Name: using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Bu araştırma bilim Bakanlığı ve Kore ICT (2017M3A9B4061406) ve Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Jungjoon K. Kore hükümeti (MSIT) (grant numaraları 2017M3A9B4061404 ve 2018M3A9H3020844) tarafından finanse edilen NMG) gelen hibe tarafından desteklenmiştir Lee. PGRG36 kodlama plazmid Nancy Craig (Addgene plazmid #16666) hediye etmişti ve p11-dantel-wtx1 Huimin Zhao hediyesiydi.

<ol>
	<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy.">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects.">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li><li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice.">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li><li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5'+nucleotides.">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).</li><li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage.">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases.">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).</li><li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+easy+and+efficient:+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event.">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39 (2006).</li><li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenCFU,+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects.">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).</li><li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases.">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells.">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-Analyzer:+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data.">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li><li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes.">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li></ol>

ToolGen Sniper-ekran kapsayan bir patent başvurusu (PCT/KR2017/006212) Filed under (durumu: beklemede, mucit: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung ve Euihwan Jeong ToolGen A.ş. çalışanları vardır

Keskin nişancı-Cas9 elde etmek için hantal tarama işlemleri önlemek için isteyenler için keskin nişancı-Cas9 protein ve kodlama plazmid mevcuttur. Bu malzemelerin sağlayan en yüksek özgüllük oranı tespit edilmelidir sgRNA, optimum uzunluğu kullanarak. Buna ek olarak, bir plazmid biçimde teslim daha yüksek özgüllük oranı genellikle sonuçlanan keskin nişancı-Cas9 ve sgRNA RNP biçimde önerilir. Keskin nişancı-Cas9 farklı olarak, diğer mühendislik Cas9 türevleri kesilmiş sgRNAs6,7 veya teslim RNP formu8 (dışında HiFi-Cas9) ile uyumlu değildir.
Keskin nişancı-ekran için en önemli adım eşleşmeyen sıra seçimidir. GOI sıra doğru düşük bölünme aktivitesiyle ilişkilendirilmiş eşleşmeyen bir sgRNA yelpazesi kaçınılmalıdır. Eğer değilse, Cas9 türevleri özgüllük WT düzeyi olan E. coli genomik DNA ile eşleşmeyen hedef site ayırmak değil. Bu etki çok sayıda arka plan koloniler, yordam eleme bütün tehlikeye neden olur.
E. coli hızlı olduğundan zaman ve yüksek dönüşüm verimliliği Maya, keskin nişancı ekran göre iki katına avantajlı Maya tabanlı tarama yöntemleri için karşılaştırılır. Ayrıca, keskin nişancı ekran diğer E. colidaha duyarlı olmalıdır-bir plazmid tabanlı sistemler eşleşmeyen sitesine gerçekleşiyor: genomik DNA'ın bir kopyası ve böylece tek sistemimiz, ancak çok sayıda eşleşmeyen sitesine kopyasını Plazmid içinde tek bir E. coli hücre.
DSBs, SaCas9 veya Cpf1s, gibi neden diğer DNA endonucleases özelliklerine de keskin nişancı ekran kullanarak gelişmiş olabilir. Ne yazık ki, temel editörler genomik DNA E.coli DSBs ikna etmek değil çünkü keskin nişancı ekran doğrudan, temel editörler özgüllüğü artırmak için kullanılamaz. Nickase veya Cas9, ölü sürümünde kendi sisteminin temel editörleri kullanmak gibi temel editörler özelliklerine keskin nişancı-ekran elde edilen sayısı kullanarak artış.

Bu yazıda, farklı stratejiler birleştirerek Cas9 özgüllüğü artırmak hedefliyoruz. CRISPR-Cas9 hedef kapalı etkileri kaçınmak çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Örneğin, kesilmiş sgRNAs daha yüksek özgüllük1elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, Cas9 Teslimat yöntemi plazmid biçiminden daha yüksek özgüllük2' yi edinmek için RNP biçimi değiştirilebilir. Belirli amino asit kalıntıları eklenmesi, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) protein rasyonel göre modifiye edilmiştir tasarım açıklanan daha önce3,4,5. Alternatif olarak, amino asitlerin rasgele bir şekilde değiştirilmiş ve Cas9 türevleri en yüksek özgüllük ile Maya6 veya eleme sistemi E. coli7,8 kullanarak tespit edilmiştir.
