Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en ICT van Korea (2017M3A9B4061406) en de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (subsidie nummers 2017M3A9B4061404 en 2018M3A9H3020844) te Jungjoon K. Lee. Het plasmide codering van pGRG36 was een geschenk van Nancy Craig (Addgene plasmide #16666) en p11-LacY-wtx1 was een geschenk van Huimin Zhao.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen heeft ingediend een octrooiaanvraag (PCT/KR2017/006212) die betrekking hebben op Sniper-scherm (status: in behandeling, uitvinder: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung en Euihwan Jeong zijn werknemers van ToolGen, Inc.

Voor degenen die voorkomen dat omslachtig screening procedures willen voor het verkrijgen van Sniper-Cas9, zijn het eiwit Sniper-Cas9 en het coderen plasmide beschikbaar. Het gebruik van deze materialen, de optimale lengte van de sgRNA, die het hoogste percentage van de specificiteit, moet worden bepaald. Bovendien, wordt levering van Sniper-Cas9 en sgRNA in een RNP-indeling aanbevolen omdat het meestal in een hogere specificiteit ratio dan levering in een plasmide-indeling resulteert. In tegenstelling tot Sniper-Cas9 zijn andere gemanipuleerde Cas9 varianten niet compatibel met afgekapte sgRNAs6,7 of levering in RNP vorm8 (met uitzondering van HiFi-Cas9).
Voor Sniper-scherm is de selectie van de verkeerde volgorde de belangrijkste stap. Selectie van een niet-overeenkomende sgRNA die wordt geassocieerd met lage decolleté activiteit naar de Indiase overheid volgorde moet worden vermeden. Als dat niet het geval is, Cas9 varianten met een WT niveau van specificiteit zal niet klieven aan de genomic DNA van E. coli met de niet-overeenkomende doelsite. Dit zal leiden tot een groot aantal achtergrond kolonies, de hele procedure screening in gevaar te brengen.
Omdat E. coli een snelle heeft verdubbeling van tijd en hoge transformatie efficiëntie ten opzichte van gist, Sniper-scherm is voordelig in vergelijking met gist gebaseerde screeningmethoden. Sniper-scherm moet bovendien gevoeliger dan andere E. coli-gebaseerde systemen waarin de niet-overeenkomende site is uitgevoerd op een plasmide: er is één exemplaar van de genomic DNA en dus slechts één kopie van de niet-overeenkomende site in ons systeem, maar een groot aantal plasmiden binnen één E. coli cel.
De specifieke kenmerken van de andere DNA-enzym die DSBs, zoals SaCas9 of Cpf1s induceren, kunnen ook worden verbeterd met behulp van Sniper-scherm. Worden helaas, Sniper-scherm kan niet gebruikt te verhogen van de specificiteit van base redacteuren direct, omdat basis redacteuren doen niet het induceren van DSBs in de genomic DNA van E. coli. Als basis editors de nickase of de versie van de dood van Cas9 in de kern van hun systeem gebruiken, kunnen de specifieke kenmerken van base redacteuren worden verhoogd door gebruik van de hits verkregen Sniper-scherm.

In dit document streven wij naar het verbeteren van de specificiteit van de Cas9 door het combineren van verschillende strategieën. Verschillende methoden om de effecten van de af-target van CRISPR-Cas9 te vermijden hebben ontwikkeld. Afgeknotte sgRNAs kan bijvoorbeeld worden gebruikt om hogere specificiteit1. Bovendien kan de methode van Cas9 levering vanuit de plasmide-indeling worden gewijzigd in een formaat RNP verkrijgen van hogere specificiteit2. Specifieke aminozuurresidu's van de Streptococcus pyogenes -Cas9 (SpCas9) eiwit zijn gewijzigd volgens het rationele ontwerp eerder3,4,5beschreven. Uitwijkmogelijkheid, aminozuurresidu's zijn gewijzigd in een willekeurige manier en de varianten van de Cas9 met de hoogste specificiteit werden geïdentificeerd met behulp van een gist6 of een E. coli7,-8 , screening systeem.
