Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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Cette recherche a été financée par des subventions du ministère de la Science et TIC de Corée (2017M3A9B4061406) et la National Research Foundation de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen (MSIT) (subvention numéros 2017M3A9B4061404 et 2018M3A9H3020844) pour Jungjoon K. Lee. Le plasmide codant pGRG36 était un cadeau de Nancy Craig (Addgene plasmide #16666) et p11-LacY-wtx1 était un cadeau de Huimin Zhao.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen a déposé une demande de brevet (PCT/KR2017/006212) couvrant l’écran Sniper (statut : en attente, inventeur : Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung et Euihwan Jeong sont des employés de ToolGen, Inc.

Pour ceux qui veulent éviter de lourdes épreuves de présélection pour obtenir Sniper-Cas9, la protéine Sniper-Cas9 et le plasmide codant sont disponibles. À l’aide de ces matériaux, la longueur optimale de la sgRNA, qui fournit le plus haut ratio de spécificité, doit être déterminée. En outre, livraison de Sniper-Cas9 et sgRNA dans un format de RNP est recommandée car elle se traduit généralement par un ratio plus élevé de spécificité que la prestation sous forme de plasmide. Contrairement à Sniper-Cas9, les autres variantes de Cas9 machinés ne sont pas compatibles avec tronqué sgRNAs6,7 ou livraison au RNP formulaire8 (à l’exception de HiFi-Cas9).
Pour tireur d’élite à l’écran, la sélection de la séquence dépareillée est l’étape la plus importante. Sélection d’un sgRNA ne correspondent pas associé à une activité faible clivage envers la séquence GOI doit être évitée. Si ce n’est pas le cas, Cas9 variantes avec un niveau WT de spécificité ne seront pas cliver l’ADN génomique d’e. coli avec le site cible ne correspondent pas. Cet effet se traduira par un grand nombre de colonies de fond, mettre en péril toute procédure de dépistage.
Parce qu’e. coli a un jeûne doublement de temps et efficacité de transformation élevé par rapport à la levure, tireur d’élite-écran est avantageux par rapport aux méthodes de dépistage basé sur la levure. En outre, tireur d’élite-écran doit être plus sensible que les autres e. coli-issu des systèmes où le site ne correspondent pas a lieu un plasmide : il y a une copie de l’ADN génomique et ainsi qu’une copie du site ne correspondent pas à notre système, mais un grand nombre de plasmides dans une unique cellule d’e. coli .
Les spécificités des autres endonucléases ADN qui induisent la BDB, tels que SaCas9 ou Cpf1s, pourraient également être améliorées à l’aide de tireur d’élite à l’écran. Malheureusement, l’écran Sniper ne peut servir à augmenter la spécificité des éditeurs de base directement, parce que les éditeurs de base n’induisent pas de BDB dans l’ADN génomique d’e. coli. Comme base éditeurs utilisent la version morte Cas9 dans le coeur de leur système ou les nickase, les spécificités des éditeurs de base pourraient être augmentées en utilisant les succès obtenus à partir de tireur d’élite à l’écran.