Ancak, birçok grup Cas9 türevleri nonspesifik etkileşimini etkiler, Cas9 ve substrat sergi düşük hedef üzerinde etkinlikler7,8,9, debilitate için tasarım kullanarak tasarlanmış bildirdin 10 , 11 , 12. bir E. coligeliştirdiğimiz-yönlendirilmiş evrim sistemini, rastgele mutagenized Cas9 türevleri ekran için keskin nişancı ekran, alan. Eleme sistemi bir E. coli E. colidaha hızlı katlama zaman ve daha yüksek dönüşüm verimliliği nedeniyle bir maya sistem avantajları vardır.
Negatif ve pozitif seçim, üç farklı Plazmid ve E. coli genom entegre bir gen (GOI) ilgi dayalı keskin nişancı ekran modunda kullanılır. E. coli belirlenen adaylar subcloning gerek kalmadan memeli hücreleri test edilebilir böylece Cas9 değişik bir düşük-kopya numarası plazmid CMV PltetO1 çift-organizatörü sisteminde ifade edilir. GOI Tn7 transposon sistemini kullanarak E. coli genom giriliyor. Çoğaltma sıcaklığa duyarlı kökeni içerir, sgRNA plazmid GOIhedefleme bir sgRNA ifade eder; Ancak, sgRNA ve GOI dizileri mükemmel eşleştirilir değil. Üzerinde bir üçüncü plazmid gyrase yapılabilir zehirler öldürücü bir ürün kodlar ccdB gen içeren bir mükemmel uyumlu sgRNA hedef bulunmaktadır. İki iplikçikli kırılmalar (DSBs) genomik DNA'SINDA bulunan uyumsuz sitesinde içine tanıttı çünkü bu sistemde, Cas9 türevleri ile yüksek hedef kapalı faaliyetleri ifade hücreleri kaldırılır. Öte yandan, Cas9 türevleri ile düşük hedef üzerinde hareket ifade hücreleri de öldürücü ccdB gen ekspresyonu nedeniyle kaldırılır. Cas9 türevleri ifade düzeyini seçimi kuvvet ayarlayan anhydrotetracycline (ATC), konsantrasyon değiştirerek değiştirilebilir.
Genomik DNA yerine bir plazmid eşleşmeyen sgRNA hedef site bulma sistemi duyarlılığını artırmak gerekçeli. Olmayacak birçok Plazmidler, her bir hedef site içinde tek bir içeren bu yaklaşımın avantajı sadece bir genomik site olduğunu ise E. coli hücre.
Bu sistemi kullanarak, bir Cas9 değişken, keskin nişancı-Cas9, hangi WT düzeyi hedef üzerinde etkinlikleri gösterir ve hedef kapalı etkinlikler için WT Cas9 karşılaştırıldığında düşük tespit edilmiştir. Keskin nişancı-Cas9 hatta yüksek özgüllük oranları kesilmiş sgRNAs veya RNP alan teslim plazmid alan teslim yerine kullanarak elde edebilirsiniz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>37919 or 94664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS203-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversify PCR Random Mutagenesis</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630703</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Shuffling Kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>PP-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-17</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-2</td>
			<td>E. coli electrocompetent cells for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>S101-01</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200550</td>
			<td>Error-prone PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic DNA prep kit</td>
			<td>GenAll</td>
			<td>106-152</td>
			<td>gDNA-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP/MP Cuvette, 0.1cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>BR165-2089</td>
			<td>E. coli electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>450810500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass PCR Purification Kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaboPass Plasmid Mini</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>Mini-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LMM0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>RNP Electroporation equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740420.50</td>
