Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Ministerium für Wissenschaft und IKT-Korea (2017M3A9B4061406) und die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert von der koreanischen Regierung (MSIT) (Zuschuss Zahlen 2017M3A9B4061404 und 2018M3A9H3020844) Jungjoon K. Lee. Das Plasmid pGRG36 Codierung war ein Geschenk von Nancy Craig (Addgene Plasmid #16666) und p11-LacY-wtx1 war ein Geschenk von Huimin Zhao.

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	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen hat eine Patentanmeldung (PCT/KR2017/006212) für Sniper-Bildschirm eingereicht (Status: pending, Erfinder: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung und Euihwan Jeong sind Mitarbeiter von ToolGen, Inc.

Für diejenigen, die umständlich Screening-Verfahren zu Sniper-Cas9 vermeiden wollen, gibt es das Sniper-Cas9 Protein und die Codierung Plasmid. Unter Verwendung dieser Materialien die optimale Länge der SgRNA, das bietet die höchste Spezifität Verhältnis ermittelt werden soll. Lieferung von Sniper-Cas9 und SgRNA in einem RNP-Format wird darüber hinaus empfohlen, da es in der Regel ergibt sich eine höhere Spezifität-Verhältnis als Lieferung in einem Plasmid-Format. Im Gegensatz zu Sniper-Cas9 sind andere technischen Cas9-Varianten nicht kompatibel mit abgeschnittenen SgRNAs6,7 oder Lieferung im RNP Form8 (mit Ausnahme von HiFi-Cas9).
Für Sniper-Bildschirm ist die Auswahl der nicht übereinstimmenden Sequenz der wichtigste Schritt. Auswahl an eine nicht übereinstimmende SgRNA, die mit niedrigen Spaltung Aktivität in Richtung der GOI -Sequenz ist, sollte vermieden werden. Wenn dies nicht der Fall ist, Cas9 Varianten mit einem WT Spezifität werden die E. Coli genomischen DNA mit den nicht übereinstimmenden Zielstandort nicht Spalten. Dieser Effekt führt eine große Anzahl von Hintergrund-Kolonien, gefährden die gesamte screening-Verfahren.
Da E. Coli eine Fast hat Verdoppelung der Zeit und hohe Transformationseffizienz verglichen mit Hefe, Sniper-Bildschirm vorteilhaft Hefe-basierten Screening-Methoden gegenüber. Sniper-Bildschirm sollte sein empfindlicher als andere E. Coli-basierten Systemen, die nicht übereinstimmende Website erfolgt, auf einem Plasmid: gibt es eine Kopie der genomischen DNA und damit nur eine Kopie der nicht übereinstimmenden Site in unserem System, sondern eine große Anzahl von Plasmide innerhalb einer einzigen E. Coli Zelle.
Die Besonderheiten des anderen DNA-Endonucleases, die DSB, z. B. SaCas9 oder Cpf1s, induzieren könnte auch verbessert werden, mithilfe von Sniper-Bildschirm. Leider kann nicht Sniper-Bildschirm direkt, erhöhen die Spezifität des Basis-Editoren verwendet werden, da base Editoren nicht dazu, DSB in der genomischen DNA von E. Coli veranlassen. Als Basis Editoren die Nickase oder tot Cas9 in den Kern ihres Systems verwenden, könnte die Besonderheiten von Basis-Editoren erhöht werden, mit den Hits von Sniper-Bildschirm erhalten.

In diesem Beitrag wollen wir die Besonderheit des Cas9 durch Kombination verschiedener Strategien zu verbessern. Verschiedene Methoden zur Vermeidung der Ziel-Auswirkungen der CRISPR-Cas9 entstanden sind. Z. B. kann abgeschnittene SgRNAs verwendet werden, um höhere Spezifität1zu erreichen. Darüber hinaus kann die Art der Cas9 Lieferung aus einem Plasmid-Format RNP Format zu höheren Spezifität2geändert werden. Spezifischen Aminosäureresten des Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9) Protein nach dem rationalen geändert wurden zuvor beschriebenen Design3,4,5. Alternativ Aminosäurereste in zufälliger Weise verändert wurden und die Cas9-Varianten mit der höchsten Spezifität identifiziert mit einem Hefe-6 oder eine E. Coli7,8 screening-System.
