Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal Ministero della scienza e ICT di Corea (2017M3A9B4061406) e la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (grant numeri 2017M3A9B4061404 e 2018M3A9H3020844) a Jungjoon K. Lee. Il plasmide codifica pGRG36 era un regalo da Nancy Craig (Addgene plasmide #16666) e p11-LacY-wtx1 era un regalo da Huimin Zhao.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen ha depositato una domanda di brevetto (PCT/KR2017/006212) che copre Sniper-schermo (stato: in sospeso, inventore: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung ed Euihwan Jeong sono dipendenti di ToolGen, Inc.

Per coloro che vogliono evitare procedure di screening ingombrante per ottenere Sniper-Cas9, la proteina di cecchino-Cas9 e il plasmide codifica sono disponibili. Utilizzando questi materiali, la lunghezza ottima del sgRNA, che fornendo il più alto rapporto di specificità, deve essere determinato. Inoltre, consegna di cecchino-Cas9 e sgRNA in un formato di RNP è consigliato perché di solito si traduce in un maggiore rapporto di specificità di consegna sotto forma di plasmide. A differenza di cecchino-Cas9, altre varianti di Cas9 derivati dal non sono compatibili con troncato sgRNAs6,7 o consegna in RNP modulo8 (ad eccezione di HiFi-Cas9).
Per Sniper-schermo, la selezione della sequenza non corrispondente è il passo più importante. Selezione di un sgRNA non corrispondente che è associato con attività di fenditura basso verso la sequenza GOI dovrebbe essere evitato. In caso contrario, Cas9 varianti con un livello WT di specificità non saranno fendere il DNA genomic di Escherichia coli con il sito di destinazione non corrispondenti. Questo effetto si tradurrà in un gran numero di colonie di sfondo, mettendo a repentaglio l'intero processo di vagliatura.
Perché Escherichia coli ha un veloce raddoppiando il tempo e l'efficienza di trasformazione alta rispetto al lievito, Sniper-schermo è vantaggioso rispetto ai metodi di screening basato su lievito. Inoltre, Sniper-schermo dovrebbe essere più sensibile di altri e. coli-sistemi in cui si svolge il sito non corrispondenti basati su un plasmide: c'è una copia del DNA genomic e così solo una copia del sito non corrispondente nel nostro sistema, ma un gran numero di plasmidi all'interno di una singola cellula di Escherichia coli .
La specificità di altri endonucleasi di DNA che inducono DSBs, ad esempio SaCas9 o Cpf1s, potrebbe anche essere migliorata utilizzando Sniper-schermo. Purtroppo, Sniper-schermo non utilizzabile per aumentare la specificità dei redattori base direttamente, perché base redattori non inducono DSBs nel DNA genomico di e. coli. Come editor di base utilizza il nickase o la versione morto di Cas9 nel nucleo del loro sistema, le specificità dei redattori di base potrebbero essere aumentate utilizzando i successi ottenuti da cecchino-schermo.

In questa carta, puntiamo a migliorare la specificità della Cas9 combinando diverse strategie. Sono stati sviluppati diversi metodi per evitare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9. Ad esempio, troncato sgRNAs può essere utilizzato per raggiungere maggiore specificità1. Inoltre, il metodo di consegna Cas9 può essere modificato da un formato di plasmide in un formato di RNP ottenere maggiore specificità2. Specifici residui amminoacidici del Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9) della proteina sono stati modificati secondo il razionale disegno descritto precedentemente3,4,5. In alternativa, residui dell'amminoacido sono stati alterati in modo casuale e le varianti di Cas9 con la più alta specificità sono state identificate utilizzando un lievito6 o un7,di e. coli8 sistema di screening.
Tuttavia, molti gruppi hanno segnalato che Cas9 varianti progettati utilizzando il design a debilitare l'interazione aspecifica tra Cas9 e il substrato espositivo basso on target attività7,8,9, 10 , 11 , 12. abbiamo sviluppato un e. coli-basato sistema evolution diretto, Sniper-schermo, allo schermo in modo casuale mutagenized Cas9 varianti. Un e. coli sistema di screening ha vantaggi rispetto ad un sistema di lievito a causa le efficienze di trasformazione tempo e superiore più veloce raddoppio di e. coli.