			<td>Midi-prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>DNA purification kit that enables low-volume elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS31985070</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p11-lacY-wtx1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#123945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgrg36</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#16666</td>
			<td>E. coli mutator strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophophatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2403L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>R013L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Red Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using sniper-cas9 to minimize off-target effects of crispr-cas9 without the loss of on-target activity via directed evolution

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) geliştirilmesi-ilişkili protein 9 (Cas9) tedavi yöntemleri potansiyel olarak zararlı hedef kapalı etkileri kaçınma gerektirir. Birkaç yöntem bu tür etkileri azaltmak için tasarlanmış. Burada, bir Escherichia colimevcut-tabanlı yönlendirilmiş evrim yöntemi en iyi duruma getirilmiş özgüllük ile bir Cas9 değişken edinme keskin nişancı-ekrana adı ve hedef üzerinde etkinlik, keskin nişancı-Cas9 denilen korudu. Keskin nişancı-ekran kullanarak, pozitif ve negatif seçim aynı anda gerçekleştirilebilir. Ekran da gerçek pozitif sayısı için zenginleştirmek için diğer tek-Kılavuzu RNA (sgRNA) serileri ile tekrar edilebilir. CMV PltetO1 çift organizatörü Cas9 türevleri ifade etmek için kullanarak, havuza alınan kitaplığın performansını hızlı bir şekilde memeli hücrelerinde denetlenebilir. Keskin nişancı-Cas9 özgüllüğü artırmak için yöntemleri de açıklanmaktadır. İlk olarak, kesilmiş sgRNAs kullanımı daha önce Cas9 özgüllüğü artırmak için gösterilmiştir. Diğer mühendislik Cas9s farklı olarak, keskin nişancı-Cas9 kesilmiş sgRNAs ile birleştirildiğinde hedef tarih etkinlik vahşi-tipi (WT) düzeyini korur. İkinci olarak, keskin nişancı-Cas9 teslim Ribonükleoprotein (RNP) biçiminde bir plazmid biçimi yerine hedef üzerinde faaliyete etkilemeden mümkündür.

Keskin nişancı-ekran gerçekleştirildikten sonra hayatta kalma kolonileri yüzdesi kloramfenikol, sefaloridin, arabinoz ve hava trafik kontrol (CKAA) içeren LB plaka üzerinde kolonileri kolonileri içinde LB plaka içeren dizi sayısı bölerek hesaplanabilir kloramfenikol ve sefaloridin sadece (CK). Keskin nişancı-ekran SpCas9 kütüphaneleri ile gerçekleştirildiğinde bu oran genellikle çok düşük. Gerçek pozitif sayısı ekranın hayatta kalan havuzlu yineleyerek zenginleştirilmiş. Bu temsilcisi keskin nişancı-ekranda, örneğin, sonra üçüncü ekran (şekil 1) %100 sağkalım oranı elde edildi. Transfections RNPs veya plazmid kodlanmış keskin nişancı-Cas9 kullanarak çeşitli hedefleri ve elde edilen Tarih-hedef için yapılabilir ve hedef kapalı faaliyetleri tarafından ölçülen amplicon sıralama (Şekil 2) hedef. En hedefleri, keskin nişancı-Cas9 hedef tarih faaliyetleri aynı düzeyde gösterir ve WT kesildi sgRNAs kıyasla daha yüksek özgüllük oranları da daha fazla özgüllük (şekil 3) geliştirmek için kullanılabilir. Ancak, çoğu durumda tam uzunlukta sgRNAs kıyasla düşük hedef üzerinde faaliyetleri sonucunda çünkü bunların kullanımı sadece bazı hedefleri için sınırlıdır. Bu nedenle, sgRNAs