण मंत्रालय (HI17C1046) ने एस.के.एल.

सभी प्रयोग Hanyang विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुपालन में किया गया. इस प्रोटोकॉल में, 6-सप्ताह पुराने Balb/c चूहों वजन 20-25 ग्राम का इस्तेमाल किया गया(द $ 3 प्रति समूह). पशुओं को एक रोगज़नक़-मुक्त सुविधा में रखा गया था जिसमें 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र ों को नियंत्रित तापमान और आर्द्रता के स्तर पर पानी और भोजन तक निशुल्क पहुंच के साथ रखा गया था।
1. डिवाइस असेंबली
<ol><li>स्थिति उपकरण के अलग-अलग भागों को इकट्ठा करें जैसा कि चित्र 1कमें दिखाया गया है। नोट: डिवाइस आसानी से इकट्ठा और disassembled किया जा सकता है कि अलग-अलग भागों में आपूर्ति की है।</li>
</ol>2. सामग्री सेटअप
नोट: तरलीकृत दवाओं के प्रशासन में निम्नलिखित pretreatment कदम की आवश्यकता है.
<ol><li>स्थिति डिवाइस, एक 10 डिग्री एल micropipette, 10 $L micropipette युक्तियाँ, एक उपचार समाधान (उदा., RVG9R-siRNA जटिल), एक टाइमर घड़ी, और 70% इथेनॉल सहित आवश्यक सामग्री तैयार करें (चित्र 2Aको देखें).</li>
	<li>प्रयोग से कम से कम 15-20 मिनट पहले डिवाइस हीटिंग सिस्टम चालू करने के लिए पावर कोड प्लग करें. पशु प्रयोगों के लिए इष्टतम तापमान स्वचालित रूप से $ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है।</li>
	<li>संज्ञाहरण ketamine तैयार करें:xylazine: फॉस्फेट-बफर नमकीन (PBS) 1:0.5:8.5 के अनुपात में और एक एकल intraperitoneal (i.p.) इंजेक्शन के साथ प्रत्येक माउस anesthetize 200 $L प्रति 20 ग्राम माउस की एक अंतिम मात्रा में। नोट: कृपया ध्यान दें कि 30-45 मिनट की अवधि के लिए संज्ञाहरण की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए किसी भी अनुकूलित दवा का इस्तेमाल किया जा सकता है।</li>
</ol>3. माउस स्थिति
<ol><li>सर्जिकल विमान को बनाए रखने के लिए पेडल रिफ्लेक्स (फर्म टो चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करें।</li>
	<li>स्थिति डिवाइस को उचित दूरी और ऊँचाई पर रखें ताकि सभी आवश्यक अभिकर्मकों को सुविधाजनक पहुँच प्रदान की जा सके।</li>
	<li>एक बार चूहों को ठीक से anesthetized कर रहे हैं, धीरे अंगूठे और सूचक उंगली के साथ उनकी गर्दन के scruff द्वारा प्रत्येक माउस उठा और यह नामित कुर्सी पर जगह है.</li>
	<li>कुर्सी पर माउस की उचित स्थिति इस स्तर पर बहुत महत्वपूर्ण है. कुर्सी के पीछे समर्थन करने के लिए माउस वापस समानांतर रखना, और कुर्सी की सीट के लिए 90 डिग्री पर. माउस से हाथ उठाएं और जानवर को सिर में स्वाभाविक रूप से लेटने दें और आगे की स्थिति में, धक्का या दबाने के बिना, जैसा कि चित्र 2खमें दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि माउस के forelimbs प्राकृतिक समर्थन प्रदान करते हुए जानवर इस आराम की स्थिति में है, माउस के लिए किसी भी असुविधा के बिना.</li>
	<li>एक बार चूहों को ठीक से तैनात कर रहे हैं, कुर्सी बेल्ट के साथ में चूहों का पट्टा, और तुरंत IN inoculation शुरू करते हैं.</li>
</ol>4. इंट्रानैसल डिलीवरी
नोट: यह प्रोटोकॉल माउस स्थिति डिवाइस का उपयोग कर RVG9R:siRNA परिसरों के IN वितरण का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, समाधान की अधिकतम 20-30 $L को 2 $L बूंदों में प्रत्येक माउस को आसानी से प्रशासित किया जा सकता है। यह मात्रा माउस की नाक गुहा की तुलना में कम है, जो 0.032 सेमी3है, इसलिए प्रक्रिया घातक नाक बाधा या asphyxiation में परिणाम नहीं है। इस प्रोटोकॉल कम से कम चार चूहों और डिवाइस प्रति आठ चूहों की एक अधिकतम के एक साथ टीका के लिए अनुमति देता है, समय अनुकूलन और कम परिवर्तनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप.
<ol><li>10 डिग्री सेल्सियस माइक्रोपिपेट लें और इसे 2 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें।</li>
	<li>RVG9R के 2 $L के साथ micropipette लोड: siRNA जटिल समाधान (उदाहरण के लिए, 5.2 डिग्री siCy5 के वितरण प्रयोग के लिए RVG9R के 104 $g के साथ जटिल है, और siSOD1 के 13.5 g के साथ जटिल 270 डिग्री RVG9R के siles के प्रयोग के लिए, siles के एक अंतिम मात्रा में, PBS युक्त के एक अंतिम मात्रा में 5% ग्लूकोज.</li>
	<li>प्रमुख हाथ में पिपेट पकड़े हुए, बेंच शीर्ष पर एक कोहनी रखकर स्थिति को समायोजित करें। प्रशासन करते समय अनियंत्रित आंदोलनों से बचने के लिए दूसरे हाथ से पिपेट पकड़े हाथ का समर्थन करें।</li>
	<li>एक $2 $L ड्रॉप को एक नथुने के बहुत निकट रखें ताकि चूहा सीधे छोटी बूंद को श्वास ले सके (चित्र 2खको संदर्भित करें)। यदि एक छोटी सी बूंद आसानी से गठन नहीं है, तो एक नया एक के साथ पिपेट टिप की जगह और ऑपरेशन दोहराएँ। inoculations के बीच समय अंतराल सत्यापित करने के लिए स्टॉपवॉच का उपयोग करें।</li>
	<li>इस डिवाइस के एक समय में कम से कम चार चूहों के उपचार के लिए अनुमति देता है. यदि चूहों के किसी अन्य समूह के लिए कदम 4.4 दोहराने की आवश्यकता है, चार कुर्सियों के साथ ऊपर या नीचे चार कुर्सियों के साथ चार कुर्सियों के साथ एक और बार सेट करने के लिए डिवाइस पर एक समय में आठ चूहों को समायोजित.</li>
	<li>पहले टीका से 3-4 मिनट के बाद अन्य नाक के साथ चरण 4.4 दोहराएँ। इस समय अंतराल माउस पहली खुराक के साँस लेना पूरा करने और सामान्य साँस लेने को बहाल करने के लिए पर्याप्त है. यदि श्वास समाधान की एक बूंद माउस के नारिस से आकस्मिक खर्राटों के कारण अलग हो जाती है, तो समाधान के अतिरिक्त 2 $L को फिर से व्यवस्थित करें।</li>
	<li>20-30 जेडएल खुराक समाप्त होने तक वैकल्पिक नाक के साथ पूरी प्रक्रिया को दोहराएँ। यह पूरी टीका प्रक्रिया को पूरा करने के लिए $ 30-45 मिनट लगेंगे।</li>
	<li>चूहों को उनके नामित पिंजरों में वापस लौटने से पहले चूहों की आंखों पर गीला मरहम रखो। नोट: चूहों को तब तक न छोड़ें जब तक कि वे कठोर भार को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न करें।</li>
</ol>5. डेटा विश्लेषण
<ol><li>Fluor लेबल RVG9R के मस्तिष्क जमाव की पुष्टि करने के लिए, चूहों anesthetize (के रूप में कदम में वर्णित 2.3) और मस्तिष्क को अलग, साथ ही अन्य परिधीय अंगों, जैसे फेफड़ों, जिगर, तिल्ली, और गुर्दे. ImageStation पर प्रत्येक अंग रखें और ImageStation का उपयोग कर फ्लोरोसेंट कल्पना.</li>
