Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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Esta pesquisa foi apoiada por concessões do Ministério da ciência e das TIC da Coreia (2017M3A9B4061406) e o nacional Research Foundation da Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (concessão números 2017M3A9B4061404 e 2018M3A9H3020844) para Jungjoon K. Lee. O plasmídeo codificação pGRG36 foi um presente de Nancy Craig (plasmídeo Addgene #16666) e p11-LacY-wtx1 foi um presente do Huimin Zhao.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen entrou com um pedido de patente (PCT/KR2017/006212) cobrindo Sniper-tela (status: pendente, inventor: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung e Euihwan Jeong são empregados da ToolGen, Inc.

Para aqueles que querem evitar procedimentos de triagem pesado para obter Sniper-Cas9, a proteína do Sniper-Cas9 e o plasmídeo de codificação estão disponíveis. Usando estes materiais, o comprimento ideal do sgRNA, que fornece a maior relação de especificidade, deve ser determinado. Além disso, entrega de Sniper-Cas9 e sgRNA em um formato de RNP é recomendada porque geralmente resulta em uma relação de especificidade maior do que a entrega em um formato de plasmídeo. Ao contrário de Sniper-Cas9, outras variantes Cas9 engenharia não são compatíveis com truncado sgRNAs6,7 ou entrega na RNP formulário8 (com excepção de HiFi-Cas9).
Para Sniper-tela, a seleção da sequência incompatível é o passo mais importante. Seleção de um sgRNA incompatível que está associado com a atividade de decote baixo em direção a sequência GOI deve ser evitada. Se não, Cas9 variantes com um nível WT de especificidade não irão decompor o DNA genômico de Escherichia coli com o site de destino incompatíveis. Este efeito irá resultar em um grande número de colônias de fundo, pondo em risco todo o processo de triagem.
Porque a e. coli tem um rápido dobrar o tempo e a eficiência de transformação de alta em relação ao fermento, Sniper-tela é vantajosa em comparação com métodos de triagem baseada em levedura. Além disso, o Sniper-tela deve ser mais sensível do que outras e. coli-baseado sistemas em que o site não correspondente é carregado em um plasmídeo: há uma cópia do DNA genômico e, portanto, apenas uma cópia do site incompatível no nosso sistema, mas um grande número de plasmídeos dentro de uma única célula de e. coli .
As especificidades de outras endonucleases DNA que induzem DSBs, tais como SaCas9 ou Cpf1s, também poderiam ser melhoradas usando Sniper-tela. Infelizmente, Sniper-tela não pode ser usado para aumentar a especificidade dos editores base diretamente, porque a base editores não induzem DSBs no DNA genômico de e. coli. Como base editores usam o nickase ou morto versão de Cas9 no núcleo do seu sistema, as especificidades dos editores de base poderiam ser aumentadas usando os sucessos obtidos de Sniper-tela.

Neste trabalho, pretendemos melhorar a especificidade das Cas9 combinando diferentes estratégias. Foram desenvolvidos vários métodos de evitar os efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9. Por exemplo, sgRNAs truncado pode ser usado para alcançar maior especificidade1. Além disso, o método de entrega de Cas9 pode ser alterado de um formato de plasmídeo para um formato de RNP para obter maior especificidade2. Resíduos de aminoácidos específicos de Cas9 o Streptococcus pyogenes (SpCas9) proteína foram modificados de acordo com o racional projeto descrito anteriormente3,4,5. Alternativamente, resíduos de aminoácidos foram alterados de forma aleatória e as variantes de Cas9 com a mais alta especificidade foram identificadas usando um fermento6 ou7, e. coli8 sistema de triagem.
