Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של משרד המדע ו- ICT של קוריאה (2017M3A9B4061406) את נבחרת מחקר קרן של קוריאה (NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (מענק מספרים 2017M3A9B4061404 ו- 2018M3A9H3020844) כדי Jungjoon ק' . לי. פלסמיד קידוד pGRG36 הייתה מתנת ננסי קרייג (Addgene פלסמיד #16666) והיה p11-תחרה-wtx1 מתנה מ- Huimin זאו.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen הגיש בקשה לרישום פטנט (PCT/KR2017/006212) מכסה מסך צלפים (מצב: תלוי ועומד, ממציא: לי ק' Jungjoon). Jungjoon ק. לי, לי Joonsun, יונג Minhee ו- Euihwan ג'אונג עובדים של ToolGen, inc.

לאלו שרוצים למנוע הליכי הסינון מסורבלת להשיג צלף-Cas9, החלבון צלף-Cas9 את פלסמיד קידוד זמינים. באמצעות חומרים אלה, האורך האופטימלי של sgRNA, כי מתן היחס הגבוה ביותר ירידה לפרטים, צריך להיות נחוש. בנוסף, משלוח של צלף-Cas9 ו- sgRNA בתבנית RNP מומלץ כי התוצאה היא בדרך כלל על יחס ירידה לפרטים גבוה יותר מאשר משלוח בתבנית פלסמיד. שלא כמו צלף-Cas9, גרסאות אחרות-Cas9 הנדסה אינם תואמים6,sgRNAs קטום7 או משלוח טופס RNP8 (למעט HiFi-Cas9).
עבור מסך צלף, הבחירה של הרצף תואמים הוא הצעד החשוב ביותר. יש להימנע מבחר sgRNA תואמים המשויך מחשוף נמוך פעילות לקראת הרצף גוי . אם לא, Cas9 גרסאות עם רמה WT היחודיות לא קליב ה-DNA גנומי עם אתר היעד תואמים e. coli . אפקט זה יביא מספר גדול של מושבות רקע, מסכנת את כל הקרנות בהליך.
כי החיידק יש מהיר הכפלת זמן ויעילות טרנספורמציה גבוהה לעומת שמרים, צלף מסך יתרון לעומת שיטות סינון שמבוסס שמרים. בנוסף, צלף מסך צריך להיות רגיש יותר מאשר אחרים, e. coli-שבו מתבצע באתר לא תואמת מערכות מבוססות על פלסמיד: יש עותק אחד של ה-DNA גנומי ובכך רק העתקה של האתר לא תואמת במערכת שלנו, אלא מספר גדול של פלסמידים יחיד בתוך תא החיידק .
Specificities של אחרים endonucleases DNA זה לגרום DSBs, כגון SaCas9 או Cpf1s, יכול להיות גם שיפור באמצעות מסך צלף. למרבה הצער, צלף מסך לא ניתן להשתמש כדי להגדיל את ייחודה של העורכים הבסיס ישירות, כי הבסיס עורכים אל תגרום / DSBs ב- DNA גנומי של e. coli. כפי עורכים הבסיס להשתמש nickase או מת גירסת Cas9 הליבה של המערכת שלהם, specificities של עורכים הבסיס יכול להיות מוגברת על-ידי שימוש הלהיטים המתקבל מסך צלף.

בנייר זה, אנו שואפים לשפר את ייחודה של Cas9 על ידי שילוב של אסטרטגיות שונות. פותחו שיטות שונות של הימנעות ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9. לדוגמה, ניתן להשתמש sgRNAs קטום כדי להשיג ירידה לפרטים גבוה1. בנוסף, ניתן לשנות השיטה של Cas9 משלוח של תבנית פלסמיד לתבנית RNP כדי להשיג ירידה לפרטים גבוה יותר2. חומצת אמינו ספציפית שאריות Cas9 הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (SpCas9) חלבון שונו בהתאם הרציונלי עיצוב שתוארה לעיל4,3,5. לחלופין, שאריות חומצה אמינית שונתה באופן אקראי, גרסאות Cas9 עם יחודיות הגבוהה זוהו באמצעות שמרים6 או7, e. coli8 מערכת הסינון.
עם זאת, קבוצות רבות דיווחו כי גרסאות Cas9 הנדסה לאחור באמצעות העיצוב כדי להחליש את האינטראקציה לא ספציפית בין Cas9 את המצע בנספח פעילויות ביעד נמוך7,8,9, 10 , 11 , 12. פיתחנו של e. coli-מבוסס מערכת אבולוציה מכוונת, צלף מסך, למסך משתנים Cas9 mutagenized באופן אקראי. E. coli מערכת הסינון יש יתרונות על פני מערכת שמרים בגלל היעילות זמן והתמרת גבוה יותר מהר ההכפלה של e. coli.