	<li>Cy5-लेबल के कारण फ्लोरोसेंट कल्पना करने के लिए, 20 m-थिक cryosections तैयार, Hoechst 33342 के साथ costained, और एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ पूर्ण मस्तिष्क स्कैनिंग प्रदर्शन.</li>
	<li>जीन silencing का आकलन करने के लिए, इस तरह के घ्राण बल्ब के रूप में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से आरएनए निकालने, प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस, thalamus, hypothalamus, सेरिबैलम, और मस्तिष्क स्टेम, एक आरएनए शोधन किट के साथ, एक CDNA का उपयोग कर CDNA में रिवर्स-ट्राक्शन संश्लेषण किट, और पहले वर्णित के रूप में प्राइमर जोड़े के साथ QPCR प्रदर्शन15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+bottleneck+in+brain+drug+development.">The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development.</a> NeuroRx. 2, 3-14 (2005).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).</li><li>Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+brain+targeting+drug+delivery+system+by+nasal+route.">Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route.</a> Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).</li><li>Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+proteins+and+peptides+in+the+treatment+of+neurodegenerative+diseases.">Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases.</a> The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).</li><li>Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nose+to+brain+drug+delivery+via+integrated+nerve+pathways+bypassing+the+blood-brain+barrier:+an+excellent+platform+for+brain+targeting.">Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).</li><li>Agrawal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nose-to-brain+drug+delivery:+An+update+on+clinical+challenges+and+progress+towards+approval+of+anti-Alzheimer+drugs.">Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs.</a> Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).</li><li>Van Woensel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulations+for+intranasal+delivery+of+pharmacological+agents+to+combat+brain+disease:+a+new+opportunity+to+tackle+GBM.">Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM.</a> Cancers. 5, 1020-1048 (2013).</li><li>Kulkarni, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology-mediated+nose+to+brain+drug+delivery+for+Parkinson's+disease:+a+mini+review.">Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review.</a> Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).</li><li>Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system:+mechanisms+and+experimental+considerations.">Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).</li><li>Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+CNS+therapeutics+to+awake+mice.">Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).</li><li>Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+anatomy+and+head+position+on+intranasal+drug+deposition.">Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head &amp; Neck. 263, 827-832 (2006).</li><li>Zeller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+cell-binding+ligands+to+arginine-rich+cell-penetrating+peptides+enables+cytosolic+translocation+of+complexed+siRNA.">Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 50-62 (2015).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+CCR2+in+macrophages+alleviates+adipose+tissue+inflammation+and+the+associated+metabolic+syndrome+in+dietary+obese+mice.">Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system.">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39 (2007).</li><li>Beloor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA-mediated+control+of+virus+replication+in+the+CNS+is+therapeutic+and+enables+natural+immunity+to+West+Nile+virus.">Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23, 549-556 (2018).</li><li>Ullah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trileucine+residues+in+a+ligand-CPP-based+siRNA+delivery+platform+improve+endosomal+escape+of+siRNA.">Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA.</a> Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).</li><li>Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+therapeutic+stem+cells+to+glioblastoma+in+a+mouse+model.">Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).</li><li>Mittal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+direct+nose+to+brain+delivery:+current+status+and+future+perspective.">Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective.</a> Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).</li><li>Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+siRNA+to+the+olfactory+bulbs+of+mice+via+the+olfactory+nerve+pathway.">Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway.</a> Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).</li><li>Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falc&#227;o, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+carbamazepine+to+mice:+a+direct+delivery+pathway+for+brain+targeting.">Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).</li><li>Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+insights+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacokinetic-pharmacodynamic+studies:+towards+prediction+of+nose-to-brain+transport+in+humans.">Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans.</a> The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).</li></ol>

