Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантов от министерства науки и ИКТ Кореи (2017M3A9B4061406) и национального исследования фонд из Кореи (NRF) финансируется корейским правительством (MSIT) (Грант номера 2017M3A9B4061404 и 2018M3A9H3020844) для Jungjoon K. Ли. Плазмиды, кодирование pGRG36 был подарок от Нэнси Крейг (Addgene плазмиды #16666) и p11-Лейси wtx1 был подарок от Хуэйминь Чжао.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen подал заявку на патент (PCT/KR2017/006212) охватывающих снайпер экран (статус: ожидание, изобретатель: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Юнг и Euihwan Jeong являются компании ToolGen, Inc.

Для тех, кто хочет избежать громоздких скрининг процедуры для получения снайпер-Cas9 снайпер-Cas9 белка и кодирования плазмида доступны. Используя эти материалы, оптимальная длина sgRNA, что высокий коэффициент специфичности, должны быть определены. Кроме того доставка снайпер-Cas9 и sgRNA в формате RNP рекомендуется, потому что это обычно приводит к более высоким соотношением специфика чем доставки в формате плазмиды. В отличие от снайпер-Cas9 другие инженерии Cas9 варианты не совместимы с усеченной sgRNAs6,7 или доставки в RNP формы8 (за исключением HiFi-Cas9).
Для снайпера экрана выбор несоответствующих последовательности является наиболее важным шагом. Следует избегать выбор несоответствующих sgRNA, который связан с низким декольте активности к последовательности ГОИ . Если нет, то Cas9 варианты с уровнем WT специфики будет не прилепится геномной ДНК кишечной палочки с несовпадающими целевого сайта. Этот эффект приведет к большое количество колоний фон, ставя под угрозу весь досмотра.
Потому что E. coli имеет быстрый удвоение время и высокое преобразование эффективности по сравнению с дрожжей, Снайпер экран является выгодным по сравнению с методов отбора на основе дрожжей. Кроме того, Снайпер экран должен быть более чувствительны, чем другие E. coli-систем, в которых осуществляется несоответствие сайт на основе плазмида: существует одна копия геномной ДНК и, таким образом, только один копию несоответствие сайта в нашей системе, но большое количество плазмид в одной ячейке E. coli .
Особенности других эндонуклеазами ДНК, которые индуцируют DSBs, например SaCas9 или Cpf1s, также может быть улучшено с помощью снайпера экрана. К сожалению снайпер экран не может использоваться для увеличения специфичности базового редакторов напрямую, потому что базовый редакторы не вызвать DSBs в геномной ДНК кишечнойпалочки. Как базовый редакторы используют nickase или мертвых версии Cas9 в ядро их системы, особенности базового редакторов можно увеличить с помощью ответы, полученные от снайпер экрана.