בחירה שליליות וחיוביות, המבוסס על שלושה פלסמידים שונים ועל הגן עניין (גוי) משולב לתוך הגנום e. coli , משמשים מסך צלף. גרסאות Cas9 באים לידי ביטוי תחת מערכת כפולה-יזם CMV-PltetO1 של פלסמיד מספר עותק נמוך כך ניתן לבחון את המועמדים המזוהים ב- e. coli בתאי יונקים ללא צורך subcloning. גוי הוא הציג לתוך הגנום e. coli באמצעות מערכת transposon Tn7. פלסמיד sgRNA, אשר מכיל מקור רגיש לטמפרטורה של שכפול, מבטא את sgRNA של פילוח של גוי; עם זאת, sgRNA ואת גוי רצפים הם לא מתאימים. אתר יעד sgRNA להתאמה מושלמת קיים פלסמיד השלישי המכילים את הגן ccdB , שמקודד מוצר קטלני מרעילה gyrase. במערכת זו, תאים לבטא את Cas9 וריאציות עם פעילויות מחוץ-יעד גבוה מוסרים כי כפול-strand מעברי (DSBs) הם הציגו לתוך האתר לא תואמת ממוקם ב- DNA גנומי. מצד שני, התאים לבטא את Cas9 וריאציות עם פעילויות ביעד נמוך גם מוסרים בגלל התבטאות גנים קטלני ccdB . ניתן לשנות את רמת הביטוי של המשתנים Cas9 על ידי שינוי הריכוז של anhydrotetracycline (ATC), אשר מתאימה את כוח הבחירה.
אנחנו הסיק כי איתור אתר היעד sgRNA תואמים ב- DNA גנומי, ולא על פלסמיד יגביר את הרגישות של המערכת. היתרון של גישה זו הוא שיש אתר גנומית אחד בלבד, ואילו היו פלסמידים רבים, שכל אחד מהם מכיל אתר יעד, בתוך אחת תא החיידק .
באמצעות מערכת זו, זיהינו משתנה Cas9, צלף-Cas9, אשר מציג את פעילויות ביעד WT ברמת צמצמה את המטרה פעילויות בהשוואה WT Cas9. צלף-Cas9 ניתן להשיג יחס ירידה לפרטים גבוהה יותר על-ידי שימוש sgRNAs קטום או מבוסס-RNP משלוח במקום משלוח מבוסס פלסמיד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

ההתפתחות באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR)-חלבון המשויך 9 (Cas9) לתוך שיטות טיפוליות דורש ההתרחקות שלה מהשפעות חופש-יעד פוטנציאלי. מספר שיטות המציאו כדי לצמצם תופעות כאלה. כאן, אנו מציגים של Escherichia coli-שיטה המבוססת על אבולוציה מכוונת נקרא צלף-המסך כדי להשיג גרסה Cas9 עם ירידה לפרטים ממוטבת, נשמר ביעד פעילות, נקרא צלף-Cas9. באמצעות מסך צלף, חיוביות ושליליות הבחירה יכולה להתבצע בו זמנית. המסך יכול לחזור גם עם אחרים רצפי RNA (sgRNA) יחיד-מדריך להעשיר עבור הלהיטים חיובי אמיתי. באמצעות מקדם כפול על CMV-PltetO1 להביע את Cas9 וריאציות, הביצועים של הספרייה במאגר ניתן לבדוק במהירות בתאי יונקים. שיטות להגברת יחודיות של צלף-Cas9 מתוארים גם. ראשית, השימוש sgRNAs קטום שהוצג בעבר כדי להגדיל את Cas9 ירידה לפרטים. בניגוד Cas9s אחרים מהונדסים, צלף-Cas9 שומר על רמה (WT) פראי-סוג של פעילות--יעד בשילוב עם sgRNAs קטום. שנית, המסירה של צלף-Cas9 בתבנית ribonucleoprotein (RNP) במקום בתבנית פלסמיד אפשרי מבלי להשפיע על הפעילות על המטרה שלה.

