Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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这项研究得到了韩国科学和信息和通信技术部 (2017m3a9b4062006) 和韩国国家研究基金会 (nrf) 的赠款支持. 韩国政府 (赠款编号2017m3a9b40604 和 2017M3A9B4061406) 至 jungjoon k。李。质粒编码 pgrg36 是南茜·克雷格 (addgene 质粒 #16666) 的礼物, p11-lacy-wtx1 是赵惠民的礼物。

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

toolgen 已提交专利申请 (pct/kr2017/006212), 涵盖狙击手屏幕 (状态: 待定, 发明者: jungjoon k. lee)。jungjoon k. lee、joonsun lee、minhee jung 和 euihwan jeong 是 toolgen inc. 的雇员。

对于那些谁想要避免繁琐的筛选程序, 以获得 sanper-cas9, sanper-cas9 蛋白和编码质粒是可用的。利用这些材料, 应确定 sgrna 的最佳长度, 即提供最高特异性比。此外, 建议以 rnp 格式交付 niper-cas9 和 sgrna, 因为它通常比质粒格式的传递产生更高的特异性比。与 sanper-cas9 不同的是, 其他工程 cas9 变种与截断的 sgrna 6、7或 rnp 表格8的交付不兼容 (hifi-cas9 除外)。
对于狙击手屏幕, 选择不匹配的序列是最重要的一步。应避免选择与goi序列的低裂解活性相关的不匹配的 sgrna。如果没有, cas9 变种的特异性水平不会将大肠杆菌基因组 dna 与不匹配的目标位点分离。这种效应将导致大量的背景菌落, 危及整个筛选过程。
由于与酵母相比, 大肠杆菌具有较快的翻倍时间和较高的转化效率, 因此与酵母筛选方法相比, 狙击手筛网具有优势。此外, 狙击手屏幕应该比其他基于大肠杆菌的系统更敏感, 在这些系统中, 不匹配的位点被带到质粒上: 在我们的系统中有一个基因组 dna 的副本, 因此只有一个不匹配站点的副本, 但有大量的单个大肠杆菌细胞内的质粒。
其他诱导 dsb 的 dna 内切酶的特性, 如 sacas9 或 cpf1, 也可以通过使用狙击手屏幕来改善。不幸的是, 狙击手屏幕不能直接用来增加基础编辑器的特异性, 因为碱基编辑不会诱导 dsb 在大肠杆菌的基因组 dna。由于基础编辑器在其系统的核心中使用了 cas9 的镍酶或死版本, 因此可以通过使用从狙击手屏幕获得的点击率来提高基础编辑器的特性。

本文旨在结合不同的策略, 提高 cas9 的特异性。已经制定了各种方法来避免 crispr-cas9 的非目标影响。例如, 截断的 sgrna 可用于实现更高的特异性1。此外, cas9 传递的方法可以从质粒格式转变为 rnp 格式, 以获得更高的特异性2。根据前面描述的合理设计,对化脓性链球菌 cas9 (spcas9) 蛋白的特定氨基酸残基进行了改性.或者 , 氨基酸残基被随机改变, 并使用酵母6或大肠杆菌7,8 筛选系统确定了特异性最高的 cas9 变种。
然而, 许多小组报告说, cas9 变种工程使用的设计, 以削弱非特异性相互作用之间的 cas9 和基板表现出低目标上的活性 7,8,9,10,11,12. 我们开发了一个基于大肠杆菌的定向进化系统--狙击手屏幕, 以随机筛选出突变的 cas9 变种。与酵母系统相比,大肠杆菌筛选系统具有优势, 因为大肠杆菌的翻倍时间较快, 转化效率较高。
在狙击手屏幕中使用了基于三种不同质粒和一个整合到大肠杆菌基因组中的感兴趣基因的负选择和阳性选择。cas9 变种是在 cmv-plteto1 双启动子系统下表达的, 这个系统的低拷贝数质粒 , 因此在大肠杆菌中识别的候选体可以在哺乳动物细胞中进行测试, 而无需亚克隆。利用 tn7 转座子系统将 goi 引入大肠杆菌基因组. sgrna 质粒, 其中包含对温度敏感的复制来源, 表达了针对goi的 sgrna;然而, sgrna 和goi序列并不完全匹配。一个完全匹配的 sgrna 靶点存在于含有 ccdb基因的第三个质粒上, 该质粒编码一种毒害旋转酶的致命产物。在该系统中, 表达具有高离目标活动的 cas9 变种的细胞被移除, 因为双链断裂 (dsb) 被引入位于基因组 dna 中的不匹配位点。另一方面, 表达 cas9 变异的细胞也被删除, 低靶向活性的ccdB基因表达。通过改变环水四环素 (atc) 的浓度, 可以改变 cas9 变种的表达水平, 从而调整选择力。
我们推断, 在基因组 dna 而不是质粒中定位不匹配的 sgrna 靶点将增加系统的灵敏度。这种方法的优点是只有一个基因组位点, 而在单个大肠杆菌细胞内会有许多质粒, 每个质粒都包含一个目标位点。
利用这个系统, 我们确定了一个 cas9 变种, sanper-cas9, 它显示了 wt 级的目标活动, 并减少了与 wt cas9 相比的非目标活动。通过使用截断的 sgrna 或基于 rnp 的交付而不是基于等离子体的交付, niper-cas9 可以实现更高的特异性比。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

