Name: medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00
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Die Autoren möchten im Labor von Timo Strünker Überwachung der AR und DLE während ihrer Aufenthalte in seinem Labor bestätigen. Darüber hinaus möchten wir unseren Kolleginnen und Kollegen an der Abteilung für Wachstum und Reproduktion, Copenhagen University Hospital, Rigshospitalet für ihre Unterstützung bei der Einrichtung dieser beiden Assays danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Innovationsfonds Dänemark (Grant-Nummern 005-2010-3 und 14-2013-4).

Die Sammlung und Analyse von menschlichen Samenproben in den Protokollen folgt den Richtlinien der Forschung-Ethik-Kommission der dänischen Hauptstadt Region. Alle Spermaproben haben freiwillige Spender nach Einwilligung eingeholt. Nach der Geburt wurden die Proben vollständig anonymisiert. Für ihre Unannehmlichkeiten erhielt jeder Spender eine Gebühr von 500 DKK (ca. $75 US-Dollar) pro Probe. Die Proben wurden am Tag der Lieferung analysiert und dann sofort nach den Laborversuchen zerstört.
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Die mittleren Durchsatz Ca2 + Signalisierung Assay basiert auf Messungen der Fluoreszenz von einzelnen Mikrovertiefungen enthält etwa 250.000 Samenzellen. Das aufgenommene Signal wird von allen einzelnen Samenzellen in den Brunnen gemittelt. Der Test bietet somit, dass keine räumlichen Informationen, wo speziell in der Samenzelle [Ca2 +]ich geändert wird, wie groß ein Anteil der Spermien, die eine Änderung der [Ca2 +]i findet, oder wie heterogen ist die Antwort ...