पी.के. और एस.के.एल. सिनेट बायोटेक के सह-संस्थापक हैं। पी.के. पेटेंट पीसीटी/US07/12,152 के आविष्कारक हैं, जिसमें आंशिक रूप से RVG9R से संबंधित दावे शामिल हैं। I.U., K.C., P.K., और S.K.L. एक प्रस्तुत पेटेंट (PCT/KR2016/014220) है, जो एक माउस स्थिति डिवाइस से संबंधित दावे भी शामिल है के coinventors के रूप में सूचीबद्ध हैं.

हमने चूहों को चिकित्सकीय ों की नाक से मस्तिष्क के वितरण के लिए बेहतर स्थिति के लिए एक माउस पोजीशनिंग उपकरण विकसित किया है। डिवाइस जानवरों की आसान एक साथ हैंडलिंग सुनिश्चित करने, विभिन्न कार्यक्षमताओं के साथ सुसज्जित है। यह भी प्रयोग के दौरान जानवरों के शारीरिक शरीर के तापमान के रखरखाव के लिए हीटिंग पैड के साथ सुसज्जित है. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को विशेष रूप से डिजाइन की गई कुर्सियों के माध्यम से सिर में नीचे और आगे की स्थिति में बनाए रखा जा सकता है, जानवरों के लिए कम से कम असुविधा के साथ। स्थिति कुर्सियों की ऊंचाई इस तरह से समायोजित किया जा सकता है के रूप में सबसे अच्छा है पशु नाक कल्पना करते हुए दवाओं के प्रशासन.
मस्तिष्क वितरण में नाक के छोटे सतह क्षेत्र सहित कई आंतरिक सीमाएं हैं (प्रशासन के अनुसार अधिकतम मात्रा 20-30 डिग्री सेल्सियस की अनुमति),नाक में जलन, उपकला क्षति, और नाक उपकला 18 भर में सीमित अवशोषण . सुपिन स्थिति में रखा चूहों के लिए दवाओं के प्रशासन में पाइपेट या polyurethane ट्यूबिंग के माध्यम से पशुओं के वैकल्पिक nares में तरल दवाओं को छोड़ने के द्वारा मस्तिष्क की डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया गया है (24 जी x 19 मिमी) microliters सिरिंज से जुड़े19, 20.यद्यपि घ्राण उपकला के निकट दवाओं को छोड़ने के लिए ट्यूबिंग सिस्टम का उपयोग एक संभावित उपयुक्त तरीका है, फिर भी यह दोहराए जाने वाले प्रशासन पर जलन या नाक की सूजन का कारण बनता है. इसके अलावा, नाक गुहा के छोटे आकार इस दृष्टिकोण को सीमित करता है, विशेष रूप से चूहों में जो दोहराने से दूर हो सकता है, साथ ही दवा योगों द्वारा जो नाक श्लेष्म में बनी रहती है। एक अन्य विकल्प चूहों को जगाने के लिए चिकित्सा विज्ञान के प्रशासन मेंहै 10. हालांकि, इस दृष्टिकोण IN टीका के दौरान पशु हैंडलिंग के लिए कुशल प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. इसके अतिरिक्त, यह पशु तनाव का कारण बनता है और, इसलिए, रोग मॉडल, विशेष रूप से संक्रामक रोग मॉडल के लिए आदर्श नहीं है। इसके अलावा, असंगत dosing आसानी से फेफड़ों या अपूर्ण पशु मनोरंजक के कारण पेट में दवा जल निकासी से परिणाम हो सकता है. यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण वैज्ञानिकों इन तकनीकी बाधाओं को दूर करने के लिए अनुमति देता है. सिर नीचे और आगे की स्थिति मस्तिष्क के लिए प्रत्यक्ष और चयनात्मक siRNA प्रसव के पक्ष में, साँस लेने के दौरान नाक से फेफड़ों के लिए दवा रिसाव की संभावना कम कर देता है। माउस पोजीशनिंग डिवाइस का उपयोग कर वितरण में टीका लगाने के दौरान जानवरों को संभालने या मनोरंजक बनाने के लिए किसी विशेष तकनीक की आवश्यकता नहीं होती है। एक समय में चार जानवरों को कम से कम 30-45 मिनट की अवधि के लिए इलाज किया जा सकता है। प्रक्रिया एक अतिरिक्त चार कुर्सी पट्टी सहित द्वारा बढ़ाया जा सकता है, एक ही प्रयोगात्मक सत्र में अप करने के लिए आठ चूहों के आसान प्रबंधन के लिए अनुमति देता है. इसलिए, इस विधि का पालन करते हुए, एक ऑपरेटर समय की विस्तारित अवधि में जानवरों के बड़े समूहों के दिमाग में दवा वितरण को प्रेरित कर सकता है।
नाक गुहा की शारीरिक संरचना दृढ़ता से नाक से मस्तिष्क वितरण को प्रभावित करती है (के रूप में Merkus एट अल11 और Ruigrok और डे लैंग21द्वारा की समीक्षा की). चूहों में नाक गुहा के सापेक्ष सतह क्षेत्र मनुष्यों की तुलना में 15 गुना बड़ा है और घ्राण उपकला का सापेक्ष सतह क्षेत्र 6 गुना बड़ा है। हालांकि वहाँ मनुष्यों में नाक गुहा के शरीर रचना विज्ञान में महत्वपूर्ण मतभेद कृन्तकों के लिए कर रहे हैं, वहाँ लगभग 45 नैदानिक परीक्षण कई मस्तिष्क विकारों के इलाज के लिए IN दृष्टिकोण का उपयोग कर चल रहे हैं (www.clinicaltrials.gov). यहाँ प्रस्तुत अध्ययन इंगित करता है कि चिकित्सा के वितरण में उपयोग करते समय, वैज्ञानिकों को कई कारकों पर विचार करना चाहिए, जैसे सिर की स्थिति, सो, और उचित प्रसव एजेंट.
हम माउस मस्तिष्क के लिए फ्लोरोसेंट लेबल siRNA के कुशल और विशिष्ट बयान दिखाया है. इसके अलावा, SOD1 जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी IN SiRNA वितरण कार्यात्मक प्रभाव की पुष्टि के बाद मनाया. हम पहले लगातार पता चला है कि RVG9R-siRNA परिसरों पश्चिम नील नदी वायरस (WNV) आरएनए को लक्षित के प्रशासन में WNV एन्सेफलाइटिस15पर एक मजबूत चिकित्सीय प्रभाव डालती है. विशेष रूप से, नाक से मस्तिष्क siRNA वितरण एक सेल-लक्ष्यीकरण ligand (RVG) और एक सकारात्मक आरोप अणु (9R) जटिल siRNA के लिए आवश्यक है. इन तत्वों की अनुपस्थिति में, अणुओं को प्रणालीगत परिपथ तथा लसीका वाहिकाओं 48 ज पोस्टट्रीटमेंट (चित्र 3क)15के माध्यम से साफ किया गया था । इसलिए, यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक सेटअप में, हम केवल मस्तिष्क में विशेष रूप से बनाए रखा स्तर छवि के लिए टीका लगाने के बाद पेप्टाइड/siRNA स्थानीयकरण 48 एच की जांच की है। इस दृष्टिकोण को आसानी से अन्य अणुओं की डिलीवरी के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे प्रोटीन, पेप्टाइड्स, और नैनोकणों, या अन्य चिकित्सकीय, मस्तिष्क से संबंधित विकारों की एक संख्या के उपचार के लिए.

