Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

كان يؤيد هذا البحث من المنح المقدمة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات من كوريا (2017M3A9B4061406) والوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) التي تمولها الحكومة الكورية (مست) (منحة الأرقام 2017M3A9B4061404 و 2018M3A9H3020844) إلى جونججون ك. لي. بلازميد ترميز pGRG36 كان هدية من نانسي كريغ (بلازميد أدجيني #16666) وكان p11-أسي wtx1 هدية من تشاو هويمين.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

تولجين قدم طلب براءة (PCT/KR2017/006212) الذي يغطي الشاشة قناص (مركز: المخترع معلقة،: لي ك. جونججون). جونججون ك. لي وجونسون لي جونغ من جيونج يويهوان هم موظفون في شركة تولجين

تتوفر لأولئك الذين يرغبون في تجنب إجراءات الفرز مرهقة للحصول على Cas9 قناص، البروتين Cas9 قناص وبلازميد الترميز. باستخدام هذه المواد، وطول سجرنا، التي توفر أعلى نسبة خصوصية، ينبغي تحديد أمثل. وباﻹضافة إلى ذلك، يوصي بتسليم القناص-Cas9 وسجرنا في شكل رنب نظراً لأنه عادة ما يؤدي إلى خصوصية أعلى نسبة من التسليم في شكل بلازميد. خلافا للقناص-Cas9، متغيرات Cas9 هندسية أخرى غير متوافقة مع6،سجرناس مبتوراً7 أو التسليم في رنب الاستمارة رقم8 (باستثناء هيفي-Cas9).
لقناص-الشاشة، يتم اختيار التسلسل غير متطابقة أهم خطوة. وينبغي تجنب اختيار سجرنا غير متطابق الذي يقترن بالانقسام وانخفاض النشاط نحو تسلسل غوي . إذا لم يكن الأمر كذلك، سوف لا تنشق المتغيرات Cas9 بمستوى WT خصوصية كولاي المجينية الحمض النووي مع الموقع الهدف غير متطابقة. هذا التأثير سيؤدي إلى عدد كبير من المستعمرات الخلفية، تعرض للخطر كل الفحص الداخلي.
سبب كولاي بسرعة مضاعفة الوقت وكفاءة تحويل عالية مقارنة بالخميرة، قناص-الشاشة هو فائدة مقارنة بأساليب الفرز على أساس الخميرة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون القناص-الشاشة أكثر حساسية من غيرها كولاي-استناداً إلى النظم التي تتم في الموقع غير متطابقة بلازميد: هناك نسخة واحدة من الحمض النووي الجينومي وواحد فقط وبالتالي نسخة من الموقع غير متطابقة في نظامنا، ولكن عددا كبيرا من والبلازميدات داخل وحيدة الخلية كولاي .
ويمكن أيضا تحسين خصائص أخرى اندونوكليسيس الحمض النووي التي تحفز دسبس، مثل SaCas9 أو Cpf1s، أو باستخدام شاشة قناص. ولسوء الحظ، لا يمكن استخدام شاشة قناص زيادة خصوصية المحررين قاعدة مباشرة، نظراً لعدم حمل المحررين قاعدة دسبس في الحمض النووي الجينومي كولاي. كما استخدم المحررين قاعدة نيكس أو إصدار الميت من Cas9 في جوهر النظام الخاص بهم، يمكن زيادة الخصائص المميزة للمحررين قاعدة باستخدام عدد الزيارات التي تم الحصول عليها من قناص-الشاشة.