değişen uzunlukları (gelen 17 - için 20-mers) ile test edilmesi gereken ve hedef üzerinde ve hedef kapalı faaliyetleri özgüllük optimize etmek için ölçülen gerekir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> Şekil 1: temsilcisi keskin nişancı-ekranlar gerçekleştirilen rasgele Cas9 türevleri farklı kitaplıklarıyla. Mutator Kütüphane, EP Kütüphane ben ve EP Kütüphane II Kitaplıklar farklı ticari kitleri kullanılarak yapılan gösterir. Birinci, ikinci ve son kez zenginleştirme ekran sayısı7gerçekleştirilen gösterir. Bu rakam Lee vd.7' den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> Şekil 2: hedef üzerinde ve hedef plazmid veya RNP ile teslim bir 20-mer Kılavuzu sırası ile eşleştirilmiş faaliyetleri WT-Cas9 veya keskin nişancı-Cas9. Özgüllük oranları hedef üzerinde Etkinlik hedef dışı etkinlik tarafından bölünerek belirlenmiştir. Hata Çubuklarõn SEM (n = 3)7. Bu rakam Lee vd.7' den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> Şekil 3: Tarih-hedef ve hedef kapalı keskin nişancı-Cas9 WT-Cas9 sgRNAs FANCF01 ve AAVS sitelerini hedefleme değişken uzunluktaki kullanılarak elde karşılaştırıldığında faaliyetlerinin. Özgüllük oranları Indel frekansları hedef tarih sitelerde bu ilgili hedef uzak sitelerdeki bölünerek belirlenmiştir. sgRNAs 5' terminus (GX18 veya GX19), eşleşen bir guanin ile ve bu eşleşmeyen bir guanin (gX17, gX18, gX19 veya gX20) ile gösterilir. Özgüllük oranları olarak hesaplanmadığını normalleştirilmiş hedef üzerinde faaliyetleri yaşındayken < % 707. Bu rakam Lee vd.7' den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution at JoVE.com

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Burada, CRISPR-Cas9-hedefi faaliyeti kaybı olmadan daha yüksek bir özgüllüğü elde etmek için en iyi duruma getirmek için bir protokol mevcut. Keskin nişancı-ekran denilen bir yönlendirilmiş evrim yaklaşım istenen özelliklere sahip bir mutant Cas9 bulmak için kullanın. Keskin nişancı-Cas9 kesilmiş tek-Kılavuzu RNA'lar ve teslimat Ribonükleoprotein biçiminde, daha yüksek özelliklerine ulaşmak için iyi bilinen stratejileri ile uyumludur.

Keskin nişancı-Cas9 CRISPR-Cas9 hedef olarak faaliyet yönlendirilmiş evrim yoluyla kaybı olmadan hedef kapalı etkilerini en aza indirmek için kullanma

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

Doğada Cas9, istilacı virüslere karşı, evrimin spontan mutasyonlarla viral DNA'yı kesebilen promiscuous özgüllüğü olan Cas9'u tercih eden bir bağışıklık proteinidir. Yüksek özgüllükte optimize edilmiş bir Cas9 varyantı tercih eden yapay bir yönlendirilmiş evrim sistemi inşa ettik. Sniper Tarama Sistemi'nde hem negatif hem de pozitif seçimler eş zamanlı olarak çalışır.Hedef dışı aktiviteyi azaltan Cas9 varyantları aynı anda taranabilir. Mutasyonlar tüm Cas9 dizisinde rastgele taranacak kütüphaneyi üretmek için tanıtıldı. Bu da beklenmedik pozisyonlarda mutasyonlar bulmayı mümkün kıldı.Şu anda, akademi ve sanayi birçok araştırmacı terapötik gelişmeler için Y-tipi Cas9 kullanıyor. Ancak, Y-tipi Cas9 özgüllüğü sıkıca paketlenmiş kapalı neden olabilir optimize edilmez. İnsanlarda, bu rasgele genlerde beklenmedik mutasyonlar anlamına gelir, hangi ciddi yan etkilere yol açabilir.Terapötik olarak geliştirilen birçok Cas9 enzimleri gibi vardır. Tekniğimiz Jipinger, Tayland ve CPF1 gibi Cas9 gibi diğer DNA ve nükleidlerin özgüllüğünü artırmak için kullanılabilir. Bir kitaplığı yeterince büyük yapmak, önemli işlevlere sahip bir varyant elde etme olanaklarını artırmak için anahtardır.Soğutma adımında yüksek