बीबीबी ने सीएनएस और मस्तिष्क1को प्रभावित करने वाले रोगों के लिए चिकित्सीय जैव अणुओं के वितरण के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत करते हुए 400-600 दा के व्यवस्थित रूप से प्रशासित अणुओं को मस्तिष्क में प्रवेश करने से रोकता है। मस्तिष्क के लिए प्रत्यक्ष दवा वितरण स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, यह शल्य विशेषज्ञता की आवश्यकता है और इंजेक्शन साइट के निकट क्षेत्रों के लिए वितरण में अत्यधिक प्रतिबंधित है, यह नियमित नैदानिकउपयोगके लिए अनुपयुक्त बना 2 . मस्तिष्क को प्रसव में भी BBB को दरकिनार करके प्रत्यक्ष मस्तिष्क वितरण में परिणाम कर सकते हैं, मस्तिष्क को पदार्थों की एक किस्म के प्रत्यक्ष और तेजी से हस्तांतरण के लिए अनुमति3,4. इस हस्तांतरण घ्राण और trigeminal नसों है कि मस्तिष्क, मस्तिष्कमेरु द्रव, और लसीका प्रणाली5करने के लिए नाक मार्ग कनेक्ट के माध्यम से परिवहन तंत्र द्वारा होने के लिए सोचा है. के रूप में प्रत्यक्ष नाक से मस्तिष्क मार्ग परिधीय अंगों और ऊतकों को शामिल नहीं करता है, यह काफी प्रणालीगत दुष्प्रभाव कम कर देता है और शक्ति में सुधार. प्रशासन में चिकित्सीय एजेंटों के मस्तिष्क वितरण के लिए दोनों स्थानीय और प्रणालीगत मार्गों के लिए एक आशाजनक noninvasive विकल्प है और अल्जाइमर रोग सहित मस्तिष्क संबंधी विकारों का मुकाबला करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, पार्किंसंस रोग, और मस्तिष्क कैंसर , और कई नैदानिक परीक्षणों में पता लगाया जा रहा है6,7,8.
कई प्रयोगात्मक कारक, जैसे मात्रा और टीका की विधि, साथ ही निर्माण पीएच, नाक से मस्तिष्क मार्ग9के माध्यम से सीएनएस को दवा वितरण को दृढ़ता से प्रभावित करते हैं। चूहों के साथ अध्ययन में, IN दवा वितरण की सफलता दृढ़ता से उचित सिर स्थिति पर निर्भर करता है, जो कुशल मस्तिष्क जमाव के लिए महत्वपूर्ण है और बाहरी वातावरण या वायुमार्ग में दवा जल निकासी से बचने के लिए. विशेष रूप से, कृंतक अध्ययन के बहुमत घ्राण उपकला के लिए दवा वितरण के लिए एक 70 डिग्री-90 डिग्री झुकाव के साथ एक सिर वापस स्थिति (supine) को रोजगार, भले ही सिर स्थिति 0 पर ] trachea9में जल निकासी के पक्ष में हो सकता है. चूहों में दवाओं के वितरण में है कि जाग रहे हैं सुपाच्य स्थिति में किसी भी आवेदन की तुलना में कम मस्तिष्क बयान में परिणाम, ज्यादातर वैज्ञानिकों के लिए समय की लंबी अवधि के लिए वांछित स्थिति में चूहों पकड़ असमर्थता के कारण. इसके अलावा, जाग चूहों के लिए नियोजित त्वचा पकड़ विधि द्वारा आवश्यक ऊपर-नीचे स्थिति दवा जमाव में मुख्य रूप से trigeminal तंत्रिका और घ्राण बल्ब में परिणाम, साथ ही परिधीय अंगों, जैसे गुर्दे और फेफड़ों के रूप में, 30 मिनट के भीतर पश्चसंक् ति10| नैदानिक अध्ययन में इस तरह के nonhuman primates के रूप में बड़े जानवरों में घ्राण या trigeminal नसों के माध्यम से चिकित्सकीय के वितरण के लिए सबसे उपयुक्त शरीर की स्थिति सिर नीचे और आगे की स्थिति प्रतीत होता है (यानी, तथाकथित "मक्का के लिए प्रार्थना स्थिति")11| हालांकि, इस स्थिति को माउस मॉडल में अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है, और सुपाच्य स्थिति अधिक व्यापक रूप से कृंतक अध्ययन में प्रयोग किया जाता है।
पहले, हमने दिखाया है कि RVG9R, एक पेप्टाइड Rabis वायरस के न्यूनतम रिसेप्टर बाध्यकारी डोमेन के आधार पर डिजाइन, कोशिकाओं को tropism प्रदर्शित करता है न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज की तरह निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर subunits व्यक्त और मध्यस्थता एक तंत्र द्वारा सिएनआरए का इंट्रासेल्यूलर वितरण जिसमें ग्राही एकत्रीकरण12,13के स्थल पर ग्राही सगाई और अस्थायी प्लाज्मा झिल्ली विस्थानीकरण शामिल है . महत्वपूर्ण बात यह है कि आरवीजी9आर-सिराना परिसरों का प्रणालीगत अंतःशिरा प्रशासन सीएनएस14में siRNA के ट्रांसवास्कुलर वितरण को सक्षम बनाता है। हालांकि, प्रणालीगत मार्ग सीएनएस को दिया siRNA की मात्रा को पतला, और हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि RVG9R के प्रशासन में: siRNA परिसरों सिर में तैनात चूहों के लिए नीचे और आगे की स्थिति में व्यापक प्रसार लक्ष्य जीन knockdown प्रकाश में लाता है मस्तिष्क के कई क्षेत्रों15| महत्वपूर्ण बात यह है कि नॉकडाउन के इस स्तर के रूप में कम के रूप में 13.5 ग्राम siRNA के एक चार खुराक पर प्रशासित के साथ हासिल किया गया था, 2 दिन आहार जबकि चतुर्थ मार्ग तुलनीय दस्तक प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन प्रति एक $ 5 गुना अधिक खुराक की आवश्यकता है. IN दृष्टिकोण की