No entanto, muitos grupos relataram que as variantes Cas9 projetado usando o projeto para debilitar a interação inespecífica entre Cas9 e o substrato exposição baixo no alvo de actividades7,8,9, 10 , 11 , 12. nós desenvolvemos uma Escherichia coli-sistema baseado em evolução dirigida, Sniper-tela, a tela aleatoriamente mutagenized Cas9 variantes. Uma Escherichia coli sistema de rastreio tem vantagens sobre um sistema de levedura devido a eficiência de transformação de tempo e maior mais rápido, dobrando de e. coli.
Seleção positiva e negativa, com base em três diferentes plasmídeos e um gene de interesse (GOI) integrado no genoma da e. coli , são usadas em Sniper-tela. Cas9 variantes são expressos no âmbito do sistema de dual-promotor CMV-PltetO1 de um plasmídeo número baixo-cópia, para que os candidatos identificados em e. coli podem ser testados em células de mamíferos, sem a necessidade de subcloning. O governo indiano é introduzida no genoma da e. coli usando o sistema de transposon Tn7. O plasmídeo sgRNA, que contém uma origem de replicação do sensível à temperatura, expressa uma sgRNA como alvo o governo indiano; no entanto, o sgRNA e o GOI sequências não são perfeitamente combinadas. Um site de destino perfeitamente sgRNA existe um terceiro plasmídeo contendo o gene que codifica um produto letal que envenena girase ccdB . Neste sistema, as células expressando Cas9 variantes com atividades de alto fora do alvo são removidas porque rupturas da dobro-Costa (DSBs) são introduzidas o site incompatível localizado no DNA genômico. Por outro lado, células expressando Cas9 variantes com baixas no alvo de atividades também são removidas por causa da expressão do gene letal ccdB . O nível de expressão das variantes Cas9 pode ser alterado, alterando a concentração de anhydrotetracycline (ATC), que ajusta a força da seleção.
Nós raciocinou que localizar o site de destino de sgRNA incompatíveis no DNA genômico, em vez de um plasmídeo aumentaria a sensibilidade do sistema. A vantagem dessa abordagem é que há apenas um site de genômico, Considerando que haveria muitos plasmídeos, cada um contendo um site de destino, dentro de uma única célula de e. coli .
Usando este sistema, identificamos uma variante Cas9, Sniper-Cas9, que mostra atividades de WT-nível no alvo e reduziu as atividades fora do alvo em comparação com WT Cas9. Franco-atirador-Cas9 pode atingir proporções de especificidade ainda maiores usando sgRNAs truncado ou entrega baseada na RNP, ao invés de entrega baseada em plasmídeo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

O desenvolvimento do cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR)-proteína associada 9 (Cas9) em modalidades terapêuticas exige a prevenção dos efeitos potencialmente deletérias fora do alvo. Vários métodos foram planejados para reduzir tais efeitos. Aqui, apresentamos uma Escherichia coli-evolução dirigida com base método chamado Sniper-tela para obter uma variante Cas9 com especificidade otimizada e retidos no alvo atividade, chamada Sniper-Cas9. Usando o Sniper-tela, positiva e negativa de seleção pode ser executada simultaneamente. A tela também pode ser repetida com outras sequências de RNA (sgRNA) single-guia para enriquecer para os verdadeiros hits positivos. Usando o promotor de CMV-PltetO1 duplo para expressar Cas9 variantes, o desempenho da biblioteca em pool pode ser rapidamente verificado em células de mamíferos. Também são descritos métodos para aumentar a especificidade do Sniper-Cas9. Primeiro, o uso de sgRNAs truncado anteriormente foi mostrado para aumentar a especificidade Cas9. Ao contrário de outros Cas9s engenharia, Sniper-Cas9 mantém um nível de (WT) do selvagem-tipo de atividade no alvo quando combinado com sgRNAs truncado. Em segundo lugar, a entrega de Sniper-Cas9 em um formato ribonucleoprotein (RNP) em vez de um formato de plasmídeo é possível sem afetar a sua actividade no alvo.

