Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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この研究は科学省と韓国の ICT (2017M3A9B4061406) 国立研究財団の韓国 (NRF) Jungjoon K に韓国政府 (MSIT) (許可番号 2017M3A9B4061404 および 2018M3A9H3020844) によって資金を供給からの補助金によって支えられました。李。PGRG36 をエンコード プラスミド ナンシー クレイグ (Addgene プラスミド #16666) からの贈り物、p11 レーシー wtx1 はホイミン趙からの贈り物。

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	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen は特許を出願 (PCT/KR2017/006212) 狙撃画面をカバー (状態: 保留中、発明者: Jungjoon イ ・ ヨンギ)。Jungjoon イ ・ ヨンギ、Joonsun 李、Minhee チョン Euihwan チョン ToolGen、株式会社の従業員であります。

スナイパー Cas9 面倒な審査手続きを避けたい人は、狙撃 Cas9 タンパク質とエンコードのプラスミドがあります。これらの材料の最高の特異性比を提供する決定する必要があります sgRNA の最適な長さを使用してください。さらに、狙撃兵 Cas9 と RNP 形式で sgRNA の配信を通常プラスミド形式での配信よりも高い特異性比を得られるのでお勧め。狙撃兵-Cas9 とは異なり他の設計された Cas9 の亜種は切り捨てられた sgRNAs6,7 RNP フォーム8 (ハイファイ-Cas9) を除いて配信への互換性ではありません。
狙撃画面が一致しないシーケンスの選択は最も重要なステップです。五井シーケンスに対する低胸の谷間アクティビティに関連付けられている不一致 sgRNA の選択は避けるべきであります。されていない場合は、WT レベルの特異性を持つ Cas9 亜種なる不一致ターゲット サイトにエシェリヒア属大腸菌のゲノム DNA を切断していません。この効果は、大規模なスクリーニング プロシージャ全体を危険にさらす背景コロニー数になります。
大腸菌がある速いので倍加時間と酵母、狙撃画面と比較して高い変換効率は有利な方法と比較して酵母ベースのスクリーニング。狙撃画面がより他の大腸菌よりも敏感でなければなりませんまた、-プラスミドに基づいて一致しないサイトが運ばれるシステム: ゲノム DNA のコピー 1 つとこの 1 つだけがある私たちのシステムが多数の不一致のサイトのコピー単一の内のプラスミド大腸菌細胞。
狙撃画面を使用して、SaCas9 または Cpf1s などの偏向を引き起こす他の DNA 酵素の特異性も改善できるでしょう。残念ながら、基本エディターはエシェリヒア属大腸菌のゲノム DNA を誘発しないために、直接、基本編集者の特異性を高めるため狙撃画面が使用できません。Nickase または、システムのコアで死んでいるバージョン Cas9 のベースのエディターを使用して、基本エディターの特異性は狙撃画面から得られたヒットを使用して高めることが。