في هذه الورقة، ونحن نهدف إلى تحسين خصوصية Cas9 عن طريق الجمع بين استراتيجيات مختلفة. وقد وضعت أساليب مختلفة لتجنب آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9. على سبيل المثال، يمكن استخدام سجرناس مبتوراً لتحقيق أعلى خصوصية1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تغيير طريقة تسليم Cas9 من شكل بلازميد إلى تنسيق رنب للحصول على أعلى خصوصية2. بقايا محددة من الأحماض الأمينية Cas9 العقدية المقيّحة البروتين (SpCas9) قد تم تعديلها وفقا للرشيد تصميم الموصوفة سابقا3،،من45. بدلاً من ذلك، مخلفات الأحماض الأمينية قد تم تعديلها بطريقة عشوائية، وتم تحديد المتغيرات Cas9 مع خصوصية أعلى باستخدام خميرة6 أو7، كولاي8 فحص النظام.
ومع ذلك، أفادت العديد من المجموعات أن المتغيرات Cas9 هندسيا باستخدام التصميم لإضعاف التفاعل غير محدد بين Cas9 والركيزة معرض منخفضة في توجيه الأنشطة7،،من89، 10 , 11 , 12-قمنا بتطوير كولاي-استناداً إلى نظام التطور الموجه، قناص-الشاشة الشاشة عشوائياً موتاجينيزيد Cas9 المتغيرات. كولاي فحص النظام مزايا أكثر من نظام خميرة بسبب كفاءات التحول وقتاً وأعلى سرعة مضاعفة كولاي.
التحديد السلبية والإيجابية على حد سواء، استناداً إلى ثلاثة والبلازميدات مختلفة وجينات للفائدة (غوي) دمج الجينوم كولاي ، تستخدم في شاشة قناص. يتم التعبير عن المتغيرات Cas9 تحت النظام المزدوج-مروج CMV-PltetO1 بلازميد رقم نسخة منخفضة حيث أنه يمكن أن يكون اختبار المرشحين التي تم تحديدها في كولاي في خلايا الثدييات دون الحاجة إلى سوبكلونينغ. هو عرض حكومة الهند في مجال المجين كولاي باستخدام نظام ينقول Tn7. بلازميد سجرنا، الذي يحتوي على مصدر حساسة للحرارة للنسخ المتماثل، وتعرب عن سجرنا الاستهداف غوي؛ ومع ذلك، سجرنا وتسلسل غوي عدم مطابقة تماما. يوجد موقع هدف سجرنا مطابقة تماما في بلازميد ثالثة التي تحتوي على الجين ككدب ، الذي يقوم بترميز منتجات مميتة التي السموم جيرسي. في هذا النظام، تتم إزالة الخلايا معربا عن المتغيرات Cas9 مع أنشطة خارج الهدف السامي لفواصل مزدوجة-ستراند (دسبس) تدخل في الموقع غير مطابقة الموجود في الحمض النووي الجينوم. من ناحية أخرى، يتم أيضا إزالة الخلايا معربا عن المتغيرات Cas9 مع انخفاض في توجيه الأنشطة بسبب الجينات القاتلة ككدب . يمكن تغيير مستوى التعبير من المتغيرات Cas9 بتغيير تركيز أنهيدروتيتراسيكليني (ATC)، الذي يضبط قوة الاختيار.
نحن مسبب أن تحديد موقع الهدف سجرنا غير متطابقة في الحمض النووي الجينومي بدلاً من بلازميد سيزيد من حساسية النظام. وميزة هذا النهج أن هناك موقع جينومي واحد فقط، في حين سيكون هناك العديد من البلازميدات، كل منها يحتوي على موقع هدف، ضمن واحدة خلية كولاي .
باستخدام هذا النظام، وقد حددنا متغير Cas9، قناص-Cas9، الذي يبين مستوى وزن في توجيه الأنشطة وتخفيض الأنشطة خارج الهدف مقارنة بوزن Cas9. قناص--Cas9 تحقيق أعلى نسب خصوصية باستخدام سجرناس مبتوراً أو التسليم على أساس رنب بدلاً من التسليم على أساس بلازميد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