ही कमी यह है कि यह एक कठिन प्रक्रिया है, समाधान के प्रशासन के दौरान दोनों हाथों के उपयोग की आवश्यकता होती है, जबकि लगातार सिर में वैकल्पिक रूप से चूहों पकड़ नीचे और आगे और आराम की स्थिति में के बीच एक काफी लंबे समय से उपचार अवधि के लिए प्रत्येक साँस लेना (एक 30-45 मिनट की प्रक्रिया माउस प्रति एक $ 20-30 $L मात्रा के प्रभावी तेज के लिए). यहाँ प्रस्तुत माउस स्थिति डिवाइस का उपयोग जानवरों और प्रोटोकॉल प्रदर्शन कर्मियों के लिए थोड़ा शारीरिक दबाव के साथ चूहों की उचित नियुक्ति सक्षम बनाता है, साथ ही समय की एक उचित अवधि के भीतर चूहों के कई सहगण के उपचार, रोग 15 के अंतिम चरणों में चूहों में पश्चिम नील मस्तिष्क ज्वर के लिएएक चिकित्सीय के रूप में siRNAs का उपयोग करने पर एक गहन अध्ययन सक्षम करने के लिए 15 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1107px;" width="1107">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:1107px;">Comercial assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">iScript cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:173px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">Cat# 1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">RNAiso plus</td>
			<td style="width:173px;">TaKaRa Bio</td>
			<td style="width:143px;">Cat# 9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">SYBR Premix ExTaq</td>
			<td style="width:173px;">TaKaRa Bio</td>
			<td style="width:143px;">Cat# RR420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Alexa fluor 488</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:143px;">Cat# A30052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Balb/c</td>
			<td style="width:173px;">Orient Bio</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>6-8 week old, 20-30g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oligonucleotides and primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Human CD4</td>
			<td style="width:173px;">ST Pharm</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>Sense: 5&#8217;-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">siSOD1</td>
			<td style="width:173px;">ST Pharm</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>Sense: 5&#8217;-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">GAPDH primers</td>
			<td style="width:173px;">ST Pharm</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>F: 5&#8217;-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3&#8217; R: 5&#8217;-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">SOD1 primers</td>
			<td style="width:173px;">ST Pharm</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>F: 5&#8217;-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3&#8217; R: 5&#8217;-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:1107px;">Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">RVG9R</td>
			<td style="width:173px;">Peptron</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR 
			GKRASNGGGGRRRRRRRRR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">RVM9R</td>
			<td style="width:173px;">Peptron</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS 
			PASAPLDGGGGRRRRRRRRR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software, algorithms and devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">FlowJo software 4.3</td>
			<td style="width:173px;">FlowJO, LLC</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td>http://docs.flowjo.com/vx/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Mouse positioning device</td>
			<td style="width:173px;">Signet Biotech</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:287px;">Prism software</td>
			<td style="width:173px;">Graphpad</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:504px;">https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:287px;">Prism software</td>
			<td style="width:173px;">Graphpad</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:504px;">https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a positioning device for the placement of mice during intranasal sirna delivery to the central nervous system