אחרי מסך צלף מבוצע, האחוז של הישרדות מושבות יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר מושבות בצלחת LB המכיל כלורמפניקול, kanamycin, אראבינוז ו- ATC (CKAA) על ידי מספר מושבות המכיל צלחת ליברות כלורמפניקול, kanamycin בלבד (CK). אחוז זה היה בדרך כלל נמוך מאוד, כאשר מסך צלף בוצעה עם הספריות של SpCas9. True-חיוביות להיטים יכול להעשיר חוזרת למסך עם הבריכה ששרדו. הצלף זה נציג-מסך, לדוגמה, שיעור הישרדות 100% הושג לאחר המסך השלישי (איור 1). Transfections באמצעות RNPs או פלסמיד מקודד צלף-Cas9 יכול להיעשות עבור מטרות שונות, וכתוצאה מכך בהמטרה, פעילויות את המטרה נמדדת ממוקד אמפליקון רצף (איור 2). לכל היותר מטרות, צלף-Cas9 מראה באותה הרמה של פעילויות--יעד, יחסי ירידה לפרטים גבוה יותר בהשוואה ל- sgRNAs WT. Truncated יכול לשמש גם כדי לשפר את ירידה לפרטים (איור 3). אולם, השימוש שלהם הוא מוגבל רק כמה מטרות כי הם תוצאה של פעילויות ביעד נמוך בהשוואה sgRNAs באורך מלא, ברוב המקרים. לכן, sgRNAs באורכים משתנים (מ- 17 - ל 20-מרס) חייב להיבדק, פעילויות ביעד והן את המטרה חייב להימדד למטב ירידה לפרטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> איור 1: נציג צלף-מסכי הופיעה עם ספריות שונות של משתנים אקראיים Cas9. הנתונים ספריה, ספריה EP, ספריית EP השני לציין ספריות שנעשו באמצעות קיטים מסחריים שונים. הראשון, השני והאחרון מציינים מספר פעמים שהמסך העשרה היה תרגיל7. איור זה השתנה לי et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> איור 2: ביעד ויעד חופש פעילות של WT-Cas9 או Cas9-צלף לזווג עם רצף מדריך 20-מר מועברת באמצעות פלסמיד או RNP. ירידה לפרטים יחסי נקבעו על-ידי חלוקת הפעילות על המטרה על ידי הפעילות את המטרה. קווי שגיאה לציין SEM (n = 3)7. איור זה השתנה לי et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> איור 3: על המטרה, פעילויות של צלף-Cas9 לעומת WT-Cas9 תוך שימוש sgRNAs באורכים משתנים מיקוד האתרים FANCF01, AAVS את המטרה. ירידה לפרטים יחסי נקבעו על-ידי חלוקת תדרים ויאסין באתרים-המטרה על ידי אלה באתרים מחוץ-יעד בהתאמה. sgRNAs עם גואנין מתאימים בקצהו 5' (GX18 או GX19) ואלה עם גואנין תואמים (gX17, gX18, gX19 או gX20) מסומנים. ירידה לפרטים יחסי לא חושבו כשהיית הפעילויות ביעד מנורמל < 70%7. איור זה השתנה לי et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למטב את CRISPR-Cas9 כדי להשיג הם ברמת פירוט גבוהה ללא אובדן פעילות--היעד. אנו משתמשים בגישה אבולוציה מכוונת נקרא צלף מסך כדי למצוא. את המוטציה Cas9 עם התכונות הרצויות. צלף-Cas9 היא תואמת RNAs יחיד-מדריך קטום ו משלוח בתבנית ribonucleoprotein, ידועים אסטרטגיות להשגת specificities גבוהה יותר.