تطوير مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)-البروتينات المرتبطة بها 9 (Cas9) إلى الطرائق العلاجية يتطلب تجنب إثارة خارج الهدف يحتمل أن تكون ضارة. وتم استحداث عدة طرق للحد من هذه الآثار. نقدم هنا، الإشريكيّة القولونية-التطور الموجه استناداً إلى أسلوب يسمى قناص-الشاشة للحصول على متغير Cas9 مع خصوصية الأمثل والاحتفاظ بالنشاط على الهدف، دعا قناص-Cas9. استخدام شاشة قناص، التحديد الإيجابية والسلبية يمكن أن يؤديها في وقت واحد. كما يمكن أن يتكرر الشاشة مع غيرها تسلسل الحمض النووي الريبي (سجرنا) واحد-دليل لإثراء ليضرب إيجابية حقيقية. باستخدام المروج المزدوج CMV-PltetO1 للتعبير عن المتغيرات Cas9، يمكن التحقق أداء المكتبة مجمعة بسرعة في خلايا الثدييات. ويرد أيضا أساليب لزيادة خصوصية قناص-Cas9. أولاً، استخدام سجرناس مبتوراً سابقا قد ثبت لزيادة خصوصية Cas9. خلافا لغيرها Cas9s هندسيا، يحتفظ Cas9 قناص البرية من نوع (WT) مستوى النشاط على الهدف عندما جنبا إلى جنب مع سجرناس مبتورة. ثانيا، إيصال قناص Cas9 في شكل ريبونوكليوبروتين (رنب) بدلاً من تنسيق بلازميد ممكن دون التأثير على نشاطها على الهدف.

بعد أن يتم تنفيذ قناص-الشاشة، يمكن حساب النسبة المئوية لبقاء المستعمرات بقسمة العدد المستعمرات على لوحة رطل المحتوية على الكلورامفينيكول، كاناميسين، أرابينوز، و "المنسوجات والملابس" (ككا) بالعدد المستعمرات في احتواء اللوحة رطل الكلورامفينيكول وكاناميسين فقط (كورونا). وكان هذه النسبة المئوية عادة ما تكون منخفضة جداً عندما أنجز قناص-الشاشة مع مكتبات SpCas9. يمكن إثراء يضرب إيجابية حقيقية بتكرار الشاشة مع تجمع الباقين على قيد الحياة. في هذا الممثل القناص الشاشة، على سبيل المثال، حصلت نسبة 100 ٪ البقاء على قيد الحياة بعد الشاشة الثالثة (الشكل 1). يمكن أن يتم استخدام رنبس أو ترميز بلازميد قناص-Cas9 ترانسفيكشنز لأهداف مختلفة والناتجة عن الهدف، واستهدفت الأنشطة خارج الهدف تقاس amplicon التسلسل (الشكل 2). في معظم الأهداف، قناص-Cas9 يظهر على نفس المستوى من الأنشطة على الهدف ويمكن أيضا استخدام أعلى نسب خصوصية سجرناس يقطع بالوزن بالمقارنة مع زيادة تحسين النوعية (الشكل 3). ولكن استخدامها يقتصر على سوى بضعة أهداف لأنها تؤدي إلى انخفاض الأنشطة على الهدف مقارنة بطول كامل سجرناس، في معظم الحالات. ولذلك، يجب اختبار سجرناس مع أطوال مختلفة (من 17-إلى 20-أسعار الصرف السوقية) ويجب أن يقاس على الهدف وخارج الهدف أنشطة لتحسين النوعية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> رقم 1: يؤديها الممثل قناص-شاشات مع مكتبات مختلفة من المتغيرات Cas9 عشوائية. مكتبة mutator, مكتبة الجيش الشعبي الأول، ومكتبة البرلمان الأوروبي الثاني تشير إلى المكتبات باستخدام مجموعات تجارية مختلفة. الأول والثاني والنهائي الإشارة إلى عدد المرات التي تم إثراء الشاشة أداء7. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> رقم 2: في الهدف وخارج الهدف يقترن أنشطة WT Cas9 أو Cas9 قناص تسلسل دليل 20-مير عبر بلازميد أو رنب. تم تحديد نسب خصوصية بتقسيم النشاط على الهدف من النشاط خارج الهدف. أشرطة الخطأ تشير إلى وزارة شؤون المرأة (n = 3)7. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> رقم 3: في الهدف وأنشطة قناص-Cas9 WT-Cas9 التي تم الحصول عليها باستخدام سجرناس ذات الطول المتغير استهداف المواقع FANCF01 وآفس بالمقارنة مع الهدف. وحددت نسب خصوصية بتقسيم الترددات إينديل في مواقع على هدف تلك في مواقع خارج الهدف منها. يتم الإشارة إلى سجرناس مع جوانين متطابقة في 5 ' المحطة (GX18 أو GX19) وتلك مع جوانين غير متطابقة (gX17 أو gX18 أو gX19 أو gX20). وحسبت نسب خصوصية لا عندما كانت الأنشطة المستهدفة في تطبيع < 70%7. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين كريسبر-Cas9 لتحقيق خصوصية أعلى دون فقدان النشاط على الهدف. نحن استخدام نهج تطور موجه تسمى قناص-الشاشة لتجد متحولة Cas9 مع الخصائص المرغوبة. قناص--Cas9 متوافق مع مبتوراً واحد-دليل الكشف والتسليم في شكل ريبونوكليوبروتين، الاستراتيجيات المعروفة لتحقيق خصائص أعلى.