Jedoch haben viele Gruppen berichtet, dass Cas9 Varianten entwickelt, mit dem Design um zu schwächen die unspezifische Interaktion zwischen Cas9 und dem Substrat Ausstellung niedrigen zielgerichtet Aktivitäten7,8,9, 10 , 11 , 12. wir entwickelt ein E. Coli-basiertes gerichtete Evolution System, Sniper-Bildschirm, nach dem Zufallsprinzip mutagenisierter Cas9 Varianten auf den Bildschirm. Ein E. Coli screening-System hat Vorteile gegenüber einem Hefe-System wegen der schneller Verdoppelung Zeit und höhere Transformation Wirkungsgrade von E. Coli.
Sowohl positive als auch negative Auswahl, basierend auf drei verschiedenen Plasmiden und ein Gen des Interesses (GOI) in das E. Coli -Genom integriert werden in Sniper-Bildschirm verwendet. Cas9 Varianten sind unter dem CMV-PltetO1 Dual-Promotor System von einem niedrig-Kopie Nummer Plasmid ausgedrückt, so dass Kandidaten identifiziert in E. Coli in Säugetierzellen ohne subcloning getestet werden können. Die indische Regierung wird in der E. Coli -Genom mit dem Tn7 Transposon-System eingeführt. Das Plasmid SgRNA, das enthält einen temperaturempfindliche Ursprung der Replikation, drückt eine SgRNA Ausrichtung der GOI; Allerdings sind die SgRNA und GOI Sequenzen nicht perfekt aufeinander abgestimmt. Ein perfekt aufeinander abgestimmtes SgRNA Ziel-Site existiert auf einem dritten Plasmid enthält das CcdB -gen, das welches eine tödliche Produkt kodiert, die Gyrase vergiftet. In diesem System werden Zellen mit dem Ausdruck Cas9 Varianten mit Aktivitäten mit hohem Ziel entfernt, weil Doppel-Strangbrüchen (DSB) in die nicht übereinstimmende Standort in der genomischen DNA eingeschleust werden. Auf der anderen Seite werden Zellen mit dem Ausdruck Cas9 Varianten mit niedrigen zielgerichtet Aktivitäten auch wegen tödlichen CcdB Genexpression entfernt. Die Expression der Cas9 Varianten kann geändert werden, durch Veränderung der Konzentration von Anhydrotetracycline (ATC), welches die Auswahl Kraft einstellt.
Wir begründete, dass Ortung der Zielwebsite nicht übereinstimmende SgRNA in der genomischen DNA statt auf einem Plasmid die Empfindlichkeit des Systems erhöhen würde. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es nur eine genomische Site, während gäbe es viele Plasmide, jeweils eine Zielsite innerhalb einer einzigen E. Coli Zelle.