באמצעות צלף-Cas9 כדי למזער את ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9 ללא אובדן פעילות--היעד באמצעות אבולוציה מכוונת

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

בטבע, Cas9 הוא חלבון חיסוני מפני וירוסים פולשים שהאבולוציה מעדיפה Cas9 עם ספציפיות מופקרת אשר יכול לחשוף DNA ויראלי עם מוטציות ספונטניות. בנינו מערכת אבולוציה מלאכותית מכוונת המעדיפה גרסה ממוטבת של Cas9 עם ספציפיות גבוהה. בחירות שליליות וחיוביות פועלות בו זמנית במערכת הקרנת הצלפים.גרסאות Cas9 עם פעילות מחוץ ליעד מופחתת גם שמירה על פעילות על היעד ניתן לסנן בבת אחת. מוטציות הוכנסו על רצף Cas9 כולו באופן אקראי כדי לייצר את הספרייה להיות מוקרן. וזה אפשר למצוא מוטציות בתנופים בלתי צפויים.כיום, חוקרים רבים באקדמיה והתעשייה משתמשים Y-סוג Cas9 עבור פיתוחים טיפוליים. עם זאת, הספציפיות של Y-סוג Cas9 אינו ממוטב, אשר יכול לגרום את ארוז היטב. אצל בני אדם, משמעות הדבר היא מוטציות בלתי צפויות בגנים אקראיים, אשר יכול להוביל לתופעות לוואי חמורות.ישנם רבים Cas9 כמו אנזימים אשר מפותחים טיפולית. הטכניקה שלנו יכולה לשמש כדי לשפר את הספציפיות של דנ"א וגרעין אחרים כמו Jipinger, תאילנד, ו Cas9 גם כגון CPF1. הפיכת ספריה לגדולה מספיק היא המפתח להגדלת האפשרויות כדי לקבל משתנה עם פונקציה חשובה.הקפד לקבל יעילות גבוהה בשלב הקירור, ולהשתמש בתאים מוכשרים יעילים ביותר. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף ננוגרם אחד של פלסמיד CCDB והן את פלסמיד SGRNA עם אי התאמות כפולות לחמישים מיקרוליטרים של תאי BW25141 GOI מופשרים. מערבבים בעדינות את התאים על ידי צינורות, ומעבירים אותם לקובט אלקטרופורציה מצוננת מראש, 0.1 ס"מ.הפוך את E-coli עם שתי פלסמידים באמצעות אלקטרופורציה. מיד לאחר השלמת האלקטרופוריה, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של מדיום SOC. בעדינות pipette הפתרון לערבב את התאים ואת המדיום, ולהעביר את התערובת לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.לשחזר את התאים שהשתנו דגירה אותם ב 32 מעלות צלזיוס, עם רעידות עדינות במשך שעה אחת. המשך להכין את תאי הסינון של Snyper כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כאשר מוכן לבצע הקרנת סנייפר, לשנות את תאי ההקרנה סניפר עם 100 ננוגרם של פלסמידים גרסה Cas9 מוכן מכל ספריה באמצעות תהליך elctroporation שתואר בעבר.לאחר מכן, להעביר 250 microliters של התאים לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מיליליטר. הוסף 250 פיקוגרמות של ATC לריכוז סופי של 10 ננוגרם למיליליטר. לשחזר הן את התאים המכילים ATC ואת התאים ללא ATC על ידי דגירה אותם ב 32 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רעידות עדינות.צלחת 25 מיקרוליטרים של התאים המשוחזרים נטולי ATC על צלחת אגר LB, המכיל כלוראמפניקול וקנמיצין. הוסף ATC ATC התאושש המכיל תאים לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר על צלחת אגר 245 מילימטר LB. מיד צלחת התאים המכילים ATC על אגר LB המכיל צלחת המכילה chloramphenicol, kanamycin, ו arabinose.דגירה כל הצלחות לילה ב 32 מעלות צלזיוס. למחרת, צלם את הצלחות. באמצעות תוכנת CFU פתוחה, לספור את מספר המושבות קיימא, לוודא כי מספר המושבות על הלוח הלא סלקטיבי הוא לפחות עשר פעמים גדול יותר מאשר המגוון של הספרייה, כדי לכסות את כל הווריאנטים.משוך את המושבות ששרדו על הלוחות הסלקטיביים מכל שלוש הספריות. העבר מושבות אלה מאגר ל 250 מיליליטר של מדיום LB, בתוספת כלוראמפניקול, ודגירה לילה ב 42 מעלות צלזיוס. ראשית, לטעון את התוכנה Cas OF finder כדי לבחור אתרי יעד.בחר את סוג PAM המתאים לסוג הספציפי של Cas9 ולגנום היעד. מלא את הכרטיסיה רצפי שאילתות. בחר את מספר אי-התאמה ולחץ על לחצן שלח.לאחר מספר שניות, יופיעו האתרים היעד והחוץ-יעד. באופן כללי, בחר את האתרים מחוץ ליעד עם אי התאמות של 1 עד 3. לאחר מכן, סדר את ה- CRRNA ואת אוליגו ה- RRNA למעקב באמצעות רצפי תבניות וה הגבר את התבנית כמפורט בפרוטוקול הטקסט.