Positivi e negativi di selezione, basato su tre diversi plasmidi e un gene di interesse (GOI) integrato nel genoma di e. coli , sono utilizzati in Sniper-schermo. Cas9 varianti sono espressi sotto il sistema dual-promotore CMV-PltetO1 di un plasmide numero basso-copia, affinché i candidati identificati in e. coli possono essere testati in cellule di mammifero senza l'esigenza di subcloning. Il governo indiano è stato introdotto nel genoma di e. coli usando il sistema del trasposone Tn7. Il plasmide sgRNA, che contiene un termosensibile origine di replicazione, esprime un sgRNA targeting GOI; Tuttavia, il sgRNA e GOI sequenze non sono perfettamente abbinati. Esiste un sito di destinazione di sgRNA perfettamente su un terzo plasmide contenente il gene ccdB , che codifica per un prodotto letale che avvelena girasi. In questo sistema, le cellule che esprimono Cas9 varianti con alta attività fuori bersaglio vengono rimossi perché rotture del doppio filo (DSBs) vengono introdotti nel sito non corrispondente situato in DNA genomic. D'altra parte, le cellule che esprimono Cas9 varianti con bassa attività on target vengono rimossi anche a causa di espressione genica letale ccdB . Il livello di espressione delle varianti Cas9 può essere cambiato modificando la concentrazione di anidrotetraciclina (ATC), che regola la forza di selezione.
Abbiamo ragionato che l'individuazione del sito di destinazione non corrispondenti sgRNA nel DNA genomico, piuttosto che su un plasmide aumenterebbe la sensibilità del sistema. Il vantaggio di questo approccio è che c'è un solo sito genomico, considerando che ci sarebbero molti plasmidi, ciascuno contenente un sito di destinazione, all'interno di una singola cellula di Escherichia coli .
Utilizzando questo sistema, abbiamo identificato una variante Cas9, Sniper-Cas9, che Mostra attività sulla destinazione a livello di WT e ridotta attività fuori bersaglio rispetto al WT Cas9. Cecchino-Cas9 può raggiungere ancora più elevati rapporti di specificità utilizzando sgRNAs troncato o basati su RNP consegna anziché basata su plasmide consegna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

Lo sviluppo di cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR)-proteina associata 9 (Cas9) in modalità terapeutiche richiede l'elusione dei suoi effetti potenzialmente deleteri fuori bersaglio. Diversi metodi sono stati ideati per ridurre tali effetti. Qui, presentiamo un Escherichia coli-base diretta evoluzione metodo chiamato Sniper-schermo per ottenere una variante Cas9 con specificità ottimizzato e ha conservato l'attività sul bersaglio, chiamato Sniper-Cas9. Utilizzando il cecchino-schermo, selezione positiva e negativa possa essere eseguita contemporaneamente. Lo schermo può essere ripetuto anche con altre sequenze di RNA (sgRNA) singolo-guida per arricchire per i veri successi positivi. Utilizzando il promotore di CMV-PltetO1 dual per esprimere Cas9 varianti, le prestazioni della libreria pool possono essere controllate rapidamente in cellule di mammifero. Metodi per aumentare la specificità di cecchino-Cas9 inoltre sono descritti. In primo luogo, l'uso di sgRNAs troncato in precedenza ha dimostrato di aumentare la specificità di Cas9. A differenza di altri derivati dal Cas9s, Sniper-Cas9 mantiene un livello di (WT) di selvaggio-tipo di attività il bersaglio quando combinato con sgRNAs troncato. In secondo luogo, la consegna di cecchino-Cas9 in un formato di ribonucleoproteina (RNP) invece di un formato di plasmide è possibile senza intaccare la sua attività sul bersaglio.