この論文では異なる戦略を組み合わせることによって Cas9 の特異性を向上を目指します。CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を回避するためのさまざまな方法が開発されています。たとえば、切り捨てられた sgRNAs は、高い特異性1を達成するために使用できます。さらに、高い特異性2を取得する RNP 形式にプラスミド形式からの Cas9 の配信方法を変更できます。化膿連鎖球菌Cas9 の特定のアミノ酸残基 (SpCas9) 蛋白質によると、合理的な変更された設計は前述3,4,5。また、アミノ酸残基は、ランダムな方法で変更されている、最高の特異性を持つ Cas9 亜種は酵母6または大腸菌7,8スクリーニング システムのいずれかを使用して識別されました。
しかし、多くのグループは Cas9 バリアント設計デザインを使用して Cas9 と基板の展示対象の活動量の少ない7,8,9,の非特異的な相互作用を消耗することを報告しています。10,11,12。 我々 は、大腸菌を開発-ベースの狙撃画面、画面のランダムに人為 Cas9 亜種に進化システム。スクリーニング システムエシェリヒア属大腸菌大腸菌の高速化 2 倍時間と高い変換効率のため酵母システム上の利点があります。
3 つの異なるプラスミドと大腸菌ゲノムに興味 (五井) の遺伝子に基づく正および負の選択は、狙撃画面で使用されます。Subcloning を必要とせず哺乳類細胞における大腸菌で特定の候補者をテストできるように、低コピー数プラスミドの CMV PltetO1 デュアル プロモーター システムの下で Cas9 のバリエーションを表現します。五井は Tn7 トランスポゾンを用いた大腸菌のゲノムに導入されます。SgRNA プラスミド複製の温度に敏感な起源を含んだ表現五井; をターゲット、sgRNAただし、sgRNA と五井シーケンスは、完全に一致がないです。完全に一致した sgRNA ターゲット サイトは、ジャイレースの毒致死製品をエンコードccdB遺伝子を含む 3 番目のプラスミドに存在します。このシステムは、二重鎖切断 (Dsb) のゲノム DNA にある不一致のサイトに導入されますのでオフのターゲットの高い活動と Cas9 の亜種を発現する細胞が削除されます。その一方で、対象の活動量の少ない Cas9 亜種を発現する細胞も致死ccdB遺伝子発現のため削除されます。Cas9 亜種の発現レベルは、選択力を調整 anhydrotetracycline (ATC) の濃度を変えることによって変更できます。
我々 はゲノム DNA ではなく、プラスミド、不一致 sgRNA ターゲット サイトを検索システムの感度を高めるだろうと推論しました。このアプローチの利点は 1 つのゲノムのサイトがあることそれぞれ 1 つのターゲット サイトを含む多くのプラスミドがあるに対しエシェリヒア属大腸菌のセル。
このシステムを使用して、Cas9 のバリアント、狙撃兵-Cas9、WT レベル対象のアクティビティが表示されますし、WT Cas9 に比べてオフのターゲット活動の減少がわかりました。スナイパー Cas9 プラスミド ベースの配信ではなく、切り捨てられた sgRNAs または RNP ベースの配布を使用して、さらに高い特異性比を実現できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) の開発-治療戦略に関連付けられている蛋白質 9 (Cas9) その潜在的有害なオフターゲット効果の回避が必要です。このような効果を減らすためにいくつかの方法が考案されています。今回、大腸菌-ベース進化メソッドは最適化された特異性 Cas9 のバリアントを取得する狙撃画面を呼び出され、狙撃兵 Cas9 と呼ばれる対象のアクティビティを保持します。狙撃画面を使用して、正と負の選択を同時に実行することができます。画面は、真の肯定的なヒット曲を豊かにするその他の単一ガイド RNA (sgRNA) のシーケンスを繰り返すことができます。Cas9 のバリエーションを表現する CMV PltetO1 デュアル プロモーターを用いて、哺乳類細胞でプールされたライブラリのパフォーマンスをすばやくチェックできます。スナイパー Cas9 の特異性を高めるための方法について述べる。最初に、切り捨てられた sgRNAs の使用は以前 Cas9 特異性を増加する示されています。その他の設計された Cas9s とは異なりは、狙撃 Cas9 は、ターゲット上の活動切り捨てられた sgRNAs と組み合わせた場合の野生型 (WT) レベルを保持します。第二に、プラスミドの形式ではなくリボ核タンパク質 (RNP) 形式での狙撃兵 Cas9 の配信は、その対象の活動に影響を与えることがなく可能です。

植民地の生存の割合を LB プレートを含むコロニーの数によってクロラムフェニ コール、カナマイシン、アラビノース、および ATC (CKAA) を含む LB プレートのコロニーの数で除して計算できます狙撃画面の実行後クロラムフェニ コール及びカナマイシンのみ (CK)。狙撃画面が SpCas9 のライブラリで実行されたとき、この割合は通常非常に低かった。真正のヒットは、存続のプールが付いているスクリーンを繰り返すことによって濃縮することができます。たとえば、100% 生存率はこの代表の狙撃兵-画面で 3 番目の画面 (図 1) の後得られました。さまざまなターゲットおよび結果のターゲットの結合またはプラスミッドでエンコードされた狙撃兵 Cas9 を使用して transfections を行うことができます、ターゲットを離れて活動によって測定対象私アンプリコン シーケンス (図 2)。ほとんどのターゲット狙撃 Cas9 は対象の活動の同じレベルを重量省略された sgRNAs と比較してより高い特異性比率はさらに特異性 (図 3) を改善するためにも使用できます。しかし、その使用は、彼らはフルレングスの sgRNAs、ほとんどの場合と比較して低対象の活動になるのでのみいくつかのターゲットに制限されます。したがって、さまざまな長さ (から 17 に 20-mers) と sgRNAs をテストする必要があり、特異性を最適化するためにターゲットにターゲットを離れて活動を測定しなければなりません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> 図 1: 代表狙撃画面ランダム Cas9 亜種の異なるライブラリを使用して実行します。ミューテーター図書館、EP ・ EP ライブラリ II 別商業キットを使用して作られたライブラリを示します。最初、2 番目、および最終濃縮スクリーンされた回数実行7を示します。この図は、李ら7から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> 図 2: [ターゲットとターゲットをプラスミッドまたは RNP を介して配信 20 mer ガイド シーケンスと対になって活動 WT Cas9 や狙撃 Cas9 。オフのターゲット アクティビティが対象のアクティビティを分割により特異性比を求めた。誤差範囲を示す SEM (n = 3)7。この図は、李ら7から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> 図 3: ターゲットとターゲットを狙撃 Cas9 WT Cas9 FANCF01 と通気のサイトをターゲット変数長の sgRNAs を使用して得られたと比較しての活動。それぞれのオフのターゲット サイトにそれらのターゲット ・ サイトで塩基周波数で割って特異性比を求めた。sgRNAs (GX18 または GX19) 5' 末端に一致するグアニンと不一致グアニン (gX17、gX18、gX19、または gX20) が示されます。正規化の対象の活動の頃特異性比が計算されない < 707。この図は、李ら7から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