Dans cet article, notre objectif est d’améliorer la spécificité de Cas9 en combinant différentes stratégies. Diverses méthodes d’éviter les hors-cible des effets de CRISPR-Cas9 ont été développées. Par exemple, sgRNAs tronqué permet d’atteindre plus de spécificité1. En outre, la méthode de livraison Cas9 peut être modifiée d’un format de plasmide dans un format de RNP pour obtenir plus de spécificité2. Résidus d’acides aminés spécifiques de la Cas9 Streptococcus pyogenes protéine (SpCas9) ont été modifiés selon le rationnel conception décrite précédemment3,4,5. Alternativement, les résidus d’acides aminés ont été modifiés de façon aléatoire et les variantes de Cas9 avec la spécificité plus élevée ont été identifiés à l’aide d’une levure6 ou7, e.coli8 système de dépistage.
Cependant, de nombreux groupes ont rapporté que Cas9 variantes conçues à l’aide de la conception à affaiblir les interactions non spécifiques entre Cas9 et le substrat pièce faible activité sur la cible7,8,9, 10 , 11 , 12. nous avons développé un e. coli-système d’évolution dirigée, Sniper-écran, à l’écran au hasard mutagénisé Cas9 variantes. Un e. coli , système de contrôle a des avantages par rapport à un système de levure en raison de l’efficacité de transformation de temps et plus plus vite doublement d’Escherichia coli.
Sélection tant négative que positive, basée sur trois différents plasmides et un gène d’intérêt (GOI) intégré dans le génome d’e. coli , sont utilisés en Sniper-écran. Variantes de Cas9 sont exprimées selon le système de double-promoteur de CMV-PltetO1 d’un plasmide numéro de faibles copies afin que les candidats identifiés chez e. coli peuvent être testés dans des cellules de mammifères sans nécessiter de subcloning. Le gouvernement indonésien est introduit dans le génome de Escherichia coli en utilisant le système de transposon Tn7. Le plasmide sgRNA, qui contient une origine sensibles à la température de réplication, exprime une sgRNA ciblant le GOI; Toutefois, les sgRNA et les séquences GOI parfaitement ne correspondent pas. Un site de cible parfaitement appariées sgRNA existe sur un troisième plasmide contenant le gène de la BCDC , qui encode un produit mortel qui empoisonne la gyrase. Dans ce système, les cellules exprimant Cas9 variantes avec une activité élevée hors cible sont supprimés parce que cassures double-brin (CDB) sont introduits dans le site ne correspondent pas, situé dans l’ADN génomique. En revanche, les cellules exprimant Cas9 variantes avec faible activité sur la cible sont également supprimés à cause de l’expression des gènes létaux BCDC . Le niveau d’expression des variantes Cas9 peut être modifié en changeant la concentration de l’anhydrotétracycline (ATC), qui ajuste la force de la sélection.
Nous avons pensé que la localisation du site de cible ne correspondent pas sgRNA dans l’ADN génomique, plutôt que sur un plasmide augmenterait la sensibilité du système. L’avantage de cette approche est qu’il y a qu’un seul site génomique, alors qu’il y aurait plusieurs plasmides, chacun contenant un site cible, au sein d’une même cellule d’e. coli .
Grâce à ce système, nous avons identifié une variante Cas9, tireur d’élite-Cas9, qui montre les activités au niveau des WT sur la cible et réduit les activités hors-cible par rapport au WT Cas9. Sniper-Cas9 peut atteindre des taux de spécificité encore plus élevé en utilisant sgRNAs tronqué ou prestation RNP plutôt que prestation axée sur le plasmide.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

Le développement de cluster régulièrement dois‑je répétitions courtes palindromiques (CRISPR)-protéine associée 9 (Cas9) dans les modalités thérapeutiques nécessite d’éviter les effets potentiellement préjudiciables hors cible. Plusieurs méthodes ont été élaborées pour réduire ces effets. Nous présentons ici un Escherichia coli-évolution dirigée selon méthode appelée Sniper-écran pour obtenir une variante Cas9 avec spécificité optimisée et conservé l’activité sur la cible, appelée Sniper-Cas9. À l’aide de Sniper-écran, sélection positif et négatif peut être effectuée simultanément. L’écran peut également être répété avec autres séquences d’ARN (sgRNA) single-guide pour enrichir les vrai succès positive. En utilisant le promoteur double CMV-PltetO1 pour exprimer les variantes Cas9, la performance de la bibliothèque de mise en commun peut être rapidement vérifiée dans les cellules de mammifères. On décrit également les méthodes pour augmenter la spécificité du tireur d’élite-Cas9. Tout d’abord, l’utilisation de sgRNAs tronqué antérieurement s’est avérée qu’en augmenter la spécificité Cas9. Contrairement à d’autres Cas9s ingénierie, tireur d’élite-Cas9 conserve un niveau de (WT) de type sauvage de l’activité sur la cible lorsqu’il est combiné avec sgRNAs tronqué. Deuxièmement, l’exécution du tireur d’élite-Cas9 dans un format de ribonucléoprotéines (RNP) non pas un plasmide est possible sans affecter son activité sur la cible.