Die beiden Assays, die hier beschriebenen soll Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma wie für mehrere Verbindungen in mehreren Publikationen Einsatz dieser assays1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion sind entscheidend für normalen menschlichen Samenzelle Funktion und Fruchtbarkeit des Mannes.
Das übergeordnete Ziel einer menschlichen Samenzelle ist das Ei zu befruchten. Um erfolgreich und natürlich das Ei zu befruchten zu können, müssen die Funktionen der Samenzelle fest während der Fahrt die Samenzelle durch die weiblichen Fortpflanzungsorgane8,9geregelt werden. Viele der Samenzelle Funktionen unterliegen über die intrazelluläre Ca2 +-Konzentration [Ca2 +]ich (z. B. Sperma Motilität, Chemotaxis und Akrosom Reaktion)10. Auch ist ein Reifungsprozess, der Rechtsfähigkeit, die die Samenzellen zur Befruchtung der Eizelle macht, genannt teilweise geregelt [Ca2 +]ich10. Ca2 +-Extrudieren Ca2 +-ATPase-Pumpen-11 erhalten ein ca. 20.000 Fach Ca2 +-gradient über die menschlichen Samenzelle Membran mit einer ruhenden [Ca2 +]ich von 50-100 nM. Wenn Ca2 + erlaubt ist, die Zellmembran zu überqueren (z. B. durch die Öffnung des Ca2 +-Kanäle), ein großer Zustrom von Ca2 + auftritt, was zu einer Höhe von [Ca2 +]ich. Trägt jedoch auch die Samenzelle intrazellulären Ca2 +-Läden, die Ca2 + freisetzen können und daher auch geben [Ca2 +]ich12Höhe steigen. Interessanterweise alle Kanal-vermittelten Ca2 +-Zustrom in menschliche Samenzellen bisher festgestellt wurde, über CatSper (KatzeIonischen Kanal der SpeRm), auftreten, die nur in Spermien11zum Ausdruck kommt. In menschliche Samenzellen CatSper wird aktiviert durch die endogenen Liganden Progesteron und Prostaglandine durch unterschiedliche Ligand verbindliche Sites13,14,15, führt zu einer raschen Ca2 +-Zustrom in die Samenzelle. Zwei Quellen in der Nähe von dem Ei bieten hohes Maß an diesen endogenen Liganden. Eine ist die Follikelflüssigkeit, die hohe Konzentrationen von Progesteron16enthält. Die Follikelflüssigkeit wird aus Reifen Follikeln zusammen mit dem Ei beim Eisprung und vermischt sich mit der Flüssigkeit innerhalb der Eileiter17freigegeben. Die wichtigste Quelle ist die Cumulus-Zellen, die die Eizelle umgeben und lassen hohe Progesteron und Prostaglandine. Die Progesteron-induzierte Ca2 +-Zustrom in die Samenzellen zu vermitteln Chemotaxis gegenüber Ei9,18, Steuern Spermien-Motilität19,20 und stimulieren die Akrosom nachweislich Reaktion21. Auslösung von diesen einzelnen [Ca2 +]ich-regulierten Sperma-Funktionen in der richtigen Reihenfolge und zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend für die Befruchtung der Eizelle8. Im Einklang mit dieser, eine suboptimale Progesteron-induzierte Ca2 +-Zustrom zugeordnet werden reduziert männliche Fruchtbarkeit22,23,24,25,26 gefunden wurde ,27,28,29 und funktionale CatSper ist unabdingbar für männliche Ergiebigkeit26,30,31,32, 33,34,35,36.
Da die Spermien die Eizelle erreichen, eine Abfolge von Ereignissen erfolgen für die Befruchtung auftreten: (1) die Samenzellen müssen dringen in die umliegenden Cumulus Zellschicht, 2) an die Zona Pellucida binden, (3) den acrosomal Inhalt, die sogenannte Akrosom Reaktion exocytose 37, 4) dringen in die Zona Pellucida und 5) verschmelzen mit der Eihülle Befruchtung38abgeschlossen. Um durch diese Schritte zu gehen und das Ei zu befruchten, müssen die Samenzelle zuerst Rechtsfähigkeit11, unterziehen, die beginnt, wenn die Samenzellen verlassen die Samenflüssigkeit enthält "decapacitating" Faktoren39 und in den Flüssigkeiten des Weibchens schwimmen Fortpflanzungsorgane mit hohen Niveaus von Bikarbonat und Albumin37. Rechtsfähigkeit rendert die Spermien in der Lage, Überaktivierung, eine Form der Motilität mit eine kräftige Tracht Prügel der Geissel und Akrosom Reaktion37zu unterziehen. Überaktivierung Motilität ist erforderlich für die Penetration der Zona Pellucida40, und das Akrosom enthält verschiedene hydrolytische Enzyme, die diese Durchdringung Prozess41Hilfe. Darüber hinaus macht Akrosom Reaktion der Samenzellen in der Lage, der Verschmelzung mit dem Ei, indem man bestimmte Membranproteine auf der Sperma-Oberfläche für Sperma-Ei Fusion42notwendig. Folglich die Fähigkeit Überaktivierung und Akrosom Reaktion zu unterziehen sind sowohl für erfolgreiche Befruchtung der Eizelle40,42erforderlich. Im Gegensatz zu dem, was für Maus Samenzellen43,44,45gesehen hat kann nur menschliche Samenzellen, die Akrosom intakt sind an die Zona Pellucida46binden. Wenn die menschliche Samenzellen an die Zona Pellucida gebunden sind haben sie unterziehen die Akrosom Reaktion, die Zona Pellucida41 einzudringen und um bestimmte Membranproteine freizulegen, die für die Verschmelzung mit dem Ei38benötigt werden. Das Timing der Akrosom Reaktion in menschliches Sperma ist somit entscheidend zur Befruchtung auftreten.
Wie oben beschrieben, Ca2 +-Signalisierung ist wichtig für normale Spermien Zelle Funktion8, und es daher von großem Interesse ist in der Lage sein eine Bildschirm große Anzahl von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung in menschliche Samenzellen. Ebenso wie nur menschliche Samenzellen, die Akrosom Reaktion auf den richtigen Zeitpunkt und Ort unterzogen werden können die Zona Pellucida zu durchdringen und die Eier46,47 befruchten, ist es auch von großem Interesse, Verbindungen für ihre Fähigkeit, testen zu können beeinträchtigen Sie die Akrosom Reaktion in menschliche Spermien. Zu diesem Zweck werden zwei Medium Throughput Screening-Tests beschrieben: (1) ein Test für Wirkungen auf Ca2 +-Signalisierung in menschliche Samenzellen und (2) ein Test für die Fähigkeit, Akrosom Reaktion in menschliche Samenzellen zu induzieren.
1-Assay ist ein Medium-Durchsatz Ca2 +-Assay-Signalisierung. Diese Fluoreszenz Platte Leser-basierte Technik überwacht Änderungen in Fluoreszenz als Funktion der Zeit gleichzeitig in mehreren Brunnen. Die Ca2 +-sensible Fluoreszenzfarbstoff, Fluo-4 hat einen K-d für Ca2 +≈ 335 nM und Zelle-permeationsfähigen in AM (Acetoxymethyl) Ester Form ist. Mit Fluo-4, ist es möglich, Änderungen in [Ca2 +]i im Laufe der Zeit und nach der Zugabe von Verbindungen des Interesses zu den Samenzellen zu messen. Der Test wurde von im Labor von Timo Strünker 201113 entwickelt und ist seitdem in mehreren Studien zu Bildschirm Verbindungen für Auswirkungen auf Ca2 +benutzt worden-Signalisierung in menschliches Sperma1,2,3, 4,5. Auch hat eine ähnliche Methode verwendet wurde, mehrere Drogen Kandidaten48auf den Bildschirm. Dieser Test eignet sich darüber hinaus auch für die Beurteilung des pharmakologischen Modus der Aktion1,2,3,4,5, Dosis-Wirkungs-Kurven1, 2,3,4,5, wettbewerbsfähige Hemmung1,2, Additivität1,2und Synergismus3 Verbindungen des Interesses.
Test 2 ist ein Medium-Durchsatz Akrosom Reaktion Assay. Dieses Bild Cytometer-basierten Methode misst die Menge an lebensfähigen Akrosom reagierte Samenzellen in einer Probe, mit drei fluoreszierende Farbstoffe: Propidium Jodid (PI), FITC gekoppelten Lektin Pisum Sativum (FITC-PSA) und Hoechst 33342. Der Test wurde von einer ähnlichen Flow Cytometry-basierte Methode von Zoppino Et Al.49 geändert und wurde in mehreren Studien6,7verwendet. Für die Ca2 +-Signalisierung Assay, Akrosom Reaktion Assays könnte auch verwendet werden, um die Dosis-Wirkungs-Kurven, Hemmung, Additivität und Synergismus der Verbindungen des Interesses zu beurteilen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m pore filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>296-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L measuring cylinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>3662-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4 and 2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>30120086 and 0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4861000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Germany</td>
			<td>781096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 and 50 mL platic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>0030122151 and 30122178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2-slide</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>942-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4987000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean wide-mouthed plastic container for semen sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>For addition to HTF+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-3000 image cytometer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>970-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and piptting tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45&#176; angle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100 buffer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP1-cassette</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>941-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks of appropriate sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm

Ca2 +-Signalisierung ist für normale Spermien Zellfunktion und männliche Fruchtbarkeit. Ebenso ist die Akrosom Reaktion entscheidend für die Fähigkeit einer menschlichen Samenzelle, die Zona Pellucida zu durchdringen und das Ei zu befruchten. Es ist daher von großem Interesse für die Verbindungen (z. B. Umweltchemikalien oder Medikamenten-Kandidaten) für ihre Wirkung auf Ca2 +test-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma entweder, die potenziellen negativen Auswirkungen auf menschliche Samenzelle Funktion zu untersuchen oder eine mögliche Rolle als Verhütungsmittel zu untersuchen. Hier werden zwei Medium-Durchsatz-Assays beschrieben: (1) ein Fluoreszenz-basierten Test zur Bewertung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung in menschliche Spermien und (2) ein Bild durchflusszytometrischen Assay für die Bewertung von Akrosom Reaktion in menschliches Sperma. Diese Tests können verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca2 +-Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma. Darüber hinaus können die Assays verwendet werden hochspezifische Dosis-Wirkungs-Kurven der einzelnen Verbindungen zu generieren, um festzustellen mögliche Additivität/Synergismus für zwei oder mehr Verbindungen und der pharmakologischen Wirkmechanismus durch wettbewerbsfähige Hemmung zu studieren Experimente mit CatSper-Inhibitoren.

Vertreter ergibt sich aus einem Experiment testen die Wirkung von 4 Verbindungen (A, B, C und D) zusammen mit einer positiven (Progesteron) und negativ (Puffer) Kontrolle auf [Ca2 +]i in menschlichem Samen mit der Medium-Durchsatz Ca2 +-Signalisierung Assay sehen in Abbildung 4a. In Abbildung 4 bzeigt eine Dosis-Antwort-Kurve von Progesteron die Spitze ΔF/F0 (%) abgeleitet wurde, Daten...

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Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Hier, zwei mittleren Durchsatz-Assays für die Bewertung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliche Spermien werden beschrieben. Diese Tests können verwendet werden, um schnell und einfach große Mengen von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca2 +Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma.