मस्तिष्क में दवा की डिलीवरी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में दवाओं की डिलीवरी के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबी) को बायपास करने के लिए एक आशाजनक विधि के रूप में उभरा है। हाल के अध्ययनों से एक पेप्टाइड के उपयोग का प्रदर्शन, RVG9R, रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन के न्यूनतम रिसेप्टर बाध्यकारी डोमेन को शामिल, मस्तिष्क में न्यूरॉन्स में siRNA की डिलीवरी प्राप्त करने में. इस प्रोटोकॉल में, पेप्टाइड-सिरना निर्माण प्रमुख हाथ में एक पिपेट के साथ intranasally दिया जाता है, जबकि एनेस्थेटाइज्ड माउस को फेफड़ों में जल निकासी से बचने के लिए "सिर नीचे और आगे की स्थिति" में गैर प्रमुख हाथ के साथ स्क्रफ द्वारा रोका जाता है और साँस लेना पर पेट. चूहों की यह सटीक मनोरंजक सीखा जा सकता है, लेकिन आसान नहीं है और प्रभावी सीएनएस तेज में परिणाम के लिए अभ्यास और कौशल की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रक्रिया लंबे समय से तैयार की है, के बारे में की आवश्यकता होती है के बारे में 45 मिनट की कुल मात्रा के प्रशासन के लिए $20-30 $L समाधान की 1-2 $L बूंद मात्रा प्रति साँस लेना में, प्रत्येक साँस लेना के बीच 3-4 मिनट आराम अवधि के साथ. इस अध्ययन का उद्देश्य एक माउस स्थिति उपकरण है कि पेप्टाइड-siRNA तैयार करने के कुशल में प्रशासन के लिए चूहों के उपयुक्त स्थान सक्षम बनाता है खुलासा करने के लिए है. एकाधिक सुविधाओं को डिवाइस के डिजाइन में शामिल किया जाता है, जैसे कि समायोज्य ऊंचाई के साथ चार या आठ पोजीशनिंग कुर्सियां और सिर में एनेस्थेटाइज्ड चूहों को नियंत्रित करने के लिए झुकाव नीचे और आगे की स्थिति, चूहों के nares के आसान दृश्य को सक्षम करने और एक प्रक्रिया के दौरान चूहों के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए निर्मित हीटिंग पैड। महत्वपूर्ण बात, इस तरह से RVG9R-siRNA परिसरों के साथ एक साथ चार या आठ चूहों का इलाज करने की क्षमता एक बहुत जल्दी समय पैमाने पर अध्ययन सक्षम बनाता है, एक चिकित्सात्मक siRNA दृष्टिकोण के परीक्षण के लिए. अंत में, इस उपकरण के लिए उपयुक्त और नियंत्रित माउस सिर स्थिति RVG9R-siRNA और अन्य चिकित्सीय अणुओं, जैसे नैनोकणों या एंटीबॉडी के रूप में आवेदन के लिए अनुमति देता है, सीएनएस वितरण के लिए.