В этой статье мы стремимся улучшить специфику Cas9, объединяя различные стратегии. Были разработаны различные методы избежания последствий пробить ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Например усеченной sgRNAs может использоваться для достижения более высокой специфичности1. Кроме того метод доставки Cas9 можно изменить из формата плазмида RNP формат, чтобы получить выше специфика2. Определенных аминокислотных остатков Streptococcus pyogenes Cas9 белка (SpCas9) были изменены согласно рациональной дизайн описанные ранее3,4,5. Кроме того случайным образом были изменены аминокислотных остатков и Cas9 варианты с высокой точностью были определены с использованием дрожжей6 или7, E. coli8 скрининг системы.
Однако многие группы сообщили, что Cas9 варианты инженерии с использованием дизайн для истощают неспецифического взаимодействия между Cas9 и субстрат экспонат низкого на цели деятельности7,8,9, 10 , 11 , 12. Мы разработали E. coli-системы на базе направленной эволюции, Снайпер экран, экран случайно mutagenized Cas9 варианты. E. coli скрининг системы имеет преимущества над дрожжей системы из-за быстрее удвоение времени и выше преобразования эффективность E. coli.
Негативные и позитивные выбор, основанный на трех различных плазмидов и ген интереса (ГОИ) интегрированы в геном кишечной палочки используются в снайпер экране. Cas9 варианты выражаются в системе двойного промоутер ЦМВ-PltetO1 номер плазмида низким копия так что кандидатов, выявленных в E. coli может быть проверена в mammalian клетках без необходимости subcloning. ГОЙ вводится в геном кишечной палочки , с помощью системы transposon Tn7. Плазмида sgRNA, который содержит чувствительных к температуре происхождения репликации, выражает sgRNA ориентации ГОИ; Однако sgRNA и ГОИ последовательности не совпадают прекрасно. Идеально соответствует sgRNA целевой сайт существует на третьем плазмида, содержащие ccdB ген, который кодирует смертоносного продукта, который отравляет гиразы. В этой системе удаляются клетки, выражая Cas9 варианты с высокой-целевого мероприятия, поскольку двухнитевые разрывы (DSBs) вводятся в несоответствующие сайт, расположенный в геномной ДНК. С другой стороны клетки, выражая Cas9 варианты с низким на целевые мероприятия также удаляются из-за смертельной ccdB экспрессии генов. Уровень экспрессии Cas9 вариантов можно изменить путем изменения концентрации anhydrotetracycline (УВД), которая регулирует силу отбора.
Мы полагали, что поиск несоответствующих sgRNA целевой сайт в геномной ДНК, а не на плазмида повысит чувствительность системы. Преимуществом этого подхода является что существует только один геномной сайт, тогда как бы много плазмид, каждый из которых содержит целевого сайта, в одной ячейке E. coli .
Используя эту систему, мы определили Cas9 вариант, Снайпер-Cas9, который показывает WT-уровня на цели деятельности и сокращение-целевого мероприятия, по сравнению с WT Cas9. Снайпер-Cas9 можно добиться даже выше специфика соотношения с помощью усеченная sgRNAs или доставки на основе RNP вместо доставки на основе плазмид.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

Разработка кластерного регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-связанные белком 9 (Cas9) в терапевтических процедур требует избежания его потенциально вредное воздействие пробить. Несколько методов были разработаны для сокращения таких последствий. Здесь мы представляем Escherichia coli-на основе направленной эволюции метод называется Снайпер экран для получения Cas9 вариант с оптимизированной специфичность и сохранен на цели деятельности, называется Снайпер-Cas9. С помощью снайпера экрана, позитивные и негативные выбора могут выполняться одновременно. Экран также может быть повторен с других последовательностей РНК (sgRNA) одно руководство обогатить истинный положительный хитов. С помощью двойной промоутер ЦМВ-PltetO1 выразить Cas9 варианты, производительности пула библиотеки может быть быстро проверена в mammalian клетках. Описаны также методы для увеличения специфичности снайпер-Cas9. Во-первых использование усеченная sgRNAs ранее было показано для увеличения Cas9 специфичности. В отличие от других инженерных Cas9s снайпер-Cas9 сохраняет одичал тип (WT) уровня активности на цель при сочетании с усеченной sgRNAs. Во-вторых не влияя на цели деятельности, возможна доставка снайпер-Cas9 в формате рибонуклеопротеида (RNP) вместо формата плазмиды.