ここでは、ターゲット上の活動の損失することがなくより高い特定性を達成するために CRISPR Cas9 を最適化するためにプロトコルを提案する.狙撃スクリーンと呼ばれる進化のアプローチを使用して、所望の特性を持つ変異体 Cas9 を見つけます。スナイパー Cas9 は切り捨てられた単一ガイド Rna とリボ核蛋白質形式で配信より高い特異性を達成するためのよく知られている戦略と互換性が。

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

自然界では、Cas9は、進化が自発的な突然変異を持つウイルスDNAを切断することができる無差別特異性を持つCas9を好む侵入ウイルスに対する免疫タンパク質です。我々は、高い特異性を有する最適化されたCas9バリアントを好む人工的な指向進化システムを構築した。ネガティブとポジティブの選択は、スナイパースクリーニングシステムで同時に機能します。ターゲット外アクティビティを削減したCas9バリアントもターゲット上のアクティビティを維持し、一度にスクリーニングすることができます。ミューテーションは、スクリーニングされるライブラリを生成するために、Cas9配列全体にランダムに導入されました。そして、これは予期せぬ位置に突然変異を見つけることを可能にしました。現在、アカデミアや産業界の多くの研究者が、治療開発のためにY型Cas9を使用しています。しかし、Y型Cas9の特異性は最適化されておらず、密に詰め込まれる可能性があります。ヒトでは、これはランダムな遺伝子の予期せぬ突然変異を意味し、重篤な副作用につながる可能性があります。治療薬で開発されている酵素のような多くのCas9があります。この技術は、ジピンガー、タイ、Cas9などの他のDNAや核の特異性を向上させるために使用できます。ライブラリを十分な大きさにすることが重要な機能を持つバリアントを取得する可能性を高めるための鍵です。冷却工程で高効率を得て、高効率の有能なセルを使用してください。この手順を開始するには、CCDBプラスミドとSGRNAプラスミドの両方のナノグラムを2重のミスマッチを持つ1つのナノグラムを解凍されたBW25141 GOI細胞の50マイクロリットルに加えます。ピペットで細胞を穏やかに混ぜ、冷やした0.1センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。エレクトロポレーションを介して2つのプラスミドで大腸菌を変換します。エレクトロポレーションが完了した直後に、SOC培地を250マイクロリットル加えます。溶液を穏やかにピペットして細胞と培地を混合し、混合物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移した。形質転換した細胞を回収し、摂氏32度で1時間穏やかな揺れを起分させます。テキストプロトコルで概説されているように、スナイパースクリーニングセルの準備を続けます。スナイパースクリーニングを行う準備ができたら、先に説明したelctroporationプロセスを用いて各ライブラリーから調製されたCas9変異体プラスミドの100ナノグラムでスナイパースクリーニング細胞を変換する。次いで、250マイクロリットルの細胞を新鮮な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移す。1ミリリットル当たり10ナノグラムの最終濃度にATCの250ピコグラムを追加します。ATC含有細胞とATCフリーセルの両方を、穏やかな揺れで摂氏32度で1時間インキュベートして回収します。回収したATCフリー細胞のプレート25マイクロリットルをLB寒天プレート上に、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含有する。245ミリメートルLB寒天プレート上のミリリットルあたり100ナノグラムの最終的な濃度に細胞を含む細胞を含むATCにATCを追加します。すぐにクロラムフェニコール、カナマイシン、およびアラビノースを含むプレートを含むLB寒天にATC含有細胞をプレートします。すべてのプレートを摂氏32度で一晩インキュベートします。翌日、プレートを撮影します。オープンCFUソフトウェアを使用して、生存可能なコロニーの数を数え、非選択的プレート上のコロニーの数がライブラリの多様性よりも少なくとも10倍大きいことを確認し、すべての変異体をカバーする。3つのライブラリすべてから選択的プレートで生き残ったコロニーを引っ張ります。これらのプールされたコロニーを250ミリリットルのLB培地に移し、クロラムフェニコールを補充し、摂氏42度で一晩インキュベートする。まず、Cas OFファインダーソフトウェアをロードしてターゲットサイトを選択します。Cas9の特定のタイプと標的ゲノムに適したPAMタイプを選択します。[クエリシーケンス] タブに入力します。不一致番号を選択し、[送信] ボタンをクリックします。数秒後に、ターゲットサイトとオフターゲットサイトが表示されます。一般的に、1 ~ 3 個の不一致があるオフターゲット サイトを選択します。次に、テンプレートシーケンスでCRRNAとトラックRRNAオリゴを注文し、テキストプロトコルで概説されているようにテンプレートを増幅します。2%アガロースゲルで増幅されたテンプレートDNAの2マイクロリットルを分析し、その後、テンプレートを精製します。反応混合物を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、0.5マイクロリットルのドナーゼを加え、摂氏37度で15~30分間インキュベートし、SGRNAを精製します。次いで、100単位のRNAを3度摂氏3度で3時間、3度の3時間、体外転写RNAの10マイクログラムを摂氏3度で処理し、処理したSGRNAを精製する。まず、10%FBSと1%の抗生物質を5%の二酸化炭素で摂氏37度で補ったDMEMのHEK293 T細胞を維持する。次に、野生型またはスニパーCas9タンパク質の2マイクログラムとSGRNAの2マイクログラムを混合し、RNP複合体を作るために10分間室温でインキュベートします。トリプシン化し、細胞を数え、それらを洗浄し、テキストプロトコルで概説されているようにエレクトロポレーションバッファでそれらを準備します。RNP複合体を1300ボルトの1パルスで30ミリ秒で細胞内に電気ポレートします。エレクトロポレーションの直後に、500マイクロリットルのDMEMを充填した48ウェルプレートに細胞をプレートし、10%FBSと1%の抗生物質を補います。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。10%FBSと1%の抗生物質を5%の二酸化炭素で摂氏37度で補ったDMEMのHEK293 T細胞を維持する。トランスフェクションの前日、トリプシン化し、細胞を数えます。48ウェルスケールで作業する場合、プレート10,000細胞/ウェルおよび完全な成長培地の250マイクロリットル。脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して、トランスフェクション用にP3S Cas9プラスミド250ナノグラムとSGRNA250ナノグラムを調製します。次いで、無血清MEMの25マイクロリットルにプラスミドを混合する。25マイクロリットルの無血清MEMでトランスフェクション試薬を1マイクロリットル希釈します。この混合物を室温で5分間インキュベートする。プラスミド混合物をトランスフェクション試薬混合物と組み合わせ、20分間室内でインキュベートし、プラスミドリポフェクタミン複合体を形成します。この後、細胞を含む各ウェルに直接この混合物の50マイクロリットルを追加します。プレートを前後に軽く揺らし、混ぜます。トランス遺伝子発現をアッスする前に、トランスフェクション後48〜72時間、二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。以前に調製したゲノムDNAを分離した後、標的およびオフターゲットを標的とするプライマーを用いてGDNAのPCR増幅により深いシーケンシングライブラリを生成する。次に、インデックスプライマーを使用して各サンプルにラベルを付けます。次世代シーケンスマシンを使用して、ペアエンドシーケンスをプールライブラリに適用します。スナイパースクリーンが行われた後、生存コロニーの割合は、非選択的LBプレート上のコロニー数で選択的LBプレート上のコロニー数で割ることによって計算することができる。この割合は、通常、SP Cas9のライブラリで実行すると非常に低いですが、実際の正のヒットは、残っているプールで画面を繰り返すことで豊かにすることができます。代表のスナイパー画面は、第3画面の後に100%生存率が得られていると示す。RnPsまたはプラスミドコード化されたスニパーCas9を使用したトランスフェクションは、様々なターゲットに対して行うことができるため、ターゲットアンプリコンシーケンシングによって測定されたオンターゲットおよびオフターゲットの活動が得られる。ほとんどのターゲットでは、Snyper Cas9は、野生のタイプと比較して、ターゲットアクティビティと高い特異度比の同じレベルを示しています。切り捨てられた SGRNA を使用して、特異性をさらに向上させることもできます。第1の洗浄工程における変換効率の向上は、クローンを高い特異性で失わないことが非常に重要である。後のスクリーニングステップは、クローンが最初のスクリーニングステップで既に濃縮されているため、変換効率が低下し、失われる可能性が低くなります。スナイパー画面で見つけたクローンが複数存在します。これらのクローンのオンターゲットおよびオフターゲットのアクティビティは、最高のパフォーマンスでクローンを選択するために、できるだけ多くの異なるターゲットで特徴付けられる必要があります。この方法を用い、科学者は標的活性を失うことなくCas9様酵素の特異性を改善することができる。さらに、科学者は改善を行うためにタンパク質の構造に関する事前の知識を必要としません。

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...