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Unsere Assays können verwendet werden, um Verbindungen für ihre Auswirkungen auf die Funktion der menschlichen Spermien zelle zu testen. Insbesondere können diese Methoden verwendet werden, um schnell und einfach eine große Anzahl von Verbindungen auf ihre Auswirkungen auf Kalziumsignalisierung und Akrosomenreaktion in menschlichen Spermien zu überprüfen. Visuelle Demonstrationen dieser Methode erleichtern es anderen, ähnliche Experimente in ihren eigenen Labors einzurichten.Beginnen Sie, indem Sie eine 50 Milliliter Tube pro Milliliter rohen Samenprobe in ein Rohrgestell in einem 45-Grad-Winkel legen und vier Milliliter 37 Grad Celsius Human Tubal Fluid oder HTF-positives Medium zu jeder Röhre hinzufügen. Als nächstes, sorgfältig Pipette einen Milliliter verflüssigten Samenprobe auf den Boden jedes Rohres und legen Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine modifizierte Pipettenspitze, die in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um so viel wie möglich von der oberen Fraktion der motilen Spermienzelle, die HTF-positives Medium enthält, sanft in ein neues 15-Milliliter-Kunststoffrohr zu übertragen.Um die gesammelten Spermien zu zählen, verdünnen Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot auf den Faktor 10, 20, 30, 50 oder 90 in S100 Puffer in einem runden unteren zwei Milliliter-Rohr entsprechend der erwarteten Konzentration. Wirbeln Sie die verdünnten Spermien für 10 Sekunden bei 700 Rotationen pro Minute. Als nächstes tauchen Sie eine SP1-Kassette in die Probe ein und drücken Sie den weißen Kolben vollständig, um ein Aliquot der Probe in die Kassette zu saugen.Legen Sie dann die Kassette in das Bildzytometer-Tablett und führen Sie den PI-gefärbten menschlichen Spermien-Assay entsprechend dem angewendeten Verdünnungsfaktor aus. Um Veränderungen in der freien intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, pipettedieren Sie die Spermienprobe einmal nach oben und unten und verwenden Sie eine automatische Repeaterpipette, um 50 Mikroliter fluorophor-gefärbte Spermien zu 24 Brunnen einer Reihe einer 384 Mikro-Wellplatte zu aliquotieren. Legen Sie die Mikrobrunnenplatte bei 30 Grad Celsius in den Fluoreszenzplattenleser und wählen Sie das entsprechende Protokoll für Fluorophor.Wählen Sie einen Brunnen in der Reihe der Spermien und passen Sie die Verstärkung auf einen Zielwert von 20% dann starten Sie die Messung. Nach 10 Baseline-Zyklen, halten Sie das Experiment und werfen Sie die Schublade mit der Mikro-Brunnenplatte. Mit einer 12-Kanal-Pipette schnell 25 Mikroliter der vorbereiteten Lösungen von Compounds und Steuerungen von Interesse in die 12 doppelten Brunnen in der Reihe hinzufügen und sofort die Platte an den Leser zurückgeben, um die Messung so schnell wie möglich fortzusetzen.Jegliche Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Zugabe der Verbindungen oder Kontrollen werden vom Instrument erfasst. Für die Analyse der anfänsamreagierenden Analyse mischen Sie die Proben nach der Inkubation der kapazitierten Spermien mit den entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen, Verbindungen oder Kontrollen durch Pipettieren und fügen Sie 50 Mikroliter jeder Testprobe zu 100 Mikrolitern immobilisierender Lösung hinzu. Mischen Sie die Proben erneut und laden Sie die Kammern eines A2-Dias pro Probe mit ca. 30 Mikrolitern Probe pro Kammer.Legen Sie dann die erste geladene Folie auf das Fach des Bildzytometers. Wählen Sie das FlexiCyte-Protokoll aus, und drücken Sie Run. Hier können repräsentative Ergebnisse eines Experiments zur Erprobung der Wirkung von vier Verbindungen, einer positiven Progesteronkontrolle und einer negativen Pufferkontrolle mit dem Medium-Durchsatz-Calciumsignaltest, wie gezeigt, beobachtet werden.In diesem Diagramm wird eine Dosis-Ansprechkurve von Progesteron, die aus Spitzenprozentänderungen der intrazellulären freien Kalziumkonzentration abgeleitet wird, die durch eine seriell verdünnte Progesteronkonzentration induziert wird, gezeigt. Diese Daten veranschaulichen die Auswirkungen einer negativen oder einer von zwei positiven Kontrollen auf die Induktion einer akrosomen Reaktion in kapazitierten menschlichen Spermien in einem mitteldurchsatz-Akrosom-Reaktionstest. Um zu vermeiden, dass die Spitzen der induzierten Signale fehlen, ist es wichtig, die Chemikalien schnell in die Replizienbrunnen einzubauen und die Messung danach sofort fortzusetzen.Durch die Änderung der Art von Fluorophoren und Farbstoffen können unsere Assays leicht modifiziert werden, um verschiedene wissenschaftliche Fragen zu beantworten. Diese Assays wurden bereits in mehreren Studien verwendet, um große Gruppen von Verbindungen für ihre Auswirkungen auf die menschliche Spermienfunktion zu testen.

Research

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