استخدام القناصة-Cas9 إلى أدنى حد من آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف عن طريق التطور الموجه

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

في الطبيعة ، Cas9 هو بروتين مناعي ضد الفيروسات الغازية التي تفضل تطور Cas9 مع خصوصية منحرفة التي يمكن أن تتشابك الحمض النووي الفيروسي مع الطفرات العفوية. لقد بنينا نظام تطور موجه اصطناعي يفضل متغير Cas9 الأمثل مع خصوصية عالية. تعمل كل من الاختيارات السلبية والإيجابية في وقت واحد في نظام فحص القناصة.يمكن فحص المتغيرات Cas9 مع انخفاض النشاط خارج الهدف أيضًا الحفاظ على النشاط على الهدف في وقت واحد. تم إدخال الطفرات على تسلسل Cas9 بأكمله بشكل عشوائي لإنتاج المكتبة ليتم فحصها. وهذا جعل من الممكن العثور على الطفرات في مواقف غير متوقعة.حاليا، العديد من الباحثين في الأوساط الأكاديمية والصناعة يستخدمون Y-نوع Cas9 للتطورات العلاجية. ومع ذلك، لا يتم تحسين خصوصية Y-type Cas9، مما قد يؤدي إلى إيقاف معبأة بإحكام. في البشر ، وهذا يعني طفرات غير متوقعة في الجينات العشوائية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى آثار جانبية خطيرة.هناك العديد من Cas9 مثل الإنزيمات التي يجري تطويرها في العلاجات. ويمكن استخدام أسلوبنا لتحسين خصوصية الحمض النووي والنويات الأخرى مثل جيبينغر، تايلاند، وكاس 9 أيضا مثل CPF1. جعل مكتبة كبيرة بما فيه الكفاية هو المفتاح لزيادة إمكانيات الحصول على متغير مع وظيفة هامة.تأكد من الحصول على كفاءة عالية في خطوة التبريد، واستخدام خلايا ذات كفاءة عالية المختصة. لبدء هذا الإجراء، إضافة نانوغرام واحد من كل من بلازميد CCDB وSGRNA plasmid مع عدم التطابق المزدوج إلى خمسين ميكرولترات من الخلايا الملوثة BW25141 GOI. خلط الخلايا بلطف عن طريق الأنابيب، ونقلها إلى ما قبل مبردة، 0.1 سنتيمتر الكهربائية cuvette.تحويل الإشريكية القولونية مع اثنين من plasmids عن طريق الكهرباء. مباشرة بعد الانتهاء من electroporation، إضافة 250 ميكرولترات من وسط SOC. الماصات بلطف الحل لخلط الخلايا والمتوسطة، ونقل الخليط إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.استعادة الخلايا المحولة واحتضانها في 32 درجة مئوية، مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة. متابعة إعداد خلايا فحص Snyper كما هو موضح في بروتوكول النص. عندما تكون على استعداد لأداء فحص سنايدر، وتحويل خلايا الفحص سنايدر مع 100 نانوغرام من البلازميدات Cas9 البديلة المعدة من كل مكتبة باستخدام عملية إلكتروسوريشن التي وصفت سابقا.ثم, نقل 250 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge الطازجة. أضف 250 بيكوغرام من ATC إلى تركيز نهائي من 10 نانوغرام لكل ملليلتر. استرداد كل من الخلايا التي تحتوي على ATC وخالية من ATC عن طريق احتضانها في 32 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز لطيف.لوحة 25 ميكرولترات من الخلايا الخالية من ATC تعافى على لوحة LB أجار, تحتوي على الكلورامفينيكول وkanamycin. أضف ATC إلى ATC المستردة التي تحتوي على الخلايا إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر على 245 ملليمتر LB agar لوحة. على الفور لوحة الخلايا التي تحتوي على ATC على agar LB تحتوي على لوحة تحتوي على الكلورامفينيكول، كاناميسين، وعربينوز.