Mit diesem System haben wir eine Cas9 Variante, Sniper-Cas9, zeigt WT-Ebene zielgerichtet Aktivitäten und reduzierte Ziel-Aktivitäten im Vergleich zu WT Cas9 identifiziert. Sniper-Cas9 kann sogar höhere Spezifität Verhältnisse mit abgeschnittenen SgRNAs oder RNP-basierte Lieferung als Plasmid-basierte Lieferung erreichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

Die Entwicklung der gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR)-assoziierten Protein 9 (Cas9) in therapeutischen Modalitäten erfordert die Vermeidung ihrer potenziell schädlichen Wirkungen Ziel. Mehrere Methoden sind entwickelt worden, um solche Effekte zu reduzieren. Hier präsentieren wir eine Escherichia coli-basierte gerichtete Evolution Methode namens Sniper-Bildschirm, um eine Cas9 Variante mit optimierten Spezifität zu erhalten und zielgerichtet Aktivität, genannt Sniper-Cas9 beibehalten. Sniper-Bildschirm verwenden, kann positive und negative Auswahl gleichzeitig durchgeführt werden. Der Bildschirm kann auch mit anderen Single-Guide-(SgRNA) RNA-Sequenzen für die wahre positive Treffer zu bereichern wiederholt werden. Durch die Verwendung der CMV-PltetO1 dual Promoter Cas9 Varianten zum Ausdruck zu bringen, kann die Leistung der gepoolten Bibliothek schnell in Säugetierzellen überprüft werden. Methoden zur Steigerung der Spezifität der Sniper-Cas9 werden ebenfalls beschrieben. Zuerst nachweislich die Verwendung des abgeschnittenen SgRNAs zuvor Cas9 Spezifität zu erhöhen. Im Gegensatz zu anderen technischen Cas9s bewahrt Sniper-Cas9 ein Wildtyp (WT) auf Ziel-Aktivität in Kombination mit abgeschnittenen SgRNAs. Zweitens ist die Lieferung von Sniper-Cas9 in einem Ribonucleoprotein (RNP) Format anstelle von einem Plasmid-Format ohne Auswirkungen auf die Zielaktivität möglich.

Nachdem Sniper-Bildschirm durchgeführt wurde, kann der Anteil der überleben Kolonien berechnet werden, indem die Anzahl der Kolonien auf der LB-Platte mit Chloramphenicol, Kanamycin, Arabinose und ATC (CKAA) durch die Anzahl der Kolonien in der LB-Platte mit Chloramphenicol und Kanamycin nur (CK). Dieser Anteil war in der Regel sehr niedrig, als Sniper-Bildschirm mit den Bibliotheken des SpCas9 durchgeführt wurde. Wahr-Positive Treffer können durch die Wiederholung des Bildschirms mit den Überlebenden Pool angereichert werden. In diesem Vertreter Sniper-Bildschirm erhielt beispielsweise eine Überlebensrate von 100 % nach dem dritten Bildschirm (Abbildung 1). Transfektionen mit RNPs oder Plasmid-kodierte Sniper-Cas9 können für verschiedene Ziele und die daraus resultierende zielgerichtet erfolgen und Ziel-Aktivitäten gemessen durch gezielte Amplikons Sequenzierung (Abbildung 2). Bei den meisten Zielen, Sniper-Cas9 zeigt das gleiche Maß an Aktivitäten zielgerichtet und höhere Spezifität Verhältnisse im Vergleich zu den WT gestauchtes SgRNAs können auch zur Spezifität (Abbildung 3) weiter zu verbessern. Ihr Einsatz ist jedoch beschränkt sich auf nur wenige Ziele, weil sie niedrig auf Ziel-Aktivitäten im Vergleich zu Full-length SgRNAs, in den meisten Fällen führen. Daher SgRNAs mit unterschiedlichen Längen (von 17 - bis 20-Mers) müssen getestet werden und am Ziel und Ziel-Aktivitäten müssen gemessen werden, um die Spezifität zu optimieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Abbildung 1: Vertreter Sniper-Bildschirme mit verschiedenen Bibliotheken von zufälligen Cas9 Varianten durchgeführt. Mutator Bibliothek, EP I und II EP-Bibliothek Bibliotheken gemacht, mit verschiedenen kommerziellen Kits zeigen. Erste, zweite und Finale zeigen, dass die Anzahl der Zeiten, die der Anreicherung Bildschirm war7durchgeführt. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.7geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Abbildung 2: am Ziel und Ziel-Aktivitäten der WT-Cas9 oder Sniper-Cas9 gepaart mit einer 20-Mer Führer Sequenz per Plasmid oder RNP. Spezifität Verhältnisse waren bestimmt, indem die Zielaktivität durch die Ziel-Aktivität. Fehlerbalken zeigen SEM (n = 3)7. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.7geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Abbildung 3: am Ziel und Ziel Aktivitäten der Sniper-Cas9 im Vergleich zum WT-Cas9 unter Verwendung von SgRNAs mit variabler Länge, die an den Standorten FANCF01 und Flugabwehrpanzer. Spezifität Verhältnisse waren bestimmt, indem Indel Frequenzen auf Ziel-Sites durch die an den jeweiligen Standorten Ziel. SgRNAs mit einem übereinstimmenden Guanin am 5' Terminus (GX18 oder GX19) und solche mit einer nicht übereinstimmenden Guanin (gX17, gX18, gX19 oder gX20) werden angezeigt. Spezifität Verhältnisse wurden nicht berechnet, wenn die normalisierten zielgerichtet Aktivitäten waren < 70 %7. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.7geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Optimierung der CRISPR-Cas9 um eine höhere Spezifität verlustfrei auf-Aktivität zu erreichen. Wir verfolgen einen gerichteten Evolution genannt Sniper-Bildschirm, um einen Mutant Cas9 mit den gewünschten Eigenschaften zu finden. Sniper-Cas9 ist kompatibel mit gekürzten Single-Guide RNAs und Lieferung in einem Ribonucleoprotein Format, bekannte Strategien zur Erreichung höherer Besonderheiten.

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In der Natur ist Cas9 ein Immunprotein gegen eindringende Viren, das die Evolution Cas9 mit promiskuitiver Spezifität bevorzugt, die virale DNA mit spontanen Mutationen spalten kann. Wir haben ein künstlich gerichtetes Evolutionssystem gebaut, das eine optimierte Cas9-Variante mit hoher Spezifität bevorzugt. Sowohl negative als auch positive Auswahlen funktionieren gleichzeitig im Sniper Screening System.Cas9-Varianten mit reduzierter Off-Target-Aktivität, die auch die Zielaktivität aufrechterhält, können gleichzeitig überprüft werden. Mutationen wurden auf der gesamten Cas9-Sequenz zufällig eingeführt, um die zu überprüfende Bibliothek zu erstellen. Und dies ermöglichte es, Mutationen in unerwarteten Positionen zu finden.Derzeit verwenden viele Forscher in Wissenschaft und Industrie Y-Typ Cas9 für therapeutische Entwicklungen. Die Spezifität des Y-Typ S Cas9 ist jedoch nicht optimiert, was zu dicht gepackten Details führen kann. Beim Menschen bedeutet dies unerwartete Mutationen in zufälligen Genen, die zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können.Es gibt viele Cas9-ähnliche Enzyme, die in Therapeutika entwickelt werden. Unsere Technik kann verwendet werden, um die Spezifität anderer DNA und Nukleids wie Jipinger, Thailand und Cas9 auch wie CPF1 zu verbessern. Eine Bibliothek groß genug zu machen, ist der Schlüssel, um die Möglichkeiten zu erhöhen, eine Variante mit wichtiger Funktion zu erhalten.Achten Sie darauf, eine hohe Effizienz im Kühlschritt zu erhalten, und verwenden Sie hocheffiziente kompetente Zellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie ein Nanogramm des CCDB-Plasmids und des SGRNA-Plasmids mit doppelter Diskrepanz in fünfzig Mikroliter aufgetauter BW25141 GOI-Zellen hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren und übertragen Sie sie in eine vorgekühlte, 0,1 Zentimeter große Elektroporationsküvette.Transformieren Sie den E-coli mit den beiden Plasmiden durch Elektroporation. Unmittelbar nach Abschluss der Elektroporation 250 Mikroliter SOC-Medium hinzufügen. Pipette die Lösung, um