После того, как выполняется снайпер экран, процент выживания колонии может быть рассчитана путем деления количества колоний на пластину LB, содержащие хлорамфеникол, канамицин, арабинозы и ATC (CKAA) на количество колоний в содержащих LB пластины Хлорамфеникол и канамицин только (CK). Этот процент был обычно очень низкий, когда снайпер экрана была выполнена с библиотеками SpCas9. True позитивных хитов можно обогатить, повторяя на экран с сохранившихся бассейн. В этот представитель снайпер экран например, 100% выживаемости был получен после третьего экрана (рис. 1). Transfections с помощью RNPs или плазмиды кодировке снайпер-Cas9 может быть сделано для различных целей и полученный на целевой и пробить деятельности измеряется целевых ампликон последовательности (рис. 2). В большинстве задач, Снайпер-Cas9 показывает тот же уровень на цель деятельности и выше специфика соотношения, по сравнению с не менее усеченный sgRNAs также может использоваться для дальнейшего повышения специфичности (рис. 3). Однако их использование ограничивается лишь несколько целей потому, что они приводят к низкой на цели деятельности по сравнению с полнометражные sgRNAs, в большинстве случаев. Поэтому sgRNAs с различной длины (от 17 - до 20-РВК) должен быть испытан и на цель и пробить деятельности должна быть измерена оптимизировать специфичности.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Рисунок 1: представитель снайпер экраны выполняются с различными библиотеками случайных вариантов Cas9. Мутатор Библиотека, EP я и EP библиотека II указывают библиотек с использованием различных коммерческих комплектов. Первый, второй и заключительный указывают количество раз на экране обогащение было выполнено7. Эта цифра была изменена от Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Рисунок 2: на цель и пробить деятельности WT-Cas9 или снайпер-Cas9 в паре с 20-mer руководство последовательности через плазмиды или RNP. Специфика соотношения были определены путем деления на цели действия пробить. Планки погрешностей указывают SEM (n = 3)7. Эта цифра была изменена от Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Рисунок 3: на цель и деятельность снайпер-Cas9 по сравнению с WT-Cas9, полученных с помощью sgRNAs с переменной длиной, ориентация на FANCF01 и AAVS сайты-целевого. Специфика соотношения были определены путем деления на соответствующих участках пробить indel частоты на целевые сайты. указаны sgRNAs с соответствием гуанина в отеле terminus 5' (GX18 или GX19) и те, с несоответствием гуанин (gX17, gX18, gX19 или gX20). Специфика соотношения не были рассчитаны при нормализованные целевые мероприятия были < 70%7. Эта цифра была изменена от Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Здесь мы представляем протокол для оптимизации ТРИФОСФАТЫ-Cas9 для достижения более высокой специфичности без потери на цель деятельности. Мы используем подход направленной эволюции называется Снайпер экран чтобы найти мутант Cas9 с желаемыми характеристиками. Снайпер-Cas9 совместим с усеченным сингл руководство РНК и доставки в формате рибонуклеопротеида известных стратегий для достижения выше особенностей.

С помощью снайпера Cas9 для сведения к минимуму последствий пробить ТРИФОСФАТЫ Cas9 без потери на цель деятельности через направленной эволюции