احتضان جميع لوحات بين عشية وضحاها في 32 درجة مئوية. في اليوم التالي، صور اللوحات. باستخدام برنامج CFU المفتوح ، عد عدد المستعمرات القابلة للحياة ، والتأكد من أن عدد المستعمرات على الصفيحة غير الانتقائية أكبر بعشر مرات على الأقل من تنوع المكتبة ، لتغطية جميع المتغيرات.سحب المستعمرات التي نجت على لوحات انتقائية من جميع المكتبات الثلاث. نقل هذه المستعمرات المجمعة إلى 250 ملليلتر من متوسطة LB، تكملها الكلورامفينيكول، واحتضان بين عشية وضحاها في 42 درجة مئوية. أولاً، قم بتحميل برنامج Cas OF Finder لاختيار المواقع المستهدفة.حدد نوع PAM المناسب لنوع معين من Cas9 و الجينوم الهدف. تعبئة في علامة التبويب تسلسلات الاستعلام. اختر رقم عدم التطابق وانقر على زر الإرسال.بعد بضع ثوان، سوف تظهر المواقع على الهدف وخارجها. بشكل عام، اختر المواقع خارج الهدف مع عدم التطابق واحد إلى ثلاثة. المقبل ، والنظام في رنا وRRNA oligos المسار مع تسلسل قالب وتضخيم القالب كما هو مبين في بروتوكول النص.تحليل اثنين من microliters من الحمض النووي قالب تضخيم، على هلام agarose 2٪ومن ثم تنقية القالب. احتضان خليط التفاعل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، إضافة 0.5 ميكرولترات من DNAse واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة، ومن ثم تنقية SGRNA.ثم، علاج 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في المختبر منقولة مع 250 وحدة من الفوشطة النخاعية القلوية لمدة ثلاث ساعات في 3 درجات مئوية، في وجود 100 وحدة من مثبطات RNAse، ومن ثم تنقية SGRNA المعالجة. أولا، الحفاظ على خلايا HEK293 T في DMEM تكمل مع 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. المقبل، مزيج اثنين من ميكروغرام من نوع البرية أو بروتين Snyper Cas9 مع اثنين من ميكروغرام من SGRNA، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق لجعل مجمعات RNP.تبسينيزي عد الخلايا، ثم غسلها وإعدادها في المخزن المؤقت الكهربائي كما هو مبين في بروتوكول النص. الكهربائي مجمعات RNP في الخلايا باستخدام نبضة واحدة من 1300 فولت لمدة 30 مللي ثانية. مباشرة بعد electroporation، لوحة الخلايا على لوحة 48-جيدا مليئة 500 ميكرولترات من DMEM، تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية.احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الحفاظ على خلايا HEK293 T في DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم السابق لتحول، تبسينيزي و عد الخلايا.إذا كان يعمل على نطاق 48 جيدا، لوحة 10، 000 خلية في البئر و 250 ميكرولترات من متوسط النمو الكامل. باستخدام كاشف transfection القائم على الدهون، وإعداد 250 نانوغرام من P3S Cas9 plasmid و 250 نانوغرام من SGRNA لTransfection. ثم، مزيج البلازميدات في 25 ميكرولترات من ميوم خالية من المصل.تمييع ميكرولتر واحد من كاشف transfection مع 25 ميكرولترات من MEM خالية من المصل. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الجمع بين خليط البلازميد مع خليط مُكشف نقل الحيوانات واحتضانه في الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل مجمعات بليسميد ليبوفكتامين.بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من هذا الخليط مباشرة إلى كل خلايا تحتوي على البئر. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لخلط. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة بعد transfection، قبل أن يُحسب للتعبير الجينية العابرة.بعد عزل الحمض النووي الجينومي المعد سابقاً، قم بتوليد مكتبات تسلسلية عميقة عن طريق تضخيم نظام PCR لـ GDNA مع الجاهمات الأولية التي تستهدف الهدف وخارج الهدف. ثم استخدم التمهيدي الفهرس لتسمية كل عينة. استخدم جهاز تسلسل الجيل التالي لإخضاع مكتبات التجمع لتسلسل نهاية مقترن.بعد أن يتم تنفيذ شاشة Snyper، يمكن حساب النسبة المئوية للمستعمرات البقاء على قيد الحياة عن طريق قسمة عدد المستعمرات على لوحة LB الانتقائية على عدد المستعمرات على لوحة LB غير انتقائية. في حين أن هذه النسبة المئوية عادة ما تكون منخفضة جداً عند تنفيذها مع مكتبات SP Cas9، يمكن أن تثري الضربات الإيجابية الحقيقية بتكرار الشاشة مع تجمع الباقين على قيد الحياة. تظهر شاشة Snyper التمثيلية معدل بقاء 100٪ يتم الحصول عليه بعد الشاشة الثالثة.يمكن إجراء عمليات نقل باستخدام RNPs أو plasmid المشفرة Snyper Cas9 لأهداف مختلفة ، والأنشطة الناتجة عن ذلك على الهدف وخارجها تقاس بالأهداف أمبريكون التسلسل. في معظم الأهداف، Snyper Cas9 يظهر نفس المستوى من على الأنشطة المستهدفة ونسب تحديد أعلى مقارنة مع نوع البرية. ويمكن أيضاً استخدام SGRNAs المبتورة لزيادة تحسين التحديد.أعلى كفاءة التحول في خطوة التنظيف الأولى من المهم جدا عدم فقدان المستنسخين مع خصوصية عالية. في وقت لاحق خطوات الفرز تكرار أقل كفاءة التحول منذ يتم بالفعل المخصب استنساخ في الخطوة الفرز الأولى، وهناك فرصة أقل من فقدانها. سيكون هناك أكثر من استنساخ واحد وجدنا في شاشة Snyper.وينبغي وصف الأنشطة على الهدف وخارج الهدف من هذه المستنسخات في العديد من الأهداف المختلفة ممكن لاختيار المستنسخين مع أفضل أداء. بهذه الطريقة، يمكن للعلماء تحسين خصوصية الإنزيمات الشبيهة بـ Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف. بالإضافة إلى ذلك، لا يحتاج العلماء إلى أي معرفة مسبقة حول بنية البروتين لإجراء تحسينات.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

إدخال الجين بالضربة القاضية مباشرة في مرحلة Amastigote من التريبانوسوما كروزي باستخدام نظام CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

التحقيق في الدور النسخي لـ RUNX1 كاتم الصوت من قبل كريسبر/كاس9 ريبونوكليوبروتين في خلايا سرطان الدم النقوي الحاد

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

التعرف على مستقبلات سطح الخلية باستخدام شاشات CRISPR/Cas9 الجينية على مقياس الجينوم

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

في المختبر إخراج تطور Endonuclease تقييد مع خصوصية أكثر صرامة

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-بوساطة الجينوم التحرير في الأحرف ال الخيطية هانتييلا omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...