die Zellen und Medium zu mischen, und übertragen Sie die Mischung auf eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.Die transformierten Zellen wiederherstellen und bei 32 Grad Celsius bebrüten, mit sanftem Schütteln für eine Stunde. Fahren Sie mit der Vorbereitung der Snyper-Screening-Zellen fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn Sie bereit sind, DasSnyper-Screening durchzuführen, transformieren Sie die Snyper-Screening-Zellen mit 100 Nanogramm der vorbereiteten Cas9-Variantenplasmide aus jeder Bibliothek mithilfe des zuvor beschriebenen Elctroporationsprozesses.Dann 250 Mikroliter der Zellen in ein frisches 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 250 Piktogramme ATC zu einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Erholen Sie sowohl die ATC-haltigen als auch die ATC-freien Zellen, indem Sie sie bei 32 Grad Celsius für eine Stunde mit sanftem Schütteln inkubieren.Platte 25 Mikroliter der wiedergewonnenen ATC-freien Zellen auf einer LB-Agarplatte, die Chloramphenicol und Kanamycin enthält. Fügen Sie ATC zu dem wiedergewonnenen ATC enthaltenden Zellen zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter auf einer 245 Millimeter LB Agarplatte hinzu. Die ATC-haltigen Zellen sofort auf einen LB-Agar mit Chloramphenicol, Kanamycin und Arabinose aufeiner LB-Agar-Platte.Alle Teller über Nacht bei 32 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag fotografieren Sie die Platten. Mit der offenen CFU-Software zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Kolonien, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Kolonien auf der nicht-selektiven Platte mindestens zehnmal größer ist als die Vielfalt der Bibliothek, um alle Varianten abzudecken.Ziehen Sie die Kolonien, die auf den selektiven Platten aus allen drei Bibliotheken überlebt. Übertragen Sie diese gepoolten Kolonien auf 250 Milliliter LB Medium, ergänzt mit Chloramphenicol, und inkubieren über Nacht bei 42 Grad Celsius. Laden Sie zunächst die Cas OF-Finder-Software, um Zielstandorte auszuwählen.Wählen Sie den PAM-Typ passend für den spezifischen Cas9-Typ und das Zielgenom aus. Füllen Sie die Registerkarte Abfragesequenzen aus. Wählen Sie die Nichtübereinstimmungsnummer aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Absenden.Nach einigen Sekunden werden die On-Target- und Off-Target-Sites angezeigt. Wählen Sie im Allgemeinen die Off-Target-Sites mit einer bis drei Nichtübereinstimmungen aus. Als Nächstes bestellen Sie die CRRNA und die Track RRNA Oligos mit Vorlagensequenzen und verstärken Sie die Vorlage, wie im Textprotokoll beschrieben.Analysieren Sie zwei Mikroliter der verstärkten Schablonen-DNA auf einem 2%Agarose-Gel und reinigen Sie dann die Schablone. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag 0,5 Mikroliter DNAse hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten brüten und dann die SGRNA reinigen.Behandeln Sie dann 10 Mikrogramm der in-vitro transkribierten RNA mit 250 Einheiten kalbenalkalischer Phosphatase für drei Stunden bei 3 Grad Celsius in Gegenwart von 100 Einheiten RNAse-Inhibitor und reinigen Sie dann die behandelte SGRNA. Erstens, halten HEK293 T-Zellen in DMEM ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid. Als nächstes mischen Sie zwei Mikrogramm entweder Wildtyp oder Snyper Cas9 Protein mit zwei Mikrogramm SGRNA, und inkubieren bei Raumtemperatur für zehn Minuten, um RNP-Komplexe zu machen.Versuchen Sie, die Zellen zu verrechnen und zu zählen, waschen Sie sie dann und bereiten Sie sie im Elektroporationspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Elektroporate die RNP-Komplexe in die Zellen mit einem Impuls von 1300 Volt für 30 Millisekunden. Unmittelbar nach der Elektroporation die Zellen auf einer 48-Well-Platte mit 500 Mikroliter DMEM gefüllt, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika.Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Bewahren Sie HEK293 T-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid. Am Tag vor der Transfektion, versuchen und zählen Sie die Zellen.Bei einer Arbeit mit einer 48-Well-Skala, Platte 10 000 Zellen pro Brunnen und 250 Mikroliter des gesamten Wachstumsmediums. Bereiten Sie mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz 250 Nanogramm P3S Cas9-Plasmid und 250 Nanogramm SGRNA für die Transfektion vor. Mischen Sie dann die Plasmide in 25 Mikroliter serumfreies MEM.Verdünnen Sie einen Mikroliter Transfektionsreagenz mit 25 Mikroliter serumfreiem MEM. Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Kombinieren Sie die Plasmidmischung mit der Transfektionsreagenzmischung und brüten Sie im Raum für 20 Minuten, um Plasmid lipofectamin-Komplexe zu bilden.Danach 50 Mikroliter dieser Mischung direkt in jeden Brunnen enthaltende Zellen hinzufügen. Schaukeln Sie die Platte sanft hin und her, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion, bevor Sie die Transgenexpression untersuchen.Nach der Isolierung der zuvor vorbereiteten genomischen DNA, generieren Tiefe Sequenzierung Bibliotheken durch PCR-Verstärkung der GDNA mit Primern auf Ziel und Off-Target. Verwenden Sie dann Indexprimer, um jedes Beispiel zu beschriften. Verwenden Sie einen Sequenzierungscomputer der nächsten Generation, um die Poolbibliotheken einer gekoppelten Endsequenzierung zu unterwerfen.Nachdem der Snyper-Bildschirm durchgeführt wurde, kann der Prozentsatz der Überlebenskolonien berechnet werden, indem die Anzahl der Kolonien auf der selektiven LB-Platte durch die Anzahl der Kolonien auf der nicht-selektiven LB-Platte dividiert wird. Während dieser Prozentsatz in der Regel sehr niedrig ist, wenn er mit Bibliotheken von SP Cas9 durchgeführt wird, können echte positive Treffer durch Die Wiederholung des Bildschirms mit dem überlebenden Pool bereichert werden. Ein repräsentativer Snyper-Bildschirm zeigt eine 100%-Überlebensrate nach dem dritten Bildschirm erhalten.Transfektionen mit RNPs oder Plasmid codierten Snyper Cas9 können für verschiedene Ziele durchgeführt werden, und die resultierenden On-Target- und Off-Target-Aktivitäten, gemessen durch Targets Amplicon-Sequenzierung. Bei den meisten Zielen zeigt Snyper Cas9 das gleiche Niveau der Zielaktivitäten und höhere Spezifitätsverhältnisse im Vergleich zum Wildtyp. Abgeschnittene SGRNAs können auch verwendet werden, um die Spezifität weiter zu verbessern.Eine höhere Transformationseffizienz im ersten Reinigungsschritt ist sehr wichtig, um die Klone nicht mit hoher Spezifität zu verlieren. Spätere Screening-Schritte wiederholen eine geringere Transformationseffizienz, da die Klone bereits im ersten Screening-Schritt angereichert sind und die Wahrscheinlichkeit, sie zu verlieren, geringer ist. Es wird mehr als einen Klon geben, den wir auf dem Snyper-Bildschirm gefunden haben.On-Target- und Off-Target-Aktivitäten dieser Klone sollten in so vielen verschiedenen Zielen wie möglich charakterisiert werden, um Klone mit der besten Leistung auszuwählen. Mit dieser Methode können Wissenschaftler die Spezifität der Cas9-ähnlichen Enzyme verbessern, ohne die On-Target-Aktivität zu verlieren. Darüber hinaus benötigen die Wissenschaftler keine Vorkenntnisse über die Struktur des Proteins, um Verbesserungen vorzunehmen.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Forschung

Genetik

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...