IN प्रशासन के दौरान सिर की स्थिति मस्तिष्क को दवा वितरण की दक्षता पर एक प्रमुख प्रभाव है. यहाँ हम माउस के सीएनएस के लिए मिश्रण की डिलीवरी के लिए एक मस्तिष्क-लक्ष्यपेचित पेप्टाइड-siRNA तैयार करने के लिए एक माउस पोजीशनिंग डिवाइस के लिए एक माउस पोजीशनिंग डिवाइस का उपयोग कर सिर नीचे और आगे की स्थिति का वर्णन किया. IN मार्ग के माध्यम से वितरण सत्यापित करने के लिए, हम RVG9R पेप्टाइड का इस्तेमाल किया, पहले कुशलता से दोनों इन विट्रो में और विवो में न्यूरॉन कोशिकाओं के लिए बाध्य करने के लिए दिखाया14,16.
हम पहले यहाँ वर्णित माउस स्थिति डिवाइस का उपयोग करके एलेक्सा फ्लोर 488 (RVG9R-A488)के साथ लेबल RVG9R पेप्टाइड की नाक से मस्तिष्क वितरण का परीक्षण किया. 48 एच postinoculation में, मस्तिष्क सहित विभिन्न अंगों, साइनस, फेफड़े, जिगर, तिल्ली, और गुर्दे ऊतक को मापने के लिए excised थे संबद्ध एक488 फ्लोरोसेंट. एक488 अकेले, या एक नियंत्रण पेप्टाइड (RVM9R-A488)14 जो nAchR बाइंड नहीं करता है, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया. जैसा कि अपेक्षित था, न तो 48 एच postinoculation पर किसी भी अंग में एक488 और न ही RVM9R-A488 पाया गया (चित्र 3A, बाएँ). दूसरी ओर, एक मजबूत फ्लोरोसेंट एक488 संकेत RVG9R-inoculated समूह के दिमाग में विशेष रूप से पता चला था. इसके अलावा, हम पहले इस्तेमाल किया गया है कि supine स्थिति विधि के लिए इस माउस प्लेसमेंट स्थिति की तुलनामें 17, साथ ही जाग विधि के लिए, प्रभावकारिता के लिए. हम RVG9R-A488 (100 डिग्री) की एक निश्चित राशि inoculated और 48 एच postinoculation पर परख जैव वितरण. परिणामों से संकेत मिलता है कि चूहों के सिर नीचे स्थिति और आगे मस्तिष्क के ऊतकों में RVG9R-A488 के penetrance और जमा सुधार (चित्र 3A, सही). इसके विपरीत, एक सुपाच्य स्थिति में inoculated जानवरों RVG9R-A488 मस्तिष्क को वितरण के परिणामस्वरूप, लेकिन स्थिति डिवाइस विधि के साथ के रूप में देखा के रूप में मजबूत नहीं. आगे मस्तिष्क को siRNA प्रसव की पुष्टि करने के लिए, हम RVG9R के एक भी प्रशासन में Cy5 लेबल siRNA के 400 pmol (5.2 ग्राम) के लिए जटिल के बाद पूर्ण मस्तिष्क स्कैनिंग प्रदर्शन किया. पीबीएस या RVM9R के विपरीत, RVG9R के साथ जटिल घ्राण बल्ब सहित प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्रों में siRNA की एक मजबूत संचय में हुई, प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस, thalamus, hypothalamus, midbrain, और सेरिबैलम (चित्र 3B) ).
अंत में, हमने सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटस-1 (SOD1) जीन को लक्षित करने वाले कार्यात्मक siRNA के इंट्रासेल्यूलर डिलीवरी को सत्यापित करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण का उपयोग किया। चूहे RVG9R के साथ लगातार दिनों पर 3 बार intranasally inoculated थे:siSOD1 (13.2 siRNA के ग्राम), और SOD1 MRNA अभिव्यक्ति पिछले टीका के बाद 24 एच विश्लेषण किया गया था. RVG9R:siSOD1 प्रशासन घ्राण बल्ब में SOD1 अभिव्यक्ति की काफी कमी के परिणामस्वरूप (63%), प्रांतस्था (47%), हिप्पोकैम्पस (61%), thalamus (53%), hypothalamus (55%), midbrain (39%), और सेरिबेलम (30%) (चित्र4) . अंत में, एक स्थिति उपकरण का उपयोग चूहों में RVG9R जटिल siRNA के टीका में एक आसान सक्षम बनाता है, मस्तिष्क विशिष्ट siRNA वितरण लक्ष्य जीन के कार्यात्मक silencing प्रेरित में जिसके परिणामस्वरूप.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig1.jpg"> चित्र 1 : डिवाइस विधानसभा की फोटोग्राफिक प्रस्तुति। स्थिति कुर्सियों शिकंजा के साथ उचित ऊंचाई पर स्टैंड पर इकट्ठे होते हैं। विधानसभा के बाद, डिवाइस टीका के दौरान शारीरिक तापमान को हीटिंग के लिए एक बिजली की आपूर्ति से जुड़ा है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig2.jpg"> चित्र 2 : स्थिति डिवाइस का उपयोग कर IN टीका प्रक्रिया की फोटोग्राफिक प्रस्तुति। (क) इन टीका के लिए आवश्यक प्रायोगिक उपकरण। (ख) सिर में नीचे और आगे की स्थिति में पशु डिवाइस पर बैठे (बाएं) और in inoculation (दाएं) के लिए एक 2 $L छोटी बूंद के जमाव. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig3.jpg"> चित्र 3 : प्रशासन में के बाद फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड और siRNA का वितरण. (क) एक ही टीका के बाद 48 एच पर intranasally inoculated RVG9R पेप्टाइड का जैव वितरण. मस्तिष्क और अन्य परिधीय अंगों को चूहों में फ्लोरोसेंट की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया जिसमें नमकीन (पीबीएस), ए488, आरवीएम-ए488और आरवीजी-ए488 (बाएं) शामिल थे। चूहों की इमेजिंग ऊपर उल्लिखित के रूप में इलाज किया, जबकि वे जाग रहे हैं, सुपाच्य स्थिति में, और माउस की स्थिति में सिर में वसीयत नीचे और आगे की स्थिति (दाएं). (बी) RVG9R:siRNA मस्तिष्क में जटिल का जैव वितरण (n $ 3 प्रति समूह). Cy5 लेबल siRNA का वितरण लवण (पीबीएस), siRNA नियंत्रण पेप्टाइड (RVM9R-siCy5) के साथ जटिल जानवरों में एक confocal लेजर लेजर के साथ पूर्ण मस्तिष्क cryosections में कल्पना की गई थी, या मस्तिष्क-लक्ष्य पेप्टाइड RVG9R (RVG9R-siCy5). स्केल बार 1 मिमी संक्षिप्तीकरण का प्रतिनिधित्व करता है: o.b ] घ्राण बल्ब; ctx [ कॉर्टेक्स; हिप्पोज़ हिप्पोकैम्पस; हाइपोथैलेमस; था ] thalamus; m.b ] मध्यमस्तिष्क; सेर ] सेरिबैलम. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig4.jpg"> चित्र 4 : RVG9R के आवेदन में:siSOD1 मस्तिष्क के कई क्षेत्रों में लक्ष्य जीन silencing लाती है. संकेत मस्तिष्क क्षेत्रों में murine SOD1 MRNA के लिए QPCR विश्लेषण 24 एच नमकीन (पीबीएस), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RV9R), और RVG9R:siSOD1 (RVG9R) के टीका में पिछले के बाद। रिश्तेदार SOD1 घ्राण बल्ब में silencing, प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस (ऊपरी), thalamus, hypothalamus, सेरिबैलम (मध्य), और midbrain (कम) दिखाया गया है. डेटा लवण-उपचारित चूहों के संगत डेटा(द र् 3 प्रति समूह) के साथ सामान्यीकृत होने के बाद जीएपीडीएच के सापेक्ष मध्य - एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। IN संरोपण (कम दाएँ) दिखाए जाने के बाद इंगित मस्तिष्क क्षेत्र में SOD1 MRNA के प्रतिशत को दर्शाने वाला कार्टून। * *पी एंड एलटी; 0.01, ** * पी एंड एलटी; 0.001। संक्षिप्त नाम: o.b ] घ्राण बल्ब; ctx [ कॉर्टेक्स; हिप्पोज़ हिप्पोकैम्पस; हाइपो - हिप्पोकैम्पस; था ] thalamus; m.b ] मध्यमस्तिष्क; सेर ] सेरिबैलम. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System at JoVE.com

