Name: medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm at JoVE.com

Gli autori si desidera ringraziare il laboratorio di Timo Strünker per supervisione di AR e DLE durante i loro soggiorni presso il suo laboratorio. Inoltre, vorremmo ringraziare i nostri colleghi presso il dipartimento di crescita e la riproduzione, ospedale universitario di Copenhagen, Rigshospitalet per la loro assistenza con l'impostazione di questi due test. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da parte del fondo per l'innovazione Danimarca (numeri di grant 2010-005-3 e 14-2013-4).

La raccolta e l'analisi di campioni di liquido seminale umano nei protocolli segue le linee guida del comitato etico di ricerca della regione di Hovedstaden. Tutti i campioni di seme sono stati ottenuti dopo consenso informato da donatori volontari. Dopo la consegna, i campioni sono stati completamente anonimi. Per loro disagi ogni donatore ha ricevuto un compenso di 500 DKK (circa $75 dollari USA) per campione. I campioni sono stati analizzati il giorno della consegna e poi distrutti immediatamente dopo gli esperimenti ...

La velocità effettiva media Ca2 + segnalazione di analisi è basata sulla misura della fluorescenza da singoli pozzetti ogni contenente circa 250.000 cellule dello sperma. Il segnale acquisito è in media da tutte le singole celle di sperma nel pozzo. Il dosaggio fornisce così che non spaziali informazioni su dove in particolare la cellula dello sperma [Ca2 +]i sono modificati, in quanto grande una proporzione delle cellule dello sperma avviene un cambiamento in [Ca2 +]i...

Lo scopo dei due saggi qui descritto è quello di esaminare gli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano, come è stato dimostrato per molteplici composti in diverse pubblicazioni che impiegano questi dosaggi1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-segnalazione e la reazione acrosomiale sono entrambi funzione vitale al normale umano delle cellule dello sperma e fertilità maschile.
L'obiettivo generale di uno spermatozoo umano è quella di fecondare l'uovo. Per poter correttamente e naturalmente fecondare l'uovo, le funzioni della cellula dello sperma devono essere regolate strettamente durante il viaggio della cellula dello sperma attraverso il tratto riproduttivo femminile8,9. Molte delle funzioni delle cellule dello sperma sono regolati tramite intracellulare Ca2 +-concentrazione [Ca2 +]i (ad es., spermatozoi motilità, chemiotassi e acrosomiale reazione)10. Inoltre, un processo di maturazione chiamato capacitazione, che rende la cellula dello sperma in grado di fecondare l'uovo, è parzialmente regolamentato da [Ca2 +]i10. CA2 +-estrusione Ca2 +-ATPase pompe11 mantenere una piega circa 20.000 Ca2 +-gradiente sopra la membrana delle cellule dello sperma umano, con un riposo [Ca2 +]io di 50-100 nM. Se Ca2 + è consentito di attraversare la membrana cellulare (ad esempio, attraverso l'apertura di Ca2 +-canali), si verifica un considerevole afflusso di Ca2 + , dando luogo a un'altitudine di [Ca2 +]i. Tuttavia, la cellula dello sperma inoltre trasporta intracellulare di Ca2 +-negozi, che possono liberare Ca2 + e, di conseguenza, anche il danno luogo un'elevazione della [Ca2 +]i12. Interessante, tutti i canali-mediata Ca2 +-afflusso in cellule dello sperma umane finora è stato trovato per accadere via CatSper (gattocanale ionico di rm Spe), che è espresso solo in cellule spermatiche11. In cellule umane di sperma, CatSper viene attivato dal progesterone ligandi endogeni e prostaglandine attraverso distinto ligando vincolanti siti13,14,15, portando a un rapido Ca2 +-afflusso in le cellule di sperma. Due principali fonti vicino l'uovo forniscono alti livelli di questi ligandi endogeni. Uno è il liquido follicolare che contiene alti livelli di progesterone16. Il liquido follicolare viene rilasciato da follicoli maturi insieme con l'uovo all'ovulazione e si mescola con il liquido all'interno del ovidotti17. L'altra fonte principale è le cellule del cumulo che circondano l'uovo e il rilascio di alti livelli di progesterone e prostaglandine. Il progesterone-indotto Ca2 +-afflusso in cellule dello sperma è stato indicato per mediare chemiotassi verso l'uovo9,18, controllo della motilità dello sperma19,20 e stimolare l'acrosomiale reazione a21. Attivazione di questi singoli [Ca2 +]i-funzioni di sperma regolamentato nell'ordine corretto e al momento giusto è fondamentale per la fecondazione dell' uovo8. In linea con questo, suboptimale indotta da progesterone Ca2 +-afflusso è stato trovato per essere associato con ridotta fertilità maschile22,23,24,25,26 ,27,28,29 e CatSper funzionale è essenziale per la fertilità maschile26,30,31,32, 33,34,35,36.
Come gli spermatozoi raggiungere l'uovo, una sequenza di eventi deve avvenire per avvenire la fertilizzazione: 1) le cellule dello sperma deve penetrare lo strato di cellule cumulus circostante, 2) associare alla zona pellucida, 3) exocytose il contenuto acrosomale, la reazione acrosomiale cosiddetto 37, 4) penetrare la zona pellucida e 5) si fondono con la membrana dell'uovo per completare la fecondazione38. Per essere in grado di passare attraverso questi passaggi e fecondare l'ovulo, la cellula dello sperma deve prima subire capacitazione11, che comincia come cellule dello sperma lasciare il liquido seminale contenente "decapacitating" fattori39 e nuotare nei fluidi della femmina tratto riproduttivo con alti livelli di bicarbonato e l'albumina37. Capacitazione rende gli spermatozoi in grado di subire iperattivazione, una forma di motilità con un battente vigorosa del flagello e di reazione acrosomiale37. Motilità iperattivata è necessaria per la penetrazione della zona pellucida40e acrosomiale contiene vari enzimi idrolitici che gli aiuti di questo processo di penetrazione41. Inoltre, la reazione acrosomiale rende gli spermatozoi capaci di fondere con l'uovo esponendo proteine specifiche della membrana sulla superficie degli spermatozoi necessaria per sperma-uovo fusione42. Di conseguenza, la capacità di subire la reazione acrosomiale iperattivazione sono entrambi necessari per la fecondazione dell'uovo40,42. Contrariamente a quanto visto per mouse spermatozoi43,44,45, solo umano delle cellule dello sperma che sono acrosomiale intatta possibile associare alla zona pellucida46. Quando le cellule di sperma umane sono limitate alla zona pellucida devono subire la reazione acrosomiale sia per penetrare la zona pellucida41 ed esporre proteine di membrana specifici che sono necessari per la fusione con l' uovo38. La tempistica della reazione acrosomiale in sperma umano è così critica per avvenire la fertilizzazione.
Come descritto in precedenza, Ca2 +-segnalazione è vitale per spermatozoi normali delle cellule funzione8, ed è, quindi, di grande interesse per essere in grado di grandi numeri di schermo di composti per effetti su Ca2 +-segnalazione in cellule di sperma umane. Allo stesso modo, solo umano delle cellule dello sperma che subiscono reazione acrosomiale al momento giusto e nel luogo può penetrare la zona pellucida e fecondare l'uovo46,47, è anche di grande interesse per essere in grado di testare composti per la loro capacità di influenzare la reazione acrosomiale in sperma umano. A tal fine, sono descritti due saggi di screening medio-resa: 1) un test per effetti su Ca2 +-segnalazione in cellule dello sperma umane e 2) un test per la capacità di indurre la reazione acrosomiale in cellule umane di sperma.
Dosaggio 1 è un mezzo-rendimento Ca2 +-saggio di segnalazione. Questa tecnica basata su lettore di fluorescenza piastra controlla le modifiche in fluorescenza in funzione del tempo contemporaneamente in pozzi multipli. Il Ca2 +-sensibili colorante fluorescente, Fluo-4 ha un Kd per Ca2 +≈ 335 nM ed è cellula-permeante sotto forma di estere AM (acetossimetil). Utilizzando Fluo-4, è possibile misurare le variazioni di [Ca2 +]i , nel corso del tempo e dopo l'aggiunta di composti di interesse per le cellule dello sperma. Il dosaggio è stato sviluppato dal laboratorio di Timo Strünker nel 201113 e da allora è stato utilizzato in parecchi studi ai composti di schermo per effetti su Ca2 +-segnalazione in sperma umano1,2,3, 4,5. Inoltre è stato utilizzato un metodo simile allo schermo più droga candidati48. Inoltre, questo test è anche utile per valutare la modalità farmacologica dell'azione1,2,3,4,5, di curve dose-risposta1, 2,3,4,5, inibizione competitiva1,2, additività1,2e sinergismo3 di composti di interesse.
Metodo 2 è un reazione acrosomiale medio-velocità di trasmissione. Questa tecnica di immagine basati su citometro misura la quantità di vitali acrosomiale ha reagito spermatozoi in un campione, utilizzando tre coloranti fluorescenti: ioduro di propidio (PI), accoppiati a FITC lectina di Pisum sativum (FITC-PSA) e Hoechst 33342. Il dosaggio è stato modificato da un simile metodo basato su cytometry di flusso da Zoppino et al.49 ed è stato utilizzato in diversi studi6,7. Per quanto riguarda il Ca2 +-segnalazione test, questo saggio di reazione acrosomiale potrebbe essere utilizzato anche per valutare le curve dose-risposta, inibizione, additività e sinergismo di composti di interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m pore filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>296-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L measuring cylinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>3662-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4 and 2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>30120086 and 0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4861000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Germany</td>
			<td>781096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 and 50 mL platic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>0030122151 and 30122178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2-slide</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>942-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4987000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean wide-mouthed plastic container for semen sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>For addition to HTF+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-3000 image cytometer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>970-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and piptting tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45&#176; angle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100 buffer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP1-cassette</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>941-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks of appropriate sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm

CA2 +-segnalazione è essenziale per la funzione normale delle cellule dello sperma e la fertilità maschile. Allo stesso modo, la reazione acrosomiale è vitale per la capacità di una cellula di sperma umana di penetrare la zona pellucida e fecondare l'uovo. È quindi di grande interesse per testare composti (per esempio, sostanze chimiche ambientali o candidati farmaci) per il loro effetto su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sia per esaminare i potenziali effetti negativi sulla funzione delle cellule dello sperma umano o per indagare su un possibile ruolo come contraccettivo. Qui sono descritti due saggi di media-velocità di trasmissione: 1) un'analisi di fluorescenza-basata per la valutazione degli effetti su Ca2 +-segnalazione in sperma umano e 2) un'analisi cytometric di immagine per la valutazione della reazione acrosomiale in sperma umano. Queste analisi possono essere utilizzate per lo screening di un gran numero di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano. Inoltre, l'analisi possono essere utilizzate per generare le curve dose-risposta altamente specifici dei singoli composti, determinare il potenziale additività/sinergismo per due o più composti e per studiare il modo farmacologico di azione attraverso l'inibizione competitiva esperimenti con gli inibitori CatSper.

Rappresentante risultati da un esperimento per verificare l'effetto di 4 composti (A, B, C e D) unitamente ad una positiva (progesterone) e un controllo negativo (buffer) sulla [Ca2 +]i in sperma umano utilizzando la velocità media effettiva Ca2 +-segnalazione dosaggio può essere visto in Figura 4a. In Figura 4b, viene visualizzata una curva dose-risposta di progesterone, che è stato derivato d...

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Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Qui, due saggi di medio-velocità effettiva per la valutazione degli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sono descritti. Queste analisi possono essere utilizzate per rapidamente e facilmente a schermo grandi quantità di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano.

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

I nostri saggi possono essere utilizzati per testare i composti per i loro effetti sulla funzione delle cellule spermatica umana. In particolare, questi metodi possono essere utilizzati per schermare rapidamente e facilmente un gran numero di composti per i loro effetti sulla segnalazione del calcio e sulla reazione acrosoma negli spermatozoi umani. Dimostrazioni visive di questo metodo renderanno più facile per gli altri impostare esperimenti simili nei propri laboratori.Inizia posizionando un tubo da 50 millilitri per millilitro di campione di sperma grezzo in un rack di tubi con un angolo di 45 gradi e aggiungendo quattro millilitri di 37 gradi Celsius Human Tubal Fluid o HTF positive medium a ciascun tubo. Successivamente, pipettare con cura un millilitro di campione di sperma liqueficato sul fondo di ogni tubo e posizionare i tubi a 37 gradi Celsius per un'ora. Alla fine dell'incubazione, utilizzare una punta di pipetta modificata tenuta con un angolo di 45 gradi per trasferire delicatamente la maggior parte della frazione superiore della cellula spermatica mobile contenente il mezzo positivo HTF il più possibile in un nuovo tubo di plastica da 15 millilitri.Per contare gli spermatozoi raccolti, diluire un'aliquota di 20 microlitri a un fattore di 10, 20, 30, 50 o 90 in tampone S100 in un tubo rotondo inferiore di due millilitri in base alla concentrazione prevista. Vortice gli spermatozoi diluiti per 10 secondi a 700 rotazioni al minuto. Quindi, immergere una cassetta SP1 nel campione e deprimere completamente lo stantuffo bianco per aspirare un'aliquota del campione nella cassetta.Quindi posizionare la cassetta nel vassoio del citometro dell'immagine ed eseguire il test delle cellule spermatozoi umane macchiate PI in base al fattore di diluizione applicato. Per misurare i cambiamenti nella concentrazione di calcio intracellulare libera, pipettare delicatamente il campione di sperma su e giù una volