Name: medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm at JoVE.com

Les auteurs aimerait remercier le laboratoire de Timo Strünker contrôle des AR et DLE lors de leurs séjours dans son laboratoire. En outre, nous tenons à remercier nos collègues au ministère de la croissance et la Reproduction, hôpital universitaire de Copenhague, Rigshospitalet, pour leur contribution à la mise en place de ces deux essais. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le Danemark du fonds d’Innovation (numéros de subvention 3-005-2010 et 2013-14-4).

La collecte et l’analyse des échantillons de sperme humain dans les protocoles suit les directives de la Research Ethics Committee de la région de la capitale du Danemark. Tous les échantillons de sperme ont été obtenus après consentement éclairé des donneurs volontaires. Après l’accouchement, les échantillons ont été totalement anonymisées. Pour leurs inconvénients chaque donateur reçoit une taxe de 500 couronnes danoises (environ $75 dollars US) par exemple. Les échantillons ont été analysés le j...

Le débit moyen Ca2 + signalisation est basé sur des mesures de fluorescence des micropuits unique chaque contenant environ 250 000 spermatozoïdes. Le signal capturé est en moyenne de toutes les cellules de sperme individuels dans le puits. Le test fournit donc qu'aucune information spatiale sur l’endroit où plus précisément dans la cellule de sperme [Ca2 +]j’ai n’est changée, comment grand une proportion des spermatozoïdes [Ca2 +]i un changement a lieu...