לנתח שני microliters של ה-DNA תבנית מוגברת, על ג'ל 2%agarose ולאחר מכן לטהר את התבנית. דגירה תערובת התגובה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להוסיף 0.5 microliters של DNAse ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן לטהר את SGRNA.לאחר מכן, לטפל 10 מיקרוגרם של RNA מועתק במבחנה עם 250 יחידות של phosphatase אלקליין מעיים עגל במשך שלוש שעות ב 3 מעלות צלזיוס, בנוכחות 100 יחידות של מעכב RNAse, ולאחר מכן לטהר את SGRNA מטופלים. ראשית, לשמור על תאי HEK293 T ב- DMEM בתוספת 10%FBS ו 1% אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני. לאחר מכן, מערבבים שני מיקרוגרם מסוג פראי או חלבון Snyper Cas9 עם שני מיקרוגרם של SGRNA, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות כדי להפוך את קומפלקסים RNP.טריפסיניזציה וספירה של התאים, ולאחר מכן לשטוף אותם ולהכין אותם במאגר אלקטרופולציה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. אלקטרופוראט קומפלקסים RNP לתוך התאים באמצעות פולס אחד של 1300 וולט עבור 30 אלפיות השניה. מיד לאחר האלקטרופוריה, צלחת התאים על צלחת 48 באר מלא 500 microliters של DMEM, בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לשמור על תאי HEK293 T ב- DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. יום לפני ההמרה, נסה וספיר את התאים.אם עובדים בקנה מידה של 48 בארות, צלחת 10, 000 תאים ל באר ו 250 microliters של מדיום צמיחה מלאה. באמצעות רגנט transfection מבוסס שומנים, להכין 250 ננוגרם של P3S Cas9 פלסמיד ו 250 ננוגרם של SGRNA עבור transfection. לאחר מכן, מערבבים את הפלסמידים ב-25 מיקרוליטרים של MEM ללא סרום.לדלל מיקרוליטר אחד של רגנט transfection עם 25 microliters של MEM ללא סרום. הדגירה תערובת זו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מערבבים את תערובת הפלסמיד עם תערובת רגנט transfection ודגירה בחדר במשך 20 דקות כדי ליצור קומפלקסים ליפופקטמין פלסמיד.לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של תערובת זו ישירות לכל תאים המכילים היטב. בעדינות לנענע את הצלחת קדימה ואחורה כדי לערבב. להחגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 48 עד 72 שעות לאחר transfection, לפני ההתנסות לביטוי טרנס-גנים.לאחר בידוד הדנ"א הגנומי שהוכן בעבר, צור ספריות רצף עמוקות על ידי הגברה PCR של GDNA עם פריימרים מיקוד על היעד מחוץ ליעד. לאחר מכן, השתמש בפרימרים של אינדקס כדי לסמן כל דוגמה. השתמש במחשב רצף מהדור הבא כדי לחשוף את ספריות הבריכה ל רצף קצה משויך.לאחר ביצוע מסך סנייפר, ניתן לחשב את אחוז מושבות ההישרדות על ידי חלוקת מספר המושבות על צלחת LB סלקטיבית על ידי מספר המושבות על צלחת LB לא סלקטיבית. בעוד אחוז זה הוא בדרך כלל נמוך מאוד כאשר מבוצע עם ספריות של SP Cas9, להיטים חיוביים אמיתיים ניתן להעשיר על ידי חזרה על המסך עם הבריכה ששרדה. מסך סנייפר מייצג מציג שיעור הישרדות של 100% המתקבל לאחר המסך השלישי.ניתן לבצע חילוף באמצעות RNPs או פלסמיד מקודד Snyper Cas9 עבור מטרות שונות, ואת הפעילויות המתקבלות על היעד מחוץ ליעד נמדד על ידי מטרות רצף אמפליקון. ברוב היעדים, Snyper Cas9 מראה את אותה רמה של פעילויות יעד ויחסי ספציפיות גבוהים יותר בהשוואה לסוג הפראי. ניתן להשתמש ב- SGRNAs חתוך גם כדי לשפר עוד יותר את הספציפיות.יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בשלב הניקוי הראשון חשוב מאוד לא לאבד את השיבוטים עם ספציפיות גבוהה. צעדי סינון מאוחרים יותר חוזרים על יעילות טרנספורמציה פחותה מאז השיבוטים כבר מועשרים בשלב ההקרנה הראשון, ויש פחות סיכוי לאבד אותם. יהיה יותר משובוט אחד שמצאנו במסך של סנייפר.פעילויות על היעד מחוץ ליעד של שיבוטים אלה צריך להיות מאופיין ביעדים שונים רבים ככל האפשר כדי לבחור שיבוטים עם הביצועים הטובים ביותר. בשיטה זו, מדענים יכולים לשפר את הספציפיות של אנזימים דמויי Cas9 ללא אובדן פעילות על המטרה. בנוסף, מדענים אינם זקוקים לידע מוקדם על מבנה החלבון כדי לבצע שיפורים.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...