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

В природе, Cas9 является иммунным белком против вторжения вирусов, что эволюция предпочитает Cas9 с беспорядочной специфичностью, которая может расщеплять вирусную ДНК с спонтанными мутациями. Мы построили искусственную систему направленной эволюции, которая предпочитает оптимизированный вариант Cas9 с высокой специфичностью. И отрицательный, и положительный отбор работают одновременно в снайперской системе скрининга.Варианты Cas9 с пониженной внецелейной активностью, также поддерживая целевую активность, могут быть проверены сразу. Мутации были введены в целом Cas9 последовательности случайным образом для производства библиотеки для проверки. И это сделало возможным поиск мутаций в неожиданных положениях.В настоящее время многие исследователи в научных кругах и промышленности используют Y-тип Cas9 для терапевтических разработок. Тем не менее, специфика Y-типа Cas9 не оптимизирована, что может привести к плотно упакованы. У человека это означает неожиданные мутации в случайных генах, которые могут привести к серьезным побочным эффектам.Есть много Cas9, как ферменты, которые разрабатываются в терапии. Наша техника может быть использована для улучшения специфичности других ДНК и нуклеидов, таких как Jipinger, Таиланд, и Cas9 также таких как CPF1. Создание библиотеки достаточно большой является ключом к увеличению возможностей, чтобы получить вариант с важной функцией.Будьте уверены, чтобы получить высокую эффективность в этапе охлаждения, и использовать высокоэффективные компетентные клетки. Чтобы начать эту процедуру, добавьте одну нанограмму плазмиды CCDB и плазмиды SGRNA с двойным несоответствием в пятьдесят микролитров оттаяхих клеток BW25141 GOI. Аккуратно смешайте клетки с помощью пипетки и перенесите их в предварительно охлажденный, 0,1-сантиметровый кювет электропорации.Преобразуй E-coli с двумя плазмидами с помощью электропорации. Сразу после завершения электропорации добавьте 250 микролитров среды SOC. Аккуратно пипетка раствор смешать клетки и средний, и передать смесь в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.Восстановить преобразованные клетки и инкубировать их при 32 градусах по Цельсию, с нежной тряски в течение одного часа. Продолжить подготовку Snyper скрининговых клеток, как указано в текстовом протоколе. Когда готовы выполнить Snyper скрининга, трансформировать Snyper скрининговых клеток с 100 нанограмм подготовленных Cas9 вариант плазмидов из каждой библиотеки с помощью процесса elctroporation, который был ранее описан.Затем перенесите 250 микролитров клеток в свежую микроцентрифугную трубку на 1,5 миллилитров. Добавьте 250 пикограмм УВД к окончательной концентрации 10 нанограмм на миллилитр. Восстановить как УВД-содержащих и УВД свободных клеток, инкубируя их при 32 градусов по Цельсию в течение одного часа с нежной тряски.Плита 25 микролитров восстановленных клеток без УВД на пластине Агара LB, содержащей хлорамфеникол и канамицин. Добавьте УВД в восстановленный УВД, содержащий клетки, до конечной концентрации 100 нанограмм на миллилитр на 245-миллиметровой агарной пластине LB. Немедленно пластины УВД-содержащих клеток на LB агар, содержащий пластины, содержащие хлорамфеникол, канамицин, и арабинозы.Инкубировать все пластины на ночь при 32 градусах по Цельсию. На следующий день сфотографируй тарелки. Используя открытое программное обеспечение CFU, подсчитайте количество жизнеспособных колоний, убедившись, что количество колоний на не селективной пластине, по крайней мере, в десять раз больше, чем разнообразие библиотеки, чтобы охватить все варианты.Потяните колонии, которые сохранились на селективных пластин из всех трех библиотек. Перенесите эти слитки в 250 миллилитров ЛБ среды, дополненные хлорамфениколом, и инкубировать на ночь при 42 градусах по Цельсию. Во-первых, загрузите программное обеспечение Cas OF finder, чтобы выбрать целевые сайты.Выберите тип PAM, подходящий для конкретного типа Cas9 и генома цели. Заполните вкладку последовательностей запросов. Выберите номер несоответствия и нажмите кнопку отправки.Через несколько секунд появятся целевые и нецелеумые сайты. Как правило, выбирайте нецелесопоставимые сайты с одним-тремя несоответствиями. Далее закажите CRRNA и Track RRNA oligos с последовательностями шаблонов и усильйте шаблон, изложенный в текстовом протоколе.Проанализируйте два микролитера ДНК усиленного шаблона на 2%agarose гель, а затем очистить шаблон. Инкубировать реакционной смеси на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день добавьте 0,5 микролитров ДНК и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15-30 минут, а затем очистить SGRNA.