Dopo Sniper-schermo viene eseguito, la percentuale delle colonie di sopravvivenza può essere calcolata dividendo il numero di colonie sulla piastra LB contenenti cloramfenicolo, kanamicina, arabinosio e ATC (CKAA) per il numero di colonie nella piastra LB contenente cloramfenicolo e kanamicina solo (CK). Questa percentuale era di solito molto bassa quando Sniper-schermo è stato effettuato con le librerie di SpCas9. True-positivi colpi possono essere arricchiti ripetendo lo schermo con la piscina superstita. In questo rappresentante Sniper-schermo, ad esempio, un tasso di sopravvivenza del 100% è stato ottenuto dopo la terza schermata (Figura 1). Transfezioni utilizzando RNP o plasmide-codificato Sniper-Cas9 possono essere fatto per vari obiettivi e la risultante sulla destinazione e attività fuori bersaglio misurata da mirati amplicone sequenziamento (Figura 2). Al più obiettivi, Sniper-Cas9 Mostra lo stesso livello di attività sul bersaglio e più alti rapporti di specificità rispetto alla sgRNAs WT Truncated utilizzabile anche per migliorare ulteriormente la specificità (Figura 3). Tuttavia, il loro uso è limitato a solo pochi obiettivi perché si traducono in attività a basso on target rispetto al full-length sgRNAs, nella maggior parte dei casi. Pertanto, sgRNAs con lunghezze diverse (da 17 a 20 mers) deve essere testato e attività on target sia fuori bersaglio deve essere misurata per ottimizzare la specificità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Figura 1: rappresentante Sniper-schermi eseguita con diverse librerie di casuale varianti Cas9. Libreria di mutator, EP libreria ho e Biblioteca EP II indicano librerie realizzate con diversi kit commerciali. Primo, secondo e finale è necessario indicare il numero di volte che lo schermo di arricchimento è stato effettuato7. Questa figura è stata modificata da Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Figura 2: On-off obiettivo e attività di WT-Cas9 o Sniper-Cas9 accoppiato con una sequenza di guida 20-mer consegnata tramite plasmide o RNP. Rapporti di specificità sono stati determinati dividendo l'attività il bersaglio dall'attività fuori bersaglio. Barre di errore indicano SEM (n = 3)7. Questa figura è stata modificata da Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Figura 3: il bersaglio e attività di cecchino-Cas9 rispetto al WT-Cas9 ottenuti mediante sgRNAs con lunghezze variabili mira i siti FANCF01 e AAVS fuori bersaglio. Rapporti di specificità sono stati determinati dividendo le frequenze di indel siti sulla destinazione per quelli nei rispettivi siti fuori bersaglio. sgRNAs con una guanina abbinata all'estremità 5' (GX18 o GX19) e quelli con una guanina non corrispondente (gX17, gX18, gX19 o gX20) sono indicati. Rapporti di specificità non sono stati calcolati quando le attività di on target normalizzate erano < 70%7. Questa figura è stata modificata da Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Qui, presentiamo un protocollo per ottimizzare CRISPR-Cas9 per ottenere una maggiore specificità senza la perdita di attività sul bersaglio. Utilizziamo un approccio diretto evoluzione chiamato Sniper-schermo per trovare un mutante Cas9 con le caratteristiche desiderate. Cecchino-Cas9 è compatibile con tronco singolo-guida RNAs e consegna in un formato della ribonucleoproteina, ben note strategie per conseguire maggiore specificità.

Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In natura, Cas9 è una proteina immunitaria contro i virus invasori che l'evoluzione preferisce Cas9 con specificità promiscua che può scindere il DNA virale con mutazioni spontanee. Abbiamo costruito un sistema di evoluzione diretta artificiale che predilige una variante Cas9 ottimizzata ad alta specificità. Sia le selezioni negative che positive funzionano contemporaneamente nel sistema di screening dei cecchini.Le varianti Cas9 con attività off-target ridotta che mantengono anche l'attività di destinazione possono essere schermate contemporaneamente. Mutazioni sono state introdotte su tutta la sequenza Cas9 casualmente per produrre la libreria da schermare. E questo ha permesso di trovare mutazioni in posizioni inaspettate.Attualmente, molti ricercatori del mondo accademico e industriale stanno utilizzando Cas9 di tipo Y per gli sviluppi terapeutici. Tuttavia, la specificità di Cas9 di tipo Y non è ottimizzata, il che può comportare un impacchettato. Nell'uomo, questo significa mutazioni inaspettate in geni casuali, che possono portare a gravi effetti collaterali.Ci sono molti enzimi Simili a Cas9 che vengono sviluppati in terapia. La nostra tecnica può essere utilizzata per migliorare la specificità di altri DNA e nucleidi come Jipinger, Thailandia e Cas9 anche come CPF1. Rendere una libreria abbastanza grande è la chiave per aumentare le possibilità di ottenere una variante con funzione importante.Assicurati di ottenere un'alta efficienza nella fase di raffreddamento e di utilizzare celle competenti altamente efficienti. Per iniziare questa procedura, aggiungere un nanogramma sia del plasmide CCDB che del plasmide SGRNA con doppi disallineamenti in cinquanta microlitri di cellule GOI BW25141 scongelate. Mescolare delicatamente le cellule pipettandole e trasferirle in una cuvetta di elettroporazione pre-refrigerata di 0,1 centimetri.Trasforma l'E-coli con i due plasmidi tramite elettroporazione. Subito dopo il completamento dell'elettroporazione, aggiungere 250 microlitri di mezzo SOC. Pipettare delicatamente la soluzione per mescolare le cellule e il mezzo e trasferire la miscela in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Recuperare le cellule trasformate e incubarle a 32 gradi Celsius, con delicati scuotimenti per un'ora. Continuare a preparare le celle di screening Snyper come indicato nel protocollo di testo. Quando sei pronto per eseguire lo screening Snyper, trasforma le cellule di screening Snyper con 100 nanogrammi dei plasmidi variante Cas9 preparati da ogni libreria utilizzando il processo di elctroporazione precedentemente descritto.Quindi, trasferire 250 microlitri delle cellule in un tubo di microcentrifugo fresco da 1,5 millilitri. Aggiungere 250 picogrammi di ATC a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per millilitro. Recuperare sia le cellule contenenti ATC che le cellule senza ATC incubandole a 32 gradi Celsius per un'ora con delicati scuotimenti.Piastra 25 microlitri delle cellule recuperate senza ATC su una piastra di agar LB, contenente cloramfenicolo e kanamicina. Aggiungere ATC all'ATC recuperato contenente cellule ad una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro su una piastra di agar LB da 245 millimetri. Placcare immediatamente le cellule contenenti ATC su un agar LB contenente lastra contenente cloramfenicolo, kanamicina e arabinosi.Incubare tutte le piastre durante la notte a 32 gradi Celsius. Il giorno dopo, fotografa i piatti. Utilizzando il software CFU aperto, contare il numero di colonie vitali, assicurandosi che il numero di colonie sulla piastra non selettiva sia almeno dieci volte superiore alla diversità della libreria, per coprire tutte le varianti.Tira le colonie sopravvissute sulle placche selettive di tutte e tre le biblioteche. Trasferire queste colonie raggruppate a 250 millilitri di mezzo LB, integrato con cloramfenicolo e incubare durante la notte a 42 gradi Celsius. Innanzitutto, caricare il software di ricerca Cas OF per selezionare i siti di destinazione.Selezionare il tipo PAM appropriato per il tipo specifico di Cas9 e il genoma bersaglio. Compilare la scheda sequenze di query. Scegliere il numero di mancata corrispondenza e fare clic sul pulsante invia.Dopo alcuni secondi, verranno visualizzati i siti di destinazione e fuori destinazione. In generale, scegliere i siti fuori destinazione con uno o tre disallineamenti. Quindi, ordina il CRRNA e gli oligo Track RRNA con sequenze di modelli e amplifica il modello come delineato nel protocollo di testo.Analizzare due microlitri del DNA del modello amplificato, su un gel di agarosio al 2%, quindi purificare il modello. Incubare la