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

यहाँ, हम एक माउस स्थिति डिवाइस है कि एक मस्तिष्क-लक्ष्यपेति पेप्टाइड-siRNA निर्माण के intranasal प्रशासन के लिए चूहों के उपयुक्त स्थान सक्षम बनाता है का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रभावी जीन silencing सक्षम.

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को Intranasal siRNA वितरण के दौरान चूहे की नियुक्ति के लिए एक पोजिशनिंग डिवाइस

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

यह प्रोटोकॉल माउस सीएनएस को बायोमॉलिक्यूल्स के इंट्रानैसल डिलीवरी के लिए एक पोजिशनिंग डिवाइस के उपयोग का विवरण देता है। इस डिवाइस का उपयोग चूहों की हैंडलिंग और उपचार के समय को काफी कम कर देता है जिसके परिणामस्वरूप तकनीक की क्षमता और प्रजनन क्षमता में सुधार होता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, सर्जिकल विमान को बनाए रखने के लिए पेडल पलटा द्वारा चूहों के संज्ञाहरण स्तर का आकलन करें।इसके बाद, सभी आवश्यक अभिकर् ती लोगों तक सुविधाजनक पहुंच की अनुमति देने के लिए स्थिति डिवाइस को उचित दूरी और ऊंचाई पर रखें। इसके बाद जानवर की आंखों पर मरहम लगाएं। कुर्सी बेल्ट के साथ एक माउस का पट्टा, सुनिश्चित करें कि माउस के अग्रअंग प्राकृतिक समर्थन प्रदान करते हैं, जबकि यह किसी भी असुविधा के बिना एक आराम की स्थिति में है ।शेष चूहों के लिए प्रक्रियाओं को दोहराएं। धीरे-धीरे कुर्सी के पीठ समर्थन के समानांतर और कुर्सी की सीट के लिए 90 डिग्री पर अपनी पीठ बिछाने के द्वारा निर्धारित कुर्सी पर प्रत्येक माउस रखें। जानवर को धक्का या दबाने के बिना सिर के नीचे और आगे की स्थिति में स्वाभाविक रूप से झूठ बोलने दें।एक बार जब सभी चूहों की कमी हो जाती है, तो तुरंत इंट्रानासल टीका शुरू करें। इंट्रानासल डिलीवरी करने के लिए, माइक्रोपिपेट को आरवीजी9आर सिरना कॉम्प्लेक्स सॉल्यूशन के दो माइक्रोलीटर के साथ लोड करें। प्रमुख हाथ में पिपेट पकड़ो और सिराना प्रशासन करते समय अनियंत्रित आंदोलनों से बचने के लिए दूसरे हाथ से इसका समर्थन करें।एक दो माइक्रोलिटर बूंद के बारे में एक नथुने के बहुत करीब रखें ताकि माउस सीधे इसे श्वास ले सके। यदि एक छोटी बूंद आसानी से नहीं बनती है, तो पिपेट टिप को एक नए से बदलें और ऑपरेशन दोहराएं। धीरे से माउस सिर पांच सेकंड के लिए सूचकांक उंगली के साथ नीचे धक्का जबकि यह साँस लेना है और स्थिति को बनाए रखने ।फेफड़ों में दवा की जल निकासी को रोकने के लिए माउस को पांच सेकंड के लिए इंडेक्स फिंगर के साथ नीचे धकेलना महत्वपूर्ण है जबकि माउस साँस लेना है। पहले माउस के दूसरे नारे में टीका लगाने के लिए इस के बाद तीन से चार मिनट घड़ी के लिए एक स्टॉपवॉच शुरू करें। माउस के लिए पहली खुराक की साँस लेने को पूरा करने और सामान्य श्वास बहाल करने के लिए यह समय अंतराल आवश्यक है।पहले माउस पर वैकल्पिक नार्स के टीका के बीच तीन से चार मिनट के अंतराल में, डिवाइस पर रखे शेष तीन चूहों में से प्रत्येक में एक नारे का पूर्ण इंट्रानासल टीका। जब स्टॉपवॉच लगता है, तो पहले माउस पर दूसरे नथुने को टीका लगाएं और ऊपर के रूप में अन्य चूहों के लिए प्रक्रिया दोहराएं। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी चार चूहों के लिए 20 से 30 माइक्रोलीटर वितरित न हो जाए।पूरी टीका प्रक्रिया को पूरा करने में करीब 30 से 45 मिनट का समय लगेगा। जानवरों को उनके निर्धारित पिंजरों में वापस लौटें। चूहों को तब तक उपेक्षित न छोड़ें जब तक कि वे स्टर्नल रेक्यूबेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न करें।जीन मुंह का आकलन करने के लिए, आरएनए शुद्धिकरण किट के साथ विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से आरएनए निकालें, सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और प्राइमर जोड़े के साथ क्यूपीसीआर करें। एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ लेबल किए गए आरवीजी9आर पेप्टाइड की अधिकांश मस्तिष्क डिलीवरी का परीक्षण सबसे पहले यहां वर्णित माउस पोजिशनिंग डिवाइस का उपयोग करके किया गया था। टीका लगाने के बाद 48 घंटे में, A488 फ्लोरेसेंस को मापने के लिए विभिन्न अंगों को उत्पादित किया गया था।नकारात्मक नियंत्रणों में किसी भी अंग में कुछ भी पता नहीं चला। दूसरी ओर, आरवीजी9आर टीका समूह के दिमाग में विशेष रूप से एक मजबूत फ्लोरोसेंट A488 सिग्नल का पता चला। इसके अलावा, माउस प्लेसमेंट स्थिति की तुलना रीपाइन स्थिति विधि और प्रभावकारिता के लिए जागने की विधि से की गई थी।परिणामों से संकेत मिलता है कि चूहों के सिर को नीचे और आगे की स्थिति में मस्तिष्क के ऊतकों में RVG9R A488 के पेनेट्रेनेस और जमाव में सुधार हुआ । मस्तिष्क को सिरना वितरण की पुष्टि करने के लिए, पूर्ण मस्तिष्क स्कैनिंग RVG9R के एक इंट्रानासल प्रशासन के बाद किया गया था Cy5 लेबल siRNA के लिए जटिल । पीबीएस या आरवीएम9आर के विपरीत, आरवीजी9आर के साथ जटिल होने के परिणामस्वरूप घ्राण बल्ब, कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस, थैलेसीमिया, हाइपोथैलेमस, मध्य मस्तिष्क और सेरिबैलम सहित प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्रों में सिर्ना का एक मजबूत संचय हुआ।पोजिशनिंग डिवाइस का उपयोग माउस सीएनएस में दवाओं या अणुओं के वितरण के लिए किया जा सकता है। अनुप्रयोगों चिकित्सा के परीक्षण के साथ ही सीएनएस में सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए विस्तार । इस पोजिशनिंग डिवाइस का उपयोग जांचकर्ताओं द्वारा पश्चिम नील वायरस रोग के इलाज में एसआईआरएन की शक्ति का प्रदर्शन करने के साथ-साथ अन्य सीएनएस रोगों के लिए उपचारों की खोज के लिए किया गया है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

प्रायोगिक Autoimmune Hypophysitis के SJL चूहे में प्रेरण

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Bioluminescent इमेजिंग बीच योगवाहिता जांच स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया इन्फ्लुएंजा और शिशु चूहे में एक वायरस

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

सेल प्रकार विशिष्ट siRNA वितरण के लिए विरोधी एचआईवी gp120 aptamers का विकास

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के साथ इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण के दौरान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का लक्षण वर्णन

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

नवजात और वयस्क केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र से संवर्धन Microglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Mesenteric लिम्फ वाहिनी cannulated चूहे मॉडल: आंतों लिम्फेटिक दवा परिवहन के आकलन के लिए आवेदन

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

लागू करने प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) द्वारा प्रेरक translocation क्षमता की जांच करने के लिए<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA मुंह बंद के दौरान

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

एक हेपेटाइटिस बी वायरस संवाददाता प्रणाली का विकास प्रतिकृति चक्र के प्रारंभिक दौर नजर रखने के लिए

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमैट्री द्वारा सेंट्रल नर्वस सिस्टम से माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का विश्लेषण

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

एक उपंयास फीडर इन विट्रो में Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...