Затем обработаем 10 микрограммов транскрибированной РНК в пробирке с 250 единицами щелочной фосфатазы кишечника в течение трех часов при 3 градусах по Цельсию, при наличии 100 единиц ингибитора РНКС, а затем очистим обработанную SGRNA. Во-первых, поддерживать HEK293 Т-клеток в DMEM дополняется 10%FBS и 1%антибиотиков при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Затем смешайте два микрограмма либо дикого типа, либо белка Snyper Cas9 с двумя микрограммами SGRNA и инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут, чтобы сделать комплексы RNP.Трипсинизировать и считать клетки, а затем мыть их и подготовить их в буфер электропорации, как указано в текстовом протоколе. Электропорат RNP комплексы в клетки, используя один импульс 1300 вольт в течение 30 миллисекунд. Сразу после электропорации пластина клеток на 48-хорошо пластины заполнены 500 микролитров DMEM, дополняется 10%FBS и 1%антибиотиков.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Поддерживайте Т-клетки HEK293 в DMEM, дополненные 10%FBS и 1%антибиотиками при 37 градусах Цельсия с 5%carbon dioxide. За день до трансфекции, трипсинизировать и считать клетки.При работе в масштабе 48-колодец, пластина 10 000 клеток на колодец и 250 микролитров полной среды роста. Используя липидный трансфектонный реагент, приготовьте 250 нанограммов плазмиды P3S Cas9 и 250 нанограммов SGRNA для трансфекции. Затем смешайте плазмиды в 25 микролитров без сыворотки MEM.Разбавить один микролитер трансфектного реагента 25 микролитров без сыворотки MEM. Инкубировать эту смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Комбинат плазмидной смеси с смесью трансфекции реагентов и инкубировать в помещении в течение 20 минут, чтобы сформировать плазмидные комплексы липофектамина.После этого добавьте 50 микролитров этой смеси непосредственно к каждой хорошо содержащей клетки. Аккуратно рок пластины вперед и назад, чтобы смешать. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода в течение 48 до 72 часов после трансфекции, прежде чем дать анализ на трансгенную экспрессию.Изолировав ранее подготовленную геномную ДНК, создать библиотеки глубокого секвенирования путем усиления ПЦР GDNA с праймерами, нацеленными на цель и вне цели. Затем используйте индексные грунтовки для обозначения каждого образца. Используйте машину секвенирования следующего поколения, чтобы подвергать библиотеки пула парной последовательности конца.После того, как экран Snyper выполняется, процент колоний выживания может быть рассчитан путем деления количества колоний на селективной пластине LB на количество колоний на не селективной пластине LB. Хотя этот процент, как правило, очень низок при исполнении с библиотеками SP Cas9, истинные положительные хиты могут быть обогащены, повторяя экран с выжившим бассейном. Представитель экрана Snyper показывает 100%выживаемость получается после третьего экрана.Трансфекции с использованием РНП или плазмидной кодируемой Snyper Cas9 могут быть сделаны для различных целей, и в результате целевых и внецелесохозных мероприятий, измеряемых секвенированием целевых ампликонов. В большинстве целей Snyper Cas9 показывает тот же уровень целевой деятельности и более высокие коэффициенты специфичности по сравнению с диким типом. Для дальнейшего улучшения специфичности могут также использоваться сеченные SGRNAs.Более высокая эффективность преобразования на первом этапе очистки очень важна, чтобы не потерять клонов с высокой специфичностью. Более поздние этапы скрининга повторяют меньшую эффективность преобразования, так как клоны уже обогащаются на первом этапе скрининга, и вероятность их потери меньше. Там будет более одного клона, который мы нашли на экране Snyper.Деятельность этих клонов на цели и вне цели должна характеризоваться как можно большим количеством различных целей для выбора клонов с наилучшей производительностью. С помощью этого метода ученые могут улучшить специфичность ферментов, похожих на Cas9, без потери целевой активности. Кроме того, ученым не нужны какие-либо предварительные знания о структуре белка, чтобы сделать улучшения.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Идентификация рецепторов поверхности клетки используя Геном-Шкала CRISPR/Cas9 Генетические экраны

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

В Vitro Направленная эволюция ограничения Эндонуклеза с более строгой спецификой

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Опосредованное редактирование генома в filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...