Depois Sniper-tela é executada, a porcentagem de colônias de sobrevivência pode ser calculada dividindo-se o número de colônias na placa LB contendo cloranfenicol, canamicina, arabinose e ATC (CKAA) pelo número de colônias em placa contendo LB cloranfenicol e canamicina apenas (CK). Esta percentagem era geralmente muito baixa quando Sniper-tela foi realizada com as bibliotecas de SpCas9. Sucessos de verdadeiro-positivo podem ser enriquecidos, repetindo a tela com o pool de sobrevivente. Nesta representante Sniper-tela, por exemplo, uma taxa de sobrevivência de 100% foi obtida após a terceira tela (Figura 1). Transfections usando RNPs ou codificado em plasmídeo Sniper-Cas9 podem ser feitos para várias metas e o resultante no alvo e atividades fora do alvo, medidas pelo alvo amplicon sequenciamento (Figura 2). No máximo, alvos, Sniper-Cas9 mostra o mesmo nível de atividades no alvo e mais elevados rácios de especificidade em comparação com o sgRNAs truncado de peso também podem ser usados para melhorar ainda mais a especificidade (Figura 3). No entanto, seu uso é limitado a apenas alguns alvos, porque eles resultam em baixas atividades no alvo, em comparação com o longa-metragem sgRNAs, na maioria dos casos. Portanto, sgRNAs com diferentes comprimentos (de 17 - a 20-mers) deve ser testado e atividades tanto no alvo e o alvo devem ser medidas para otimizar a especificidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Figura 1: representante Sniper-telas realizadas com diferentes bibliotecas de variantes de Cas9 aleatórias. Biblioteca de modificador, biblioteca EP eu e biblioteca EP II indicar bibliotecas feitas usando kits comerciais diferentes. Primeiro, segundo e final indicam o número de vezes que a tela de enriquecimento foi realizada7. Esta figura foi modificada de Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Figura 2: no alvo e o alvo atividades de WT-Cas9 ou Sniper-Cas9 emparelhado com uma sequência de 20-mer guia entregada via plasmídeo ou RNP. Rácios de especificidade foram determinados dividindo-se a atividade no alvo pela atividade fora do alvo. Barras de erro indicam SEM (n = 3)7. Esta figura foi modificada de Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Figura 3: no alvo e fora-alvo atividades de Sniper-Cas9 comparado ao WT-Cas9 obtidos usando sgRNAs com comprimentos variáveis como alvo os sites FANCF01 e AAVS. Rácios de especificidade foram determinados dividindo indel frequências em sites no alvo por aqueles nos respectivos sites fora do alvo. sgRNAs com uma guanina correspondente no 5' terminus (GX18 ou GX19) e aqueles com uma guanina incompatível (gX17, gX18, gX19 ou gX20) são indicados. Rácios de especificidade não foram calculados quando as atividades no alvo normalizadas foram < 70%7. Esta figura foi modificada de Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Aqui, apresentamos um protocolo para otimizar CRISPR-Cas9 para alcançar uma maior especificidade sem perda de atividade no alvo. Usamos uma abordagem de evolução dirigida chamada Sniper-tela para encontrar um mutante Cas9 com as características desejadas. Franco-atirador-Cas9 é compatível com truncado RNAs single-guia e entrega em um formato ribonucleoprotein, conhecidas estratégias para atingir maiores especificidades.

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

Na natureza, Cas9 é uma proteína imune contra vírus invasores que a evolução prefere Cas9 com especificidade promíscua que pode cortar DNA viral com mutações espontâneas. Construímos um sistema de evolução artificial que prefere uma variante Cas9 otimizada com alta especificidade. Ambas as seleções negativas e positivas funcionam simultaneamente no Sistema de Triagem de Atiradores.As variantes Cas9 com atividade off-target reduzida também mantendo a atividade no alvo podem ser examinadas de uma só vez. Mutações foram introduzidas em toda a sequência Cas9 aleatoriamente para produzir a biblioteca a ser rastreada. E isso tornou possível encontrar mutações em posições inesperadas.Atualmente, muitos pesquisadores da academia e da indústria estão usando o Tipo Y Cas9 para desenvolvimentos terapêuticos. No entanto, a especificidade do Cas9 tipo Y não é otimizada, o que pode resultar em off bem embalado. Em humanos, isso significa mutações inesperadas em genes aleatórios, o que pode levar a sérios efeitos colaterais.Existem muitas cas9 como enzimas que estão sendo desenvolvidas na terapêutica. Nossa técnica pode ser usada para melhorar a especificidade de outros DNA e nucleídeos como Jipinger, Tailândia e Cas9 também, como CPF1. Fazer uma biblioteca grande o suficiente é a chave para aumentar as possibilidades de obter uma variante com função importante.Certifique-se de obter uma alta eficiência na etapa de resfriamento, e use células altamente eficientes e competentes. Para iniciar este procedimento, adicione um nanograma do plasmídeo CCDB e do plasmídeo SGRNA com duplos desencontros em cinquenta microliters de células GOI descongeladas. Misture suavemente as células por pipetação, e transfira-as para uma cuvette de eletroporação pré-refrigerada de 0,1 centímetro.Transforme o E-coli com os dois plasmídeos via eletroporação. Imediatamente após a eletroporação ser concluída, adicione 250 microliters de meio SOC. Pipeta suavemente a solução para misturar as células e o meio, e transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Recupere as células transformadas e incuba-as a 32 graus Celsius, com agitação suave por uma hora. Continue preparando as células de triagem Snyper conforme descrito no protocolo de texto. Quando estiver pronto para realizar a triagem de Snyper, transforme as células de triagem Snyper com 100 nanogramas dos plasmídeos preparados da variante Cas9 de cada biblioteca usando o processo de elctroporação que foi descrito anteriormente.Em seguida, transfira 250 microliters das células para um tubo fresco de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 250 picogramas de ATC a uma concentração final de 10 nanogramas por mililitro. Recupere as células que contêm ATC e as atc, incubando-as a 32 graus Celsius durante uma hora com agitação suave.Placa 25 microliters das células livres de ATC recuperadas em uma placa de ágar LB, contendo clorofenicol e kanamycina. Adicione ATC ao ATC recuperado contendo células a uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro em uma placa de ágar de 245 milímetros LB. Emplaque imediatamente as células contendo ATC em um ágar LB contendo placa contendo clorofenicol, kanamicina e arabinose.Incubar todas as placas durante a noite a 32 graus Celsius. No dia seguinte, fotografe as placas. Usando o software de CFU aberto, conte o número de colônias viáveis, certificando-se de que o número de colônias na placa não-seletiva seja pelo menos dez vezes maior do que a diversidade da biblioteca, para cobrir todas as variantes.Puxe as colônias que sobreviveram nas placas seletivas das três bibliotecas. Transfira essas colônias agrupadas para 250 mililitros de meio LB, suplementados com clorofenicol, e incubar durante a noite a 42 graus Celsius. Primeiro, carregue o software cas of finder para escolher sites de destino.Selecione o tipo PAM apropriado para o tipo específico de Cas9 e o genoma alvo. Preencha a guia sequências de consulta. Escolha o número de incompatibilidade e clique no botão enviar.Após alguns segundos, os locais no alvo e fora do alvo aparecerão. Em geral, escolha os locais fora do alvo com um ou três desencontros. Em seguida, solicite o CRRNA e o Track RRNA oligos com sequências de modelo e amplie o modelo conforme descrito no protocolo de texto.Analise dois microliters do DNA do modelo amplificado, em um gel de 2%agarose e, em seguida, purifique o modelo. Incubar a mistura de reação durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 0,5 microliters de DNAse e incubar a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos, e depois purificar o SGRNA.Em seguida, trate 10 microgramas do RNA transcrito in vitro com 250 unidades de fosfatase alcalina intestinal da panturrilha por três horas a 3 graus Celsius, na presença de 100 unidades do inibidor RNAse, e depois purifique o SGRNA tratado. Primeiro, manter as células HEK293 T no DMEM suplementadas com 10% de FBS e 1% antibióticos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, misture dois microgramas de qualquer tipo selvagem ou proteína Snyper Cas9 com dois microgramas de SGRNA, e incubar em temperatura ambiente por dez minutos para fazer complexos RNP.Trypsinize e conte as células, depois lave-as e prepare-as em tampão de eletroporação conforme descrito no protocolo de texto. Eletroporar os complexos RNP nas células usando um pulso de 1300 volts por 30 milissegundos. Imediatamente após a eletroporação, emplaque as células em uma placa de 48 poços preenchida com 500 microliters de DMEM, suplementada com 10% FBS e 1%antibióticos.Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Manter as células HEK293 T no DMEM suplementadas com 10% de FBS e antibióticos de 1% a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Um dia antes da transfecção, tentepsinizar e contar as células.Se trabalhar em uma escala de 48 poços, placa 10.000 células por poço e 250 microliters de meio de crescimento completo. Usando um reagente de transfecção à base de lipídio, prepare 250 nanogramas de plasmídeo P3S Cas9 e 250 nanogramas de SGRNA para transfecção. Em seguida, misture os plasmídeos em 25 microliters de MEM sem soro.Diluir um microliter de reagente de transfecção com 25 microliters de MEM sem soro. Incubar esta mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Combine a mistura plasmida com a mistura de reagente de transfecção e incubar no quarto por 20 minutos para formar complexos lipofectamina plasmídeos.Depois disso, adicione 50 microliters desta mistura diretamente a cada poço contendo células. Balance suavemente a placa para frente e para trás para misturar. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 48 a 72 horas após a transfecção, antes de avaliar a expressão transgênica.Depois de isolar o DNA genômico previamente preparado, gerar bibliotecas de sequenciamento profundo por amplificação PCR do GDNA com primers voltados para o alvo e fora do alvo. Em seguida, use primers de índice para rotular cada amostra. Use uma máquina de sequenciamento de próxima geração para submeter as bibliotecas da piscina a sequenciamento final emparelhado.Após a realização da tela de Snyper, a porcentagem de colônias de sobrevivência pode ser calculada dividindo o número de colônias na placa de LB seletiva pelo número de colônias na placa LB não-seletiva. Embora essa porcentagem seja geralmente muito baixa quando realizada com bibliotecas de SP Cas9, verdadeiros acertos positivos podem ser enriquecidos repetindo a tela com o pool sobrevivente. Uma tela Snyper representativa mostra que uma taxa de sobrevivência de 100% é obtida após a terceira tela.Transfecções usando RNPs ou plasmid codificado Snyper Cas9 podem ser feitas para vários alvos, e as atividades de alvo e fora do alvo resultantes medidas pelo sequenciamento de amplicon alvos. Na maioria dos alvos, O Snyper Cas9 mostra o mesmo nível de atividades-alvo e maiores razões de especificidade em comparação com o tipo selvagem. SGRNAs truncadas também podem ser usados para melhorar ainda mais a especificidade.Maior eficiência de transformação na primeira etapa de limpeza é muito importante não perder os clones com alta especificidade. As etapas de triagem posteriores repetem menos eficiência de transformação, uma vez que os clones já são enriquecidos na primeira etapa de triagem, e há menos chance de perdê-los. Haverá mais de um clone que encontramos na tela do Snyper.As atividades on-target e fora do alvo desses clones devem ser caracterizadas em tantos alvos diferentes quanto possível para selecionar clones com o melhor desempenho. Com este método, os cientistas podem melhorar a especificidade das enzimas semelhantes a Cas9 sem perda de atividade no alvo. Além disso, os cientistas não precisam de nenhum conhecimento prévio sobre a estrutura da proteína para fazer melhorias.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genética

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Edição de genoma mediado por CRISPR-Cas9 no Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...