将聚集在规则间隔的短回文重复 (crispr) 相关蛋白 9 (cas9) 发展成治疗方式, 需要避免其潜在的有害的离目标影响。已经制定了几种方法来减少这种影响。在这里, 我们提出了一个基于大肠杆菌定向进化方法, 称为狙击手屏幕, 以获得一个 cas9 变种与优化的特异性和保留目标上的活性, 称为狙击手-cas9。使用狙击手屏幕, 可以同时执行正面和负面选择。屏幕也可以与其他单引导 rna (sgrna) 序列重复, 以丰富真正的正面命中。通过使用 cmv-plteto1 双启动子来表示 cas9 变种, 可以在哺乳动物细胞中快速检查集合库的性能。还介绍了提高狙击手-cas9 特异性的方法。首先, 使用截断的 sgrna 以前已被证明可以增加 cas9 的特异性。与其他工程 cas9 不同, ─ cas9 与截断的 sgrna 结合使用时, 保留了野生类型 (wt) 水平的目标上活动。其次, 在不影响其目标上活动的情况下, 可以以核糖核酸蛋白 (rnp) 格式 (rnp) 形式 (而不是质粒形式) 交付 saniper-cas9。

在执行狙击手屏幕后, 生存菌落的百分比可以通过将 lb 板上含有氯霉素、卡那霉素、阿拉伯糖和 atc (ckaa) 的菌落数量除以含有氯霉酚、卡那霉素、阿拉伯糖和 atc (ckaa) 的菌落数量来计算仅限氯霉素和卡那霉素 (ck)。当使用 spcas9 的库执行狙击手屏幕时, 这个百分比通常很低。通过使用幸存池重复屏幕, 可以丰富真正的正命中。例如, 在这个具有代表性的狙击手屏幕中, 在第三个屏幕之后获得了100% 的存活率 (图 1)。使用 rnps 或等离子体中编码的减号-cas9 的转移可以针对各种目标以及通过有针对性的大幅测序测量的目标上和目标外活动来完成 (图 2)。在大多数目标中, sanicper-cas9 显示出与 wt 相同水平的目标上活动和更高的特异性比率, 截断的 sgrna 也可用于进一步提高特异性 (图 3)。然而, 它们的使用仅限于几个目标, 因为在大多数情况下, 它们导致目标上的活动低于全长 sgrna。因此, 必须对长度不同 (从17到20轴) 的 sgrna 进行测试, 必须测量目标和非目标活动, 以优化特异性。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> 图 1: 使用不同库的随机 cas9 变体执行的代表性狙击手屏幕.突变体库、ep 库 i 和 ep 库 ii 表示使用不同的商业工具包创建的库。首先, 第二, 最后表示浓缩屏幕执行的次数7。这一数字已从 lee 等人7人的数字中修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> 图 2: wt-cas9 或 sanper-cas9 的目标和非目标活动与通过质粒或 rnp 传递的 20 mer 引导序列配对.特异性比率是通过将目标上的活动除以目标外活动来确定的。错误条表示 sem (n = 3)7。这一数字已从 lee 等人7人的数字中修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> 图 3: 包括使用可变长度的 sgrna 获得的用于 fandcf01 和 aavs 站点的 sanper-cas9 的目标和非目标活动.特异性比率是通过将目标站点上的度频率除以各自目标外站点的缩进频率来确定的。sgrna 与匹配的鸟嘌呤在 5 ' 终端 (gx18 或 gx19) 和那些与不匹配的鸟嘌呤 (gx17, gx18, gx19, 或 gx20) 表示。当归一化的目标上活动 & lt;70 7 时, 没有计算特异性比率。这一数字已从 lee 等人7人的数字中修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