Les deux essais décrits ici vise à étudier les effets sur Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain, comme l’a montré pour plusieurs composés dans plusieurs publications qui emploient ces dosages1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalisation et la réaction de l’acrosome sont fonction des cellules de sperme humain vital à la normale et la fertilité masculine.
L’objectif général d’une cellule de sperme humaine consiste à féconder l’ovule. Pour pouvoir correctement et naturellement féconder l’ovule, les fonctions de la cellule de sperme doivent être réglementées étroitement pendant le trajet des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur féminin8,9. Les fonctions de la cellule de sperme sont réglementées via l’intracellulaire Ca2 +-concentration [Ca2 +]j’ai (par exemple, selon la réaction acrosome, chimiotactisme et la motilité de sperme)10. En outre, un processus de maturation, appelé la capacitation, qui rend les spermatozoïdes capables de féconder l’ovule, est partiellement réglementé par [Ca2 +]j’ai10. Ca2 +-extrusion Ca2 +-ATPase pompes11 maintenir un pli environ 20.000 Ca2 +-dégradé sur la membrane de la cellule de sperme humain, avec un repos [Ca2 +]j’ai de 50 à 100 nM. Si Ca2 + est autorisé à traverser la membrane cellulaire (par exemple, par le biais de l’ouverture du Ca2 +-canaux), un afflux considérable de Ca2 + se produit, donnant lieu à une altitude de [Ca2 +]i. Toutefois, le spermatozoïde porte également intracellulaire Ca2 +-magasins, qui peuvent libérer Ca2 + et, par conséquent, également donner lieu d’altitude [Ca2 +]i12. Fait intéressant, tous médiée par les canaux Ca2 +-afflux dans les spermatozoïdes humains constate jusqu'à présent à se produire par l’intermédiaire de CatSper (chatde canal ionique de Sperm), qui n’est exprimée dans les cellules spermatiques11. Dans les spermatozoïdes humains, CatSper est activé par la progestérone ligands endogènes et les prostaglandines par distincte ligand binding sites13,14,15, conduisant à une rapide Ca2 +-afflux dans la cellule de sperme. Deux principales sources près de le œuf fournissent des niveaux élevés de ces ligands endogènes. L’un est le liquide folliculaire contenant des niveaux élevés de progestérone16. Le liquide folliculaire est libéré des follicules à maturité ainsi que de le œuf à l’ovulation et les mélanges avec le fluide dans les oviductes17. L’autre source principale est les cellules du cumulus qui entourent le œuf et émettent des niveaux élevés de progestérone et les prostaglandines. La progestérone induite par Ca2 +-afflux dans les cellules de sperme s’est avéré de médiation chimiotactisme vers l’oeuf9,18, contrôler la motilité de sperme19,20 et stimuler l’acrosome 21de réaction. Déclenchement de ces individuels [Ca2 +]i-fonctions de sperme réglementé dans le bon ordre et au bon moment est crucial pour la fécondation de l' oeuf8. Dans ce cadre, un sous-optimale induite par la progestérone Ca2 +-afflux a été trouvé pour être associé à réduit la fertilité mâle22,23,24,25,26 ,27,28,29 et fonctionnelle CatSper est essentiel pour la fertilité masculine26,30,31,32, 33,34,35,36.
Comme les spermatozoïdes atteignent l’ovule, une séquence d’événements doit avoir lieu pour la fécondation se produise : 1) les spermatozoïdes doivent pénétrer la couche de cellules de cumulus environnantes, 2) lier à la zone pellucide, 3) exocytose le contenu acrosome, la réaction de ce que l'on appelle acrosome 37, 4) pénétrer dans la zone pellucide et 5) fusionnent avec la membrane de l’oeuf pour compléter la fertilisation38. Pour pouvoir passer par ces étapes et féconder l’ovule, le spermatozoïde doit tout d’abord subir capacitation11, qui commence comme les spermatozoïdes laisser le liquide séminal contenant « decapacitating » facteurs39 et nager dans les fluides de la femelle appareil reproducteur avec des niveaux élevés de bicarbonate et albumine37. Capacitation rend les spermatozoïdes capables de subir une hyperactivation, une forme de mobilité avec une raclée vigoureuse du flagelle et acrosome réaction37. Hyperactivé motilité est requise pour la pénétration de la zone pellucide40et l’acrosome contient diverses enzymes hydrolytiques qui facilitent ce processus de pénétration41. En outre, la réaction de l’acrosome restitue les spermatozoïdes capables de fusionner avec l’oeuf en exposant des protéines membranaires spécifiques sur la surface de sperme nécessaire pour la fusion de spermatozoïde-ovule42. Par conséquent, la possibilité de subir une réaction hyperactivation et acrosome sont tous deux requis pour la fécondation réussie de l’oeuf40,42. Contrairement à ce qui a été vu pour la souris spermatozoïdes43,44,45, spermatozoïdes seulement humains qui sont acrosome intacte peut lier à la zone pellucide46. Lorsque les spermatozoïdes humains sont liés à la zone pellucide, ils devront subir la réaction de l’acrosome fois à pénétrer dans la zone pellucide41 et d’exposer des protéines membranaires spécifiques qui sont nécessaires pour la fusion avec l' oeuf38. Le moment de la réaction de l’acrosome dans le sperme humain est donc critique pour la fécondation se produise.
Comme décrit plus haut, Ca2 +-signalisation est vitale pour la fonction8de cellules de sperme normal, et c’est donc un grand intérêt pour être en mesure à l’écran un grand nombre de composés aux effets sur la Ca2 +-la signalisation dans les spermatozoïdes humains. De même, comme des spermatozoïdes seulement humains qui subissent une réaction de l’acrosome au bon moment et au lieu peut pénétrer la zone pellucide et féconder l’ovule46,47, il est également très intéressant pour pouvoir tester les composés pour leur capacité à influent sur la réaction de l’acrosome dans le sperme humain. À cette fin, deux essais de criblage à moyen débit sont décrits : 1) une analyse des effets sur Ca2 +-signalisation dans les spermatozoïdes humains et 2) un test de la capacité d’induire de réaction de l’acrosome dans les spermatozoïdes humains.
Essai 1 est un moyen débit Ca2 +-dosage de signalisation. Cette technique d’axée sur le lecteur sur la plaque de la fluorescence surveille les changements de fluorescence en fonction du temps simultanément dans plusieurs puits. Le Ca2 +-colorant fluorescent sensible, Fluo-4 a un Kd pour Ca2 +≈ 335 nM et est perméable à la cellule sous la forme d’ester de AM (acétoxyméthyl). À l’aide de Fluo-4, il est possible de mesurer les changements [Ca2 +]i au fil du temps et après l’ajout de composés d’intérêt pour les spermatozoïdes. Le test a été développé par le laboratoire de Timo Strünker 201113 et a depuis été utilisé dans plusieurs études aux composés de l’écran pour les effets sur Ca2 +-signalisation dans le sperme humain1,2,3, 4,5. Aussi, une méthode similaire a servi à plusieurs médicaments candidats48de l’écran. En outre, ce test est également utile pour évaluer le mode pharmacologique de l’action1,2,3,4,5, relation dose-effet courbes1, 2,3,4,5, inhibition compétitive1,2, additivité1,2et synergie3 de composés d’intérêt.
Dosage 2 est un test de réaction moyen débit acrosome. Cette technique de base cytomètre image mesure la quantité de viable acrosome réagi spermatozoïdes dans un échantillon à l’aide de trois colorants fluorescents : iodure de propidium (PI), couplé à la FITC lectine de Pisum sativum (FITC-PSA) et Hoechst 33342. Le test a été modifié d’une méthode similaire d’axée sur la cytométrie de flux par Zoppino et al.,49 et a été utilisé dans plusieurs études6,7. En ce qui concerne le Ca2 +-signalisation dosage, ce test de réaction acrosome pourrait également servir à évaluer les courbes dose-réponse, inhibition, additivité et la synergie des composés d’intérêt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m pore filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>296-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L measuring cylinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>3662-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4 and 2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>30120086 and 0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4861000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Germany</td>
			<td>781096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 and 50 mL platic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>0030122151 and 30122178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2-slide</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>942-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4987000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean wide-mouthed plastic container for semen sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>For addition to HTF+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-3000 image cytometer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>970-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and piptting tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45&#176; angle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100 buffer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP1-cassette</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>941-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks of appropriate sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm

Ca2 +-signalisation est essentielle à la fonction normale des cellules de sperme et la fertilité masculine. De même, la réaction de l’acrosome est vitale pour la capacité d’une cellule de sperme humaine à pénétrer dans la zone pellucide et féconder l’ovule. Il est donc très intéressant pour tester des composés (par exemple, les produits chimiques environnementaux ou candidats-médicaments) pour leur effet sur Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain soit à examiner les effets négatifs potentiels sur la fonction des cellules de sperme humain ou d’enquêter sur un possible rôle comme contraceptif. Ici, deux essais de débit moyen sont décrits : 1) un essai pour l’évaluation des effets sur Ca2 +fluorescence-signalisation dans le sperme humain et 2) un dosage de cytométrie en image pour évaluation de la réaction de l’acrosome dans le sperme humain. Ces tests peuvent être utilisés pour dépister un grand nombre de composés aux effets sur la Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain. En outre, les dosages peuvent être utilisés pour générer des courbes dose-réponse très spécifique des composés individuels, déterminer l’additivité/synergie potentielle pour plusieurs composés et d’étudier le mode pharmacologique d’action par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive expériences avec des inhibiteurs de la revendication.

Représentant résulte d’une expérience de tester l’effet de 4 composés (A, B, C et D) avec un positif (la progestérone) et le contrôle négatif (tampon) sur [Ca2 +]i dans le sperme humain en utilisant le débit moyen Ca2 +-signalisation test peut être vu dans la Figure 4 a. Dans la Figure 4 b, une courbe dose-réponse de la progestérone est montrée, qui a été dérivé de pic ΔF/F<su...

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Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Ici, deux essais de débit moyen pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain sont décrites. Ces tests peuvent servir à l’écran rapidement et facilement de grandes quantités de composés aux effets sur la Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain.

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Nos analyses peuvent être utilisées pour tester les composés pour leurs effets sur la fonction des spermatozoïdes humains. Plus précisément, ces méthodes peuvent être utilisées pour dépister rapidement et facilement un grand nombre de composés pour leurs effets sur la signalisation du calcium et la réaction acrosome dans les spermatozoïdes humains. Les démonstrations visuelles de cette méthode faciliteront la mise en place d’expériences similaires dans leurs propres laboratoires.Commencez par placer un tube de 50 millilitres par millilitre d’échantillon de sperme brut dans un support à tubes à un angle de 45 degrés et en ajoutant quatre millilitres de 37 degrés Celsius fluide tubaire humain ou milieu positif HTF à chaque tube. Ensuite, pipette soigneusement un millilitre d’échantillon de sperme liquéfié au fond de chaque tube et placer les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, utilisez une pointe de pipette modifiée maintenue à un angle de 45 degrés pour transférer doucement autant de la fraction supérieure de la cellule de sperme motile contenant le milieu positif HTF que possible dans un nouveau tube en plastique de 15 millilitres.Pour compter les spermatozoïdes recueillis, diluer un aliquot de 20 microlitres à un facteur de 10, 20, 30, 50 ou 90 dans le tampon S100 dans un tube rond inférieur de deux millilitres selon la concentration prévue. Vortex les spermatozoïdes dilués pendant 10 secondes à 700 rotations par minute. Ensuite, plongez une cassette SP1 dans l’échantillon et déprimez complètement le piston blanc pour aspirer un aliquot de l’échantillon dans la cassette.Ensuite, placez la cassette dans le plateau de cytomètre d’image et exécutez l’analyse des spermatozoïdes humains tachés d’IP selon le facteur de dilution appliqué. Pour mesurer les changements dans la concentration libre de calcium intracellulaire, pipette doucement l’échantillon de sperme de haut en bas une fois et utiliser une pipette répéteur automatique à aliquot 50 microlitres de spermatozoïdes fluorophore-souillés à 24 puits d’une rangée d’une plaque de puits de 384 micro. Placez la plaque de micro puits dans le lecteur de plaque de fluorescence à 30 degrés Celsius et choisissez le protocole approprié pour le fluorophore.Sélectionnez un puits dans la rangée de spermatozoïdes et ajustez le gain à une valeur cible de 20%, puis commencez la mesure. Après 10 cycles de base, mettre en pause l’expérience et éjecter le tiroir avec la plaque de micro puits. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, ajoutez rapidement 25 microlitres des solutions préparées de composés et de contrôles d’intérêt dans les 12 puits en double de la rangée et retournez immédiatement la plaque au lecteur pour continuer la mesure le plus rapidement possible.Tout changement de fluorescence en réponse à l’ajout de composés ou de commandes sera capturé par l’instrument. Pour l’analyse de réaction acrosome, après avoir incubé les spermatozoïdes capacités avec les colorants fluorescents appropriés, les composés ou les contrôles, mélanger les échantillons par pipetting et ajouter 50 microlitres de chaque échantillon d’essai à 100 microlitres de solution d’immobilisation. Mélangez à nouveau les échantillons et chargez les chambres d’une diapositive A2 par échantillon avec environ 30 microlitres d’échantillon par chambre.Placez ensuite la première glissière chargée sur le plateau du cytomètre d’image. Sélectionnez le protocole FlexiCyte et appuyez sur Exécuter. Ici, les résultats représentatifs d’une expérience testant l’effet de quatre composés, un contrôle positif de la progestérone et un contrôle tampon négatif en utilisant l’analyse de signalisation du calcium à débit moyen tel que démontré peuvent être observés.Dans ce graphique, une courbe de réponse de dose de progestérone dérivée des changements de pourcentages de crête dans la concentration libre intracellulaire de calcium induite par la concentration périodiquement diluée de progestérone est montrée. Ces données illustrent les effets d’un négatif ou d’un des deux contrôles positifs sur l’induction d’une réaction acrosome dans les spermatozoïdes humains capacitated dans un essai de réaction acrosome de débit moyen. Pour éviter de manquer les pics des signaux induits, il est essentiel d’ajouter rapidement les produits chimiques aux puits de reproduction et de poursuivre immédiatement la mesure par la suite.En changeant le type de fluorophores et de colorants, nos analyses peuvent facilement être modifiées pour répondre à différentes questions scientifiques. Ces analyses ont déjà été utilisées dans plusieurs études pour tester de grands groupes de composés pour leurs effets sur la fonction du sperme humain.

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