miscela di reazione durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere 0,5 microlitri di DNAsi e incubare a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, quindi purificare l'SGRNA.Quindi, trattare 10 microgrammi dell'RNA trascritto in vitro con 250 unità di fosfatasi alcalina intestinale del vitello per tre ore a 3 gradi Celsius, in presenza di 100 unità di inibitore della RNAse, quindi purificare lo SGRNA trattato. In primo luogo, mantenere le cellule HEK293 T in DMEM integrate con 10%FBS e 1% antibiotici a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Successivamente, mescolare due microgrammi di tipo selvatico o proteina Snyper Cas9 con due microgrammi di SGRNA e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti per realizzare complessi RNP.Tripinare e contare le cellule, quindi lavarle e prepararle nel buffer di elettroporazione come delineato nel protocollo di testo. Elettroporate i complessi RNP nelle celle usando un impulso di 1300 volt per 30 millisecondi. Subito dopo l'elettroporazione, placcare le cellule su una piastra da 48 po', riempita con 500 microlitri di DMEM, integrata con 10%FBS e 1%antibiotici.Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Mantenere le cellule HEK293 T in DMEM integrate con 10%FBS e 1%antibiotici a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno prima della trasfezione, tripinare e contare le cellule.Se si lavora su una scala di 48 pozzi, piastra 10.000 celle per pozzo e 250 microlitri di mezzo di crescita completo. Utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica, preparare 250 nanogrammi di plasmide P3S Cas9 e 250 nanogrammi di SGRNA per la trasfezione. Quindi, mescolare i plasmidi in 25 microlitri di MEM senza siero.Diluire un microlitri di reagente di trasfezione con 25 microlitri di MEM senza siero. Incubare questa miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Unire la miscela plasmide con la miscela di reagente di trasfezione e incubare a stanza per 20 minuti per formare complessi lipofectamina plasmide.Successivamente, aggiungere 50 microlitri di questa miscela direttamente a ogni cellule ben contenenti. Scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro per mescolare. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per 48-72 ore dopo la trasfezione, prima di saggiare per l'espressione trans-genica.Dopo aver isolato il DNA genomico precedentemente preparato, genera librerie di sequenziamento profondo mediante amplificazione PCR del GDNA con primer mirati su target e off-target. Quindi, utilizzare i primer indice per etichettare ogni campione. Utilizzare un computer di sequenziamento di nuova generazione per sottosogliare le librerie del pool al sequenziamento finale associato.Dopo che lo schermo di Snyper è stato eseguito, la percentuale di colonie di sopravvivenza può essere calcolata dividendo il numero di colonie sulla piastra LB selettiva per il numero di colonie sulla piastra LB non selettiva. Mentre questa percentuale è di solito molto bassa se eseguita con librerie di SP Cas9, i veri successi positivi possono essere arricchiti ripetendo lo schermo con il pool sopravvissuto. Una schermata rappresentativa di Snyper mostra un tasso di sopravvivenza del 100% ottenuto dopo la terza schermata.Le trasfette che utilizzano RRNPs o Snyper Cas9 codificato plasmide possono essere fatte per vari bersagli e le attività risultanti su bersaglio e fuori bersaglio misurate dal sequenziamento dell'amplicon target. Nella maggior parte degli obiettivi, Snyper Cas9 mostra lo stesso livello di attività target e rapporti di specificità più elevati rispetto al tipo selvaggio. Gli SGRNA troncati possono anche essere utilizzati per migliorare ulteriormente la specificità.Una maggiore efficienza di trasformazione nella prima fase di pulizia è molto importante per non perdere i cloni con alta specificità. Le fasi di screening successive comportano una minore efficienza di trasformazione poiché i cloni sono già arricchiti nella prima fase di screening e ci sono meno possibilità di perderli. Ci sarà più di un clone che abbiamo trovato nello schermo di Snyper.Le attività su bersaglio e fuori bersaglio di questi cloni dovrebbero essere caratterizzate nel maggior numero possibile di obiettivi diversi per selezionare i cloni con le migliori prestazioni. Con questo metodo, gli scienziati possono migliorare la specificità degli enzimi simili a Cas9 senza perdita di attività sul bersaglio. Inoltre, gli scienziati non hanno bisogno di alcuna conoscenza preliminare sulla struttura della proteina per apportare miglioramenti.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Ricerca

Genetica

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