verimlilik elde etmek ve yüksek verimli yetkin hücreleri kullanmak emin olun. Bu yordamı başlatmak için, çözülmüş BW25141 GOI hücrelerinin elli mikrolitre içine çift uyumsuzluklar ile HEM CCDB plazmid ve SGRNA plazmid bir nanogram ekleyin. Hücreleri boru lar aktarak hafifçe karıştırın ve önceden soğutulmuş, 0,1 santimetrelik elektroporasyon kütütüne aktarın.Elektroporasyon yoluyla iki plazmidile E-coli dönüştürün. Elektroporasyon tamamlandıktan hemen sonra, 250 mikrolitre SOC ortamı ekleyin. Yavaşça hücreleri ve orta karıştırmak için çözelti pipet ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp karışımı aktarın.Dönüştürülmüş hücreleri kurtarmak ve 32 santigrat derece onları kuluçka, bir saat boyunca hafifçe sallayarak. Metin protokolünde belirtildiği gibi Snyper tarama hücrelerini hazırlamaya devam edin. Snyper taramasını yapmaya hazır olduğunuzda, daha önce açıklanan elctroporasyon işlemini kullanarak her kütüphaneden hazırlanan Cas9 varyant plazmidlerinin 100 nanogramı ile Snyper tarama hücrelerini dönüştürün.Daha sonra, hücrelerin 250 mikrolitresini taze 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mililitre başına 10 nanogram lık son konsantrasyona 250 pikogram ATC ekleyin. Atc içeren ve ATC içermeyen hücreleri 32 santigrat derecede hafif çetreleyerek bir saat boyunca hafifçe sallayarak kurtarın.Kloramfenikol ve kanamisin içeren lb agar plakaüzerinde bulunan atc içermeyen hücrelerin plakası 25 mikrolitre. 245 milimetrelik LB agar plakaüzerinde mililitre başına 100 nanogram lık son konsantrasyona, hücreleri içeren kurtarılan ATC'ye ATC ekleyin. Hemen kloramfenikol, kanamisin ve arabinose içeren bir LB agar içeren bir ATC içeren hücreleri plaka.Tüm plakaları bir gecede 32 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakaların fotoğrafını çek. Açık CFU yazılımını kullanarak, tüm varyantları kapsayacak şekilde, seçici olmayan plakaüzerindeki koloni lerin sayısının kütüphanenin çeşitliliğinden en az on kat daha büyük olduğundan emin olmak için uygun kolonilerin sayısını sayın.Üç kütüphanenin seçici plakaları üzerinde hayatta kalan kolonileri çekin. Bu havuzlu kolonileri kloramfenikol ile desteklenen 250 mililitre LB ortamına aktarın ve gece boyunca 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İlk olarak, hedef siteleri seçmek için Cas OF bulucu yazılımını yükleyin.Cas9'un özel tipine ve hedef genomuna uygun PAM Tipini seçin. Sorgu dizileri sekmesini doldurun. Uyumsuzluk numarasını seçin ve gönder düğmesini tıklatın.Birkaç saniye sonra, hedef ve hedef dışı siteler görünür. Genel olarak, bir ila üç uyuşmazlık olan hedef dışı siteleri seçin. Ardından, CRRNA ve Track RRNA oligolarını şablon dizileriyle sipariş edin ve metin protokolünde belirtildiği gibi şablonu yükseltin.Güçlendirilmiş şablon DNA'sının iki mikrolitresini %2'lik agarose jel üzerinde analiz edin ve şablonu arındırın. Reaksiyon karışımını bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 0.5 mikrolitre DNAe ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra SGRNA'yı arındırın.Daha sonra, in-vitro transkripsiyonlu RNA 10 mikrogram tedavi 250 buzağı bağırsak alkalen fosfataz üç saat boyunca 3 santigrat derece, RNae inhibitörü 100 birim varlığında, ve sonra tedavi SGRNA arındırın. İlk olarak, DMEM'deki HEK293 T hücrelerini %10 FBS ve %1 antibiyotiklerle 37 derecede %5 karbondioksitle tamamlar. Daha sonra, iki mikrogram yabani tip veya Snyper Cas9 proteinini iki mikrogram SGRNA ile karıştırın ve RNP kompleksleri yapmak için oda sıcaklığında on dakika kuluçkaya yatırın.Hücreleri trypnize ve saymak, sonra onları yıkayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi elektroporasyon tampon bunları hazırlamak. 