在这里, 我们提出了一个优化 crispr-cas9 的协议, 以实现更高的特异性, 而不会丢失目标活动。我们使用一种称为狙击手屏幕的定向进化方法来查找具有所需特征的突变 cas9。sanicper-cas9 与截断的单导轨 rna 兼容, 并以核糖核酸蛋白格式交付, 这是实现更高特性的著名策略。

利用 niper-cas9 在不损失目标活动的情况下通过定向进化, 最大限度地减少 crispr-cas9 的非目标效应

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

在自然界中，Cas9是一种免疫蛋白，可抵御入侵病毒，进化后更喜欢具有混杂特异性的Cas9，这种特异性可以通过自发突变切割病毒DNA。我们构建了一个人工定向进化系统，它更喜欢具有高特异性的优化的Cas9变种。负选择和正面选择在狙击手筛查系统中同时工作。Cas9 具有减少的目标活动，还可以同时筛选具有减少目标活动以及保持目标活动。随机引入整个Cas9序列的突变，以生成要筛选的库。这使得在意外位置找到突变成为可能。目前，许多学术界和工业界的研究人员正在使用Y型Cas9进行治疗开发。但是，Y 型 Cas9 的特异性未得到优化，这可能导致紧密包装。在人类中，这意味着随机基因的意外突变，这可能导致严重的副作用。有许多Cas9像酶，这是正在开发的治疗。我们的技术可用于提高其他DNA和核的特异性，如吉平格，泰国和Cas9也如CPF1。使库足够大是增加获得具有重要功能的变体的可能性的关键。确保冷却步骤效率高，并使用高效称职的电池。为了开始这个程序，添加一个CCDB质粒和SGRNA质粒的南图，双不匹配到解冻的BW25141 GOI细胞的50微升。通过移液轻轻混合细胞，并将它们转移到预冷却的0.1厘米电穿孔盒中。通过电穿孔将大肠杆菌与两个质粒进行转化。电穿孔完成后，立即添加250微升S、SOC介质。轻轻移液溶液，混合细胞和介质，将混合物转移到1.5毫升微离心管中。恢复转化的细胞，并在32摄氏度下孵育，轻轻摇晃一小时。继续准备文本协议中概述的 Snyper 筛选单元。当准备执行 Snyper 筛选时，使用前面描述的 elctropation 过程，将 Snyper 筛选细胞与每个库中准备好的 Cas9 变种质粒的 100 纳米图进行转换。然后，将250微升细胞转移到一个新鲜的1.5毫升微离心管。将 250 个 ATC 象形图添加到每毫升 10 毫微克的最终浓度中。在32摄氏度下用轻轻的震动孵育一小时，恢复含 ATC 和 ATC 无 ATC 的细胞。在含有氯霉素和卡纳霉素的LB汞板上回收无 ATC 细胞的板 25 微升。将 ATC 添加到回收的 ATC 中，在 245 毫米 LB 的汞板上，最终浓度为每毫升 100 毫微克。立即将含 ATC 的细胞板镀在含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的 LB 碳中。在32摄氏度下孵育所有板过夜。第二天，拍下盘子。使用开放式 CFU 软件，计算可行菌落的数量，确保非选择性板上的菌落数量至少比库的多样性大十倍，以涵盖所有变体。从所有三个库中拉出在选择性板块上幸存下来的殖民地。将这些池菌落转移到250毫升的LB介质中，辅以氯霉素，并在42摄氏度下孵育过夜。首先，加载 Cas OF Finder 软件以选取目标站点。选择适用于特定类型的 Cas9 和目标基因组的 PAM 类型。填写查询序列选项卡。选择不匹配的数字，然后单击提交按钮。几秒钟后，将出现目标站点和目标外站点。通常，选择一到三个不匹配的离目标站点。接下来，订购具有模板序列的CRRNA和轨道RRNA寡，并放大文本协议中概述的模板。在2%的加糖凝胶上分析放大模板DNA的两微升，然后净化模板。在37摄氏度下孵育反应混合物过夜。第二天，加入0.5微升DNAse，在37摄氏度下孵育15至30分钟，然后净化SGRNA。然后，在100个单位的RNAse抑制剂存在的情况下，用250个单位的小牛肠道碱性磷酸酶治疗10微克的体外转录RNA，在3摄氏度下进行3小时，然后净化经过的SGRNA。首先，在DMEM中保持 HEK293 T 细胞，在 37 摄氏度下辅以 10%FBS 和 1% 抗生素，辅以 5% 的二氧化碳。接下来，将野生型或Snyper Cas9蛋白的两微克与两微克的SGRNA混合，并在室温下孵育十分钟，使RNP复合物。trypsin化和计数细胞，然后洗涤它们，并在电穿孔缓冲液中准备，如文本协议中所述。使用 1300 伏特的脉冲将 RNP 复合物电化到电池中，间隔 30 毫秒。