Après que Sniper-écran est effectuée, le pourcentage des colonies de survie peut être calculé en divisant le nombre de colonies sur le plat de livre contenant du chloramphénicol, kanamycine, arabinose et ATC (CKAA) par le nombre de colonies dans la plaque LB contenant chloramphénicol et kanamycine seulement (CK). Ce pourcentage était généralement très faible lorsque le tireur d’élite à l’écran a été réalisée avec les bibliothèques de SpCas9. Hits de vrai positif peuvent être enrichis en répétant l’écran avec la piscine survivante. Dans cet écran Sniper représentant, par exemple, un taux de survie de 100 % a été obtenu après le troisième écran (Figure 1). Transfections utilisant RNP ou plasmidique codée Sniper-Cas9 peuvent être faites pour différentes cibles et la résultante sur la cible et activités hors cible mesurées par ciblées de séquençage de l’amplicon (Figure 2). Au plus objectifs, tireur d’élite-Cas9 montre le même niveau d’activités sur la cible et des ratios plus élevés de spécificité par rapport à la sgRNAs en poids tronqué permet également d’améliorer encore la spécificité (Figure 3). Toutefois, leur utilisation est limitée à seulement quelques cibles parce qu’elles résultent de faible activité sur la cible par rapport à sgRNAs pleine longueur, dans la plupart des cas. Par conséquent, sgRNAs avec différentes longueurs (de 17 à 20 mers) doivent être testées et activités sur la cible tant hors cible doivent être mesurées pour optimiser la spécificité.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Figure 1 : représentant Sniper-écrans effectué les différentes bibliothèques de variantes aléatoires de Cas9. Mutateur bibliothèque, EP I et bibliothèque EP II indiquer bibliothèques apportées à l’aide de différents kits commerciaux. Premier, deuxième et final indiquent le nombre de fois que l’écran de l’enrichissement était effectué7. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Figure 2 : sur la cible et hors cible activités de WT-Cas9 ou Sniper-Cas9 jumelé avec une séquence de guide 20-mer livrée par plasmide ou RNP. Rapports de spécificité ont été déterminés en divisant l’activité sur la cible de l’activité hors-cible. Barres d’erreur indiquent SEM (n = 3)7. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Figure 3 : sur la cible et les activités de Sniper-Cas9 par rapport au WT-Cas9 obtenues à l’aide de sgRNAs avec des longueurs variables ciblant les sites FANCF01 et AAVS hors cible. Rapports de spécificité ont été déterminés en divisant indel fréquences sur les sites sur la cible par ceux sur les sites respectifs de hors-cible. sgRNAs avec une guanine correspondante à l’extrémité 5' (GX18 ou GX19) et ceux avec une guanine dépareillée (gX17, gX18, gX19 ou gX20) sont indiqués. Rapports de spécificité n’ont été pas calculés lorsque les activités sur la cible normalisées étaient < 70 %7. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Nous présentons ici un protocole pour optimiser CRISPR-Cas9 pour parvenir à une plus grande spécificité sans la perte d’activité sur la cible. Nous utilisons une approche d’évolution dirigée appelée Sniper-écran pour trouver un mutant Cas9 avec les caractéristiques souhaitées. Sniper-Cas9 est compatible avec tronqué ARN simple-guide et livraison dans un format ribonucléoprotéines, célèbres stratégies pour atteindre les spécificités plus élevées.

À l’aide de Sniper-Cas9 pour minimiser les effets hors cible de CRISPR-Cas9 sans la perte d’activité sur la cible Via évolution dirigée