Echter, veel groepen hebben gemeld dat de Cas9 varianten met behulp van het ontwerp ontworpen aan de knelpunten van de niet-specifieke interactie tussen Cas9 en het substraat tentoonstelling laag op de doelsoort activiteiten7,8,9, 10 , 11 , 12. ontwikkelden we een E. coli-gebaseerde gerichte evolutie systeem, Sniper-scherm, scherm willekeurig mutagenized Cas9 varianten. Een E. coli screening systeem heeft voordelen ten opzichte van een gist-systeem vanwege de sneller verdubbeling transformatie van tijd en hogere efficiëntie van E. coli.
Zowel de positieve als de negatieve selectie, op basis van drie verschillende plasmiden en een gen van belang (Indiase) geïntegreerd in het genoom van E. coli , worden gebruikt in Sniper-scherm. Cas9 varianten worden uitgedrukt onder het systeem van CMV-PltetO1 dual-promotor van een lage-kopie nummer plasmide zodat kandidaten in E. coli geïdentificeerd kunnen worden getest in zoogdiercellen zonder de noodzaak voor het subcloning. De Indiase overheid is geïntroduceerd in het genoom van de E. coli met behulp van de Tn7 transposon systeem. Het plasmide-sgRNA, die een temperatuurgevoelige oorsprong van replicatie bevat, spreekt een sgRNA gericht op de Indiase overheid; echter, de sgRNA en de Indiase overheid sequenties zijn niet perfect overeen. Een doelsite perfect afgestemd sgRNA bestaat voor een derde plasmide met de ccdB -gen, dat codeert een dodelijke product dat gyrase vergiftigt. In dit systeem, worden de cellen uiten Cas9 varianten met hoge korting-target activiteiten verwijderd omdat dubbel-strand einden (DSBs) worden ingevoerd in de niet-overeenkomende site gelegen in de genomic DNA. Aan de andere kant, worden cellen uiten Cas9 varianten met lage op doelsoort activiteiten ook verwijderd vanwege dodelijk ccdB genexpressie. Het niveau van de expressie van de varianten van de Cas9 kan worden gewijzigd door een wijziging van de concentratie van anhydrotetracycline (ATC), die de kracht van de selectie aanpast.
We redeneerde dat het lokaliseren van de doelsite niet-overeenkomende sgRNA in de genomic DNA in plaats van op een plasmide de gevoeligheid van het systeem zou toenemen. Het voordeel van deze aanpak is dat er slechts één genomic site, terwijl er zou veel plasmiden, elk met een doelsite, binnen een honkslag E. coli cel.
Met behulp van dit systeem, wij een Cas9 variant, Sniper-Cas9, die toont WT-niveau op doelsoort zijn activiteiten en verminderd uit doelsoort zijn activiteiten in vergelijking met WT Cas9 geïdentificeerd. Sniper-Cas9 kunt bereiken zelfs hogere specificiteit verhoudingen met afgekapte sgRNAs of RNP gebaseerde levering in plaats van plasmide gebaseerde levering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

De ontwikkeling van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR)-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) in therapeutische modaliteiten vereist het vermijden van de potentieel schadelijke gevolgen ervan af-target. Verschillende methoden hebben ontwikkeld om dergelijke effecten. Hier presenteren we een Escherichia coli-gebaseerde gerichte evolutie methode genaamd Sniper-scherm om het verkrijgen van een Cas9-variant met geoptimaliseerde specificiteit en behouden op de doelsoort activiteit, Sniper-Cas9 genoemd. Met behulp van Sniper-scherm, kan positieve en negatieve selectie gelijktijdig worden uitgevoerd. Het scherm kan ook worden herhaald met andere single-gids-RNA (sgRNA)-sequenties te verrijken voor de echte positieve hits. Met behulp van de CMV-PltetO1 dual promotor uitspreken Cas9 varianten, kan de prestaties van de gebundelde bibliotheek worden snel ingecheckt zoogdiercellen. Methoden om het specifieke karakter van Sniper-Cas9 zijn ook beschreven. Ten eerste, het gebruik van afgekapte sgRNAs eerder gebleken te verhogen van de specificiteit van de Cas9. In tegenstelling tot andere gemanipuleerde Cas9s behoudt Sniper-Cas9 een wild-type (WT) niveau van aan-target activiteit in combinatie met afgekapte sgRNAs. Ten tweede, de levering van Sniper-Cas9 in een ribonucleoprotein (RNP) formaat in plaats van een plasmide-indeling is mogelijk zonder haar activiteit op doelsoort zijn.