电穿孔后立即将细胞板放在一个48孔的板上，板上装满了500微升的DMEM，并辅以10%FBS和1%抗生素。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。在 DMEM 中保持 HEK293 T 细胞，并在 37 摄氏度下以 10% FBS 和 1% 抗生素补充 5%二氧化碳。转染前一天，对细胞进行三试和计数。如果工作在48井规模，板10，000细胞每井和250微升的完整生长介质。使用基于脂质的转染试剂，准备250纳米的P3S Cas9质粒和250纳米的SGRNA转染。然后，将质粒混合在25微升无血清 MEM 中。用25微升无血清 MEM 稀释一微升转染试剂。在室温下孵育这种混合物五分钟。将质粒混合物与转染试剂混合物结合，在室内孵育20分钟，形成质粒脂质胺复合物。在此之后，将这种混合物的50微升直接添加到每个含有细胞的井中。轻轻摇动板来回混合。在转染后48至72小时，在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育细胞，然后进行转基因表达检测。在隔离先前准备的基因组DNA后，通过GDNA的PCR扩增生成深度测序库，并基于目标和非靶点。然后，使用索引底注标记每个样本。使用下一代测序机使池库具有配对的端排序。执行 Snyper 屏幕后，可以通过将选择性 LB 板上的菌落数除以非选择性 LB 板上的菌落数来计算生存菌落的百分比。虽然使用 SP Cas9 的库执行此百分比通常非常低，但可以通过使用幸存的池重复屏幕来丰富真正的正命中数。具有代表性的 Snyper 屏幕显示，在第三个屏幕之后，获得 100% 的存活率。使用 RNP 或质粒编码的 Snyper Cas9 进行转染，可针对各种目标进行，并可对目标安培康测序进行目标上和目标外活动测量。在大多数目标，Snyper Cas9 显示的目标活动水平和更高的特异性比相比野生类型。截断的 SGRNA 也可用于进一步提高特异性。在第一个清洁步骤中，更高的转换效率非常重要，不要丢失具有高特异性的克隆。以后的筛选步骤重复的转换效率较低，因为克隆在第一个筛选步骤中已经丰富，并且丢失克隆的可能性较小。在 Snyper 屏幕中，我们将发现多个克隆。这些克隆的目标和非目标活动应在尽可能多的不同目标中进行描述，以选择具有最佳性能的克隆。通过这种方法，科学家可以提高Cas9样酶的特异性，而不会损失目标活性。此外，科学家不需要事先了解蛋白质的结构来改进。

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

科研

遗传学

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 基因编辑制作人类疟疾寄生虫的条件突变体

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 诱导人多潜能干细胞内源蛋白标记的应用

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 核糖核酸蛋白介导的精确基因编辑通过管电穿孔

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

使用CRISPR/Cas9系统将基因挖空直接引入锥虫瘤的肌瘤阶段

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

在人类多能干细胞中使用CRISPR-CAS9生成定义的基因组修饰

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白在急性骨髓性白血病细胞中的RUNX1电子消光器的转录作用研究

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

使用基因组-规模CRISPR/Cas9基因屏幕进行细胞表面受体识别

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

具有更严格特异性的限制内核内核酶的体外定向进化

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-中切基因组编辑在纤维阿莫西特 亨蒂埃拉阿曼尼西斯

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...