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

Dans la nature, Cas9 est une protéine immunitaire contre les virus envahissants que l’évolution préfère Cas9 avec une spécificité promiscuité qui peut fendre l’ADN viral avec des mutations spontanées. Nous avons construit un système d’évolution artificielle dirigée qui préfère une variante Cas9 optimisée avec une grande spécificité. Les sélections négatives et positives fonctionnent simultanément dans le système de dépistage sniper.Les variantes Cas9 avec une activité hors cible réduite maintenant également l’activité sur cible peuvent être examinées immédiatement. Des mutations ont été introduites sur l’ensemble de la séquence Cas9 au hasard pour produire la bibliothèque à projeter. Et cela a permis de trouver des mutations dans des positions inattendues.À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs du milieu universitaire et de l’industrie utilisent le Cas9 de type Y pour des développements thérapeutiques. Toutefois, la spécificité de Cas9 de type Y n’est pas optimisée, ce qui peut entraîner des enveloppements serrés. Chez l’homme, cela signifie des mutations inattendues dans les gènes aléatoires, ce qui peut conduire à des effets secondaires graves.Il existe de nombreux Cas9 comme des enzymes qui sont en cours de développement dans la thérapeutique. Notre technique peut être utilisée pour améliorer la spécificité d’autres ADN et nucléides comme Jipinger, thaïlande, et Cas9 également tels que CPF1. Faire une bibliothèque assez grande est la clé pour augmenter les possibilités d’obtenir une variante avec une fonction importante.Assurez-vous d’obtenir une efficacité élevée dans l’étape de refroidissement, et d’utiliser des cellules compétentes très efficaces. Pour commencer cette procédure, ajoutez un nanogramme du plasmide CCDB et du plasmide SGRNA avec des inadéquations doubles en cinquante microlitres de cellules BW25141 GOI décongelées. Mélanger délicatement les cellules par pipetage, et les transférer dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie de 0,1 centimètre.Transformez l’E-coli avec les deux plasmides par électroporation. Immédiatement après la fin de l’électroporation, ajouter 250 microlitres de soc moyen. Pipette doucement la solution pour mélanger les cellules et moyen, et transférer le mélange à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Récupérez les cellules transformées et incubez-les à 32 degrés Celsius, avec des secousses douces pendant une heure. Continuez à préparer les cellules de criblage Snyper telles que décrites dans le protocole texte. Lorsqu’ils sont prêts à effectuer le criblage Snyper, transformer les cellules de criblage Snyper avec 100 nanogrammes des plasmides de variante Cas9 préparés de chaque bibliothèque en utilisant le processus d’elctroporation qui a été précédemment décrit.Ensuite, transférez 250 microlitres des cellules dans un tube de microcentrifugeuse frais de 1,5 millilitre. Ajouter 250 picogrammes d’ATC à une concentration finale de 10 nanogrammes par millilitre. Récupérez à la fois les cellules contenant de l’ATC et les cellules exemptes d’ATC en les incubant à 32 degrés Celsius pendant une heure avec de douces secousses.Plaque 25 microlitres des cellules exemptes d’ATC récupérées sur une plaque d’agar LB, contenant du chloramphénicol et de la kanamycine. Ajouter l’ATC à l’ATC récupéré contenant des cellules à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre sur une plaque d’agar LB de 245 millimètres. Plaquez immédiatement les cellules contenant de l’ATC sur une agar LB contenant de la plaque contenant du chloramphénicol, de la kanamycine et de l’arabinose.Incuber toutes les assiettes pendant la nuit à 32 degrés Celsius. Le lendemain, photographiez les assiettes. À l’aide du logiciel CFU ouvert, compter le nombre de colonies viables, en s’assurant que le nombre de colonies sur la plaque non sélective est au moins dix fois plus grand que la diversité de la bibliothèque, pour couvrir toutes les variantes.Tirez les colonies qui ont survécu sur les plaques sélectives des trois bibliothèques. Transférer ces colonies en commun à 250 millilitres de LB moyen, complétées par du chloramphénicol, et incuber pendant la nuit à 42 degrés Celsius. Tout d’abord, chargez le logiciel Cas of finder pour choisir les sites cibles.Sélectionnez le type PAM approprié pour le type spécifique de Cas9 et le génome cible. Remplissez l’onglet séquences de requête. Choisissez le numéro d’inadéquation et cliquez sur le bouton soumettre.Après quelques secondes, les sites cibles et hors cible s’afficheront. En général, choisissez les sites hors cible avec un à trois décalages. Ensuite, commandez les oligos CRRNA et Track RRNA avec des séquences de modèle et amplifiez le modèle tel qu’il est décrit dans le protocole texte.Analyser deux microlitres de l’ADN du modèle