Nadat Sniper-scherm wordt uitgevoerd, kan het percentage van overleving kolonies worden berekend door het aantal kolonies op de plaat van de LB met chlooramfenicol, kanamycine, arabinose, en ATC (CKAA) door het aantal kolonies in de LB plaat bevattende chlooramfenicol en kanamycine alleen (CK). Dit percentage was meestal erg laag wanneer Sniper-scherm werd uitgevoerd met de bibliotheken van SpCas9. True-positieve hits kunnen worden verrijkt door het herhalen van het scherm met de overlevende zwembad. Deze vertegenwoordiger Sniper-scherm, bijvoorbeeld, is een 100% overlevingskans verworven na het derde scherm (Figuur 1). Transfections met RNPs of plasmide-gecodeerde Sniper-Cas9 kunnen worden gedaan voor verschillende doelen en de resulterende op-target en af-target activiteiten gemeten door gerichte amplicon sequencing (Figuur 2). Hooguit doelen, Sniper-Cas9 toont hetzelfde beschermingsniveau voor de doelsoort activiteiten en hogere specificiteit ratio's ten opzichte van de PM beknot sgRNAs kunnen ook worden gebruikt ter verdere verbetering van specificiteit (Figuur 3). Hun gebruik is echter beperkt tot slechts een paar doelen, omdat zij leiden lage op doelsoort zijn activiteiten in vergelijking met full-length sgRNAs, in de meeste gevallen tot. Daarom, sgRNAs met verschillende lengtes (vanaf 17 - tot 20-mers) moeten worden getest en zowel op de doelsoort en af-target activiteiten moeten worden gemeten om te optimaliseren specificiteit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Figuur 1: vertegenwoordiger Sniper-schermen uitgevoerd met verschillende bibliotheken met willekeurige Cas9 varianten. Mutator bibliotheek, EP bibliotheek ik en EP bibliotheek II geven bibliotheken gemaakt met behulp van verschillende commerciële kits. Eerste, tweede en finale geven het aantal keren dat de verrijking scherm was7uitgevoerd. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Figuur 2: On-target en af-target activiteiten van WT-Cas9 of Sniper-Cas9 gecombineerd met een 20-mer gids reeks geleverd via plasmide of RNP. Specificiteit-ratio's werden vastgesteld door het verdelen van de doelsoort op activiteit door de activiteit van uit-target. Foutbalken geven SEM (n = 3)7. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Figuur 3: On-target en af-target activiteiten van Sniper-Cas9 in vergelijking met de WT-Cas9 verkregen met behulp van sgRNAs met een variabele lengte, gericht op de websites FANCF01 en AAVS. Specificiteit-ratio's werden vastgesteld door indel frequenties op aan-target sites delen door die op de respectieve sites van de af-target. sgRNAs met een overeenkomende guanine in het terminus 5' (GX18 of GX19) en mensen met een niet-overeenkomende guanine (gX17, gX18, gX19 of gX20) worden vermeld. Specificiteit ratio's waren niet berekend wanneer de genormaliseerde op doelsoort zijn activiteiten waren < 70%7. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Hier presenteren we een protocol voor het optimaliseren van CRISPR-Cas9 om een hogere specificiteit zonder verlies van aan-target activiteit. We een gerichte evolutie aanpak genoemd Sniper-scherm gebruiken om te zoeken een mutant Cas9 met de gewenste kenmerken. Sniper-Cas9 compatible met afgekapte single-gids RNAs en levering in een ribonucleoprotein formaat, bekende strategieën voor het bereiken van hogere specificiteit.

Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In de natuur is Cas9 een immuuneiwit tegen binnenvallende virussen die de evolutie de voorkeur geeft aan Cas9 met promiscue specificiteit die viraal DNA kan klemmen met spontane mutaties. We bouwden een kunstmatig gericht evolutiesysteem dat de voorkeur geeft aan een geoptimaliseerde Cas9-variant met een hoge specificiteit. Zowel negatieve als positieve selecties werken gelijktijdig in het Sniper Screening System.Cas9-varianten met verminderde off-target activiteit die ook on-target activiteit behouden, kunnen in één keer worden gescreend. Mutaties werden geïntroduceerd op de hele Cas9 sequentie willekeurig om de bibliotheek te produceren om te worden gescreend. Dit maakte het mogelijk om mutaties in onverwachte posities te vinden.Momenteel gebruiken veel onderzoekers in de academische wereld en de industrie Y-type Cas9 voor therapeutische ontwikkelingen. De specificiteit van Y-type Cas9 is echter niet geoptimaliseerd, wat kan resulteren in een strak verpakte af. Bij mensen betekent dit onverwachte mutaties in willekeurige genen, wat kan leiden tot ernstige bijwerkingen.Er zijn veel Cas9 zoals enzymen die worden ontwikkeld in de therapieën. Onze techniek kan worden gebruikt om de specificiteit van andere DNA- en nucleids zoals Jipinger, Thailand en Cas9 te verbeteren, zoals CPF1. Het groot genoeg maken van een bibliotheek is de sleutel om de mogelijkheden te vergroten om een variant met belangrijke functie te krijgen.Zorg ervoor dat u een hoog rendement in de koeling stap te krijgen, en gebruik zeer efficiënte bevoegde cellen. Om deze procedure te beginnen, voeg een nanogram van zowel de CCDB plasmid en de SGRNA plasmid met dubbele mismatches in vijftig microliters van ontdooide BW25141 GOI cellen. Meng de cellen voorzichtig door pipetting, en breng ze in een voorgekoelde, 0,1 centimeter elektroporatie cuvette.Transformeer de E-coli met de twee plasmiden via elektroporatie. Voeg onmiddellijk na de elektroporatie 250 microliter van SOC-medium toe. Voorzichtig pipetten de oplossing om de cellen en het medium te mengen, en breng het mengsel naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Herstel de getransformeerde cellen en broed ze uit op 32 graden Celsius, met een uur zachtjes schudden. Doorgaan met het voorbereiden van de Snyper screening cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Wanneer u klaar bent om Snyper screening uit te voeren, transformeren de Snyper screening cellen met 100 nanogram van de voorbereide Cas9 variant plasmiden uit elke bibliotheek met behulp van de elctroporation proces dat eerder werd beschreven.Breng vervolgens 250 microliter van de cellen over naar een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 250 picogrammen ATC toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 nanogram per milliliter. Herstel zowel de ATC-bevattende als de ATC-vrije cellen door ze een uur lang met zacht schudden uit te broeden op 32 graden Celsius.Plaat 25 microliter van de teruggewonnen ATC-vrije cellen op een LB agarplaat, met chlooramfenicol en kanamycine. Voeg ATC toe aan de teruggewonnen ATC met cellen tot een uiteindelijke concentratie van 100 nanogram per milliliter op een 245 millimeter LB agarplaat. Onmiddellijk plaat de ATC-bevattende cellen op een LB agar met plaat met chloramphenicol, kanamycine, en arabinose.Incubeer alle platen 's nachts bij 32 graden Celsius. De volgende dag, fotografeer de platen. Met behulp van de open CFU-software, tel het aantal levensvatbare kolonies, ervoor te zorgen dat het aantal kolonies op de niet-selectieve plaat is ten minste tien keer groter dan de diversiteit van de bibliotheek, om alle varianten te dekken.Trek de kolonies die overleefden op de selectieve platen van alle drie de bibliotheken. Breng deze gepoolde kolonies over op 250 milliliter LB-medium, aangevuld met chlooramphenicol, en broeder 's nachts bij 42 graden Celsius. Laad eerst de Cas OF finder-software om doelsites te kiezen.Selecteer het PAM-type dat geschikt is voor het specifieke type Cas9 en het doelgenoom. Vul het tabblad queryreeksen in. Kies het mismatchnummer en klik op verzenden.Na een paar seconden verschijnen de on-target en off-target sites. In het algemeen, kies de off-target sites met een tot drie mismatches. Bestel vervolgens de CRRNA en de RRNA-oligo's Track met sjabloonreeksen en versterk de sjabloon zoals beschreven in het tekstprotocol.Analyseer twee microliters van de versterkte sjabloon DNA, op een 2%agarose gel en zuiver vervolgens de sjabloon. Incubeer het reactiemengsel 's nachts bij 37 graden Celsius. De volgende dag, voeg 0,5 microliter DNAse en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten, en vervolgens zuiveren van de SGRNA.Behandel vervolgens 10 microgram van het in-vitro getranscribeerde RNA met 250 eenheden kalverintestinale alkalische fosforfosfatase gedurende drie uur bij 3 graden Celsius, in aanwezigheid van 100 eenheden RNAse-remmer, en zuiver vervolgens de behandelde SGRNA. Ten eerste, handhaven HEK293 T-cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Meng vervolgens twee microgram van wild type of Snyper Cas9-eiwit met twee microgram SGRNA en broed tien minuten bij kamertemperatuur om RNP-complexen te maken.Trypsinize en tel de cellen, dan wassen en bereiden ze in elektroporatie buffer zoals beschreven in het tekstprotocol. Elektroporate de RNP complexen in de cellen met behulp van een puls van 1300 volt voor 30 milliseconden. Onmiddellijk na de elektroporatie, plaat de cellen op een 48-put plaat gevuld met 500 microliters van DMEM, aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Houd HEK293 T-cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. De dag voor transfectie, trypsinize en tellen van de cellen.Als u werkt op een schaal van 48 goed, plaat 10.000 cellen per put en 250 microliter van volledig groeimedium. Bereid met behulp van een transfectionreageagens op basis van lipide 250 nanogram P3S Cas9 plasmid en 250 nanogram SGRNA voor transfectie. Meng vervolgens de plasmiden in 25 microliter van serumvrije MEM.Verdun één microliter transfectiereagensage met 25 microliter serumvrije MEM. Broed dit mengsel vijf minuten op kamertemperatuur uit. Combineer het plasmide mengsel met het transfectiereagensmengsel en broed 20 minuten lang in de kamer om plasmide lipofectaminecomplexen te vormen.Voeg hierna 50 microliter van dit mengsel direct toe aan elke put met cellen. Wieg de plaat voorzichtig heen en weer om te mengen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator gedurende 48 tot 72 uur na de transfectie, alvorens te testen op trans-gen expressie.Na het isoleren van de eerder voorbereide genomic DNA, genereren diepe sequencing bibliotheken door PCR versterking van de GDNA met primers gericht op on-target en off-target. Gebruik vervolgens indexprimeren om elk monster te labelen. Gebruik een sequencingmachine van de volgende generatie om de poolbibliotheken aan gekoppelde eindsequencing te onderwerpen.Nadat het Snyper-scherm is uitgevoerd, kan het percentage overlevingskolonies worden berekend door het aantal kolonies op de selectieve LB-plaat te delen door het aantal kolonies op de niet-selectieve LB-plaat. Hoewel dit percentage meestal erg laag is wanneer het wordt uitgevoerd met bibliotheken van SP Cas9, kunnen echte positieve hits worden verrijkt door het scherm te herhalen met de overlevende pool. Een representatief Snyper-scherm laat zien dat een overlevingskans van 100% wordt verkregen na het derde scherm.Transfecties met behulp van RNPs of plasmid gecodeerde Snyper Cas9 kan worden gedaan voor verschillende doelen, en de resulterende on-target en off-target activiteiten gemeten door doelen amplicon sequencing. Bij de meeste doelen, Snyper Cas9 toont hetzelfde niveau van op doelactiviteiten en hogere specificiteit ratio's in vergelijking met het wilde type. Afgekapte SGRNAs's kunnen ook worden gebruikt om de specificiteit verder te verbeteren.Hogere transformatie-efficiëntie in de eerste reinigingsstap is erg belangrijk om de klonen niet met een hoge specificiteit te verliezen. Latere screeningsstappen keren minder transformatie-efficiëntie terug omdat de klonen al zijn verrijkt in de eerste screeningstap, en er is minder kans om ze te verliezen. Er zullen meer dan één kloon zijn die we in het Snyper scherm vonden.On-target en off-target activiteiten van deze klonen moeten worden gekarakteriseerd in zoveel mogelijk verschillende doelen om klonen te selecteren met de beste prestaties. Met deze methode kunnen wetenschappers de specificiteit van de Cas9-achtige enzymen verbeteren zonder verlies van on-target activiteit. Bovendien hebben wetenschappers geen voorkennis nodig over de structuur van het eiwit om verbeteringen aan te brengen.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...