30 milisaniye boyunca 1300 volt bir darbe kullanarak hücrelere RNP kompleksleri elektroporate. Elektroporasyondan hemen sonra, hücreleri %10 FBS ve %1 antibiyotiklerle desteklenen 500 mikrolitre DMEM ile dolu 48 kuyuluk bir plakaya yerleştirin.%5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. DMEM'deki HEK293 T hücrelerini %10 FBS ve %1 antibiyotiklerle %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede koruyun. Transfeksiyondan bir gün önce hücreleri deneyin ve sayın.48-iyi ölçekte çalışıyorsa, plaka 10, kuyu başına 000 hücre ve tam büyüme ortamı 250 mikrolitre. Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak, transfeksiyon için 250 nanogram P3S Cas9 plazmid ve 250 nanogram SGRNA hazırlayın. Daha sonra plazmidleri 25 mikrolitre serumsuz MEM ile karıştırın.25 mikrolitre serumsuz MEM ile bir mikrolitre transfeksiyon reaktifini seyreltin. Bu karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Plazmid karışımını transfeksiyon reaktif karışımı ile birleştirin ve plazmid lipofektamin kompleksleri oluşturmak için 20 dakika boyunca odada kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, her iyi içeren hücrelere doğrudan bu karışımın 50 mikrolitre ekleyin. Yavaşça karıştırmak için ileri geri plaka kaya. Trans-gen ekspresyonu için tahmin etmeden önce hücreleri transfeksiyon sonrası 48 ila 72 saat karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın.Önceden hazırlanmış genomik DNA'yı yalıttma ettikten sonra, PcR tarafından GDNA'nın yükseltilmesi ile hedef te ve hedef dışı hedef alan astarlarla derin sıralama kütüphaneleri oluşturun. Ardından, her örneği etiketlemek için dizin astarlarını kullanın. Havuz kitaplıklarını eşleştirilmiş uç sıralamasına tabi tutturmak için yeni nesil bir sıralama makinesi kullanın.Snyper ekranı yapıldıktan sonra, sağkalım kolonilerinin yüzdesi seçici LB plakası üzerindeki kolonilerin sayısının seçici olmayan LB plakaüzerindeki koloni sayısına bölünmesiyle hesaplanabilir. SP Cas9 kitaplıkları ile yapıldığında bu yüzde genellikle çok düşük olsa da, gerçek pozitif isabetler kalan havuz ile ekran tekrarlayarak zenginleştirilebilir. Temsili bir Snyper ekranı üçüncü ekrandan sonra %100 sağkalım oranının elde olduğunu gösterir.RNP veya plazmid kodlanmış Snyper Cas9 kullanılarak transfeksiyonlar çeşitli hedefler için yapılabilir ve bunun sonucunda hedef ve hedef dışı faaliyetler hedef amplicon dizilimi ile ölçülür. Çoğu hedefte, Snyper Cas9 hedef faaliyetlerde aynı düzeyde ve vahşi tipe göre daha yüksek özgüllük oranlarını gösterir. Kesilen SGRNA'lar özgüllüğü daha da artırmak için de kullanılabilir.İlk temizlik adımında daha yüksek dönüşüm verimliliği, klonları yüksek özgüllükte kaybetmemek için çok önemlidir. Daha sonraki tarama adımları, klonlar ilk tarama adımında zaten zenginleştiğinden ve onları kaybetme şansı daha az olduğundan daha az dönüşüm verimliliğini yineler. Snyper ekranında bulduğumuz birden fazla klon olacak.Bu klonların hedef ve hedef dışı faaliyetleri en iyi performansa sahip klonları seçmek için mümkün olduğunca çok farklı hedefolarak karakterize edilmelidir. Bu yöntemle, bilim adamları hedef aktivite kaybı olmadan Cas9 benzeri enzimlerin özgüllüğünü artırabilir. Buna ek olarak, bilim adamları iyileştirmeler yapmak için proteinin yapısı hakkında herhangi bir ön bilgiye gerek yoktur.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...