amplifié, sur un gel d’agarose de 2%, puis purifier le modèle. Incuber le mélange de réaction pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter 0,5 microlitres de DNAse et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes, puis purifier le SGRNA.Ensuite, traiter 10 microgrammes de l’ARN transcrit in vitro avec 250 unités de phosphatase alcaline intestinale du veau pendant trois heures à 3 degrés Celsius, en présence de 100 unités d’inhibiteur du RNAse, puis purifier le SGRNA traité. Tout d’abord, maintenir les cellules T HEK293 dans le DMEM complété par 10%FBS et 1% antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, mélangez deux microgrammes de type sauvage ou de protéine Snyper Cas9 avec deux microgrammes de SGRNA, et incubez à température ambiante pendant dix minutes pour faire des complexes RNP.Essayez et comptez les cellules, puis lavez-les et préparez-les dans le tampon d’électroporation tel que décrit dans le protocole de texte. Électroporer les complexes RNP dans les cellules à l’aide d’une impulsion de 1300 volts pendant 30 millisecondes. Immédiatement après l’électroporation, plaquez les cellules sur une plaque de 48 puits remplie de 500 microlitres de DMEM, complétée par 10% de FBS et 1% d’antibiotiques.Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Maintenir les cellules T HEK293 dans le DMEM complétées par 10%FBS et 1% antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. La veille de la transfection, trypsiniser et compter les cellules.Si vous travaillez à une échelle de 48 puits, plaquez 10 000 cellules par puits et 250 microlitres de milieu de croissance complet. À l’aide d’un réaccérateur transfection à base de lipides, préparez 250 nanogrammes de plasmide P3S Cas9 et 250 nanogrammes d’ARN SG pour la transfection. Ensuite, mélangez les plasmides dans 25 microlitres de MEM sans sérum.Diluer un microlitre de réaccélétration transfection avec 25 microlitres de MEM sans sérum. Incuber ce mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Mélanger le mélange de plasmides avec le mélange de réaccfection transfection et incuber à la pièce pendant 20 minutes pour former des complexes de lipofectamine plasmide.Après cela, ajouter 50 microlitres de ce mélange directement à chaque puits contenant des cellules. Bercer délicatement la plaque d’avant en arrière pour mélanger. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures après la transfection, avant d’apaiser l’expression transgénique.Après avoir isolé l’ADN génomique précédemment préparé, générer des bibliothèques de séquençage en profondeur par amplification PCR de l’ADN GDNA avec des amorces ciblant la cible et hors cible. Ensuite, utilisez des amorces d’index pour étiqueter chaque échantillon. Utilisez une machine de séquençage de nouvelle génération pour soumettre les bibliothèques de piscine au séquençage final apparié.Une fois l’écran Snyper effectué, le pourcentage de colonies de survie peut être calculé en divisant le nombre de colonies sur la plaque LB sélective par le nombre de colonies sur la plaque LB non sélective. Bien que ce pourcentage soit généralement très faible lorsqu’il est effectué avec les bibliothèques de SP Cas9, de véritables succès positifs peuvent être enrichis en répétant l’écran avec le pool survivant. Un écran Snyper représentatif montre un taux de survie de 100% est obtenu après le troisième écran.Les transfections utilisant des PNR ou des plasmides codés Snyper Cas9 peuvent être effectuées pour diverses cibles, et les activités cibles et hors cible qui en résultent sont mesurées par le séquençage amplicon des cibles. Chez la plupart des cibles, Snyper Cas9 affiche le même niveau d’activités cibles et des ratios de spécificité plus élevés par rapport au type sauvage. Les ARNS tronqués peuvent également être utilisés pour améliorer davantage la spécificité.Une plus grande efficacité de transformation dans la première étape de nettoyage est très importante pour ne pas perdre les clones avec une grande spécificité. Les étapes de dépistage ultérieures reviennent moins d’efficacité de transformation puisque les clones sont déjà enrichis dans la première étape de criblage, et il y a moins de chance de les perdre. Il y aura plus d’un clone que nous avons trouvé dans l’écran Snyper.Les activités cibles et hors cible de ces clones devraient être caractérisées dans autant de cibles différentes que possible pour sélectionner des clones ayant les meilleures performances. Avec cette méthode, les scientifiques peuvent améliorer la spécificité des enzymes cas9-like sans perte d’activité sur la cible. En outre, les scientifiques n’ont pas besoin de connaissances préalables sur la structure de la protéine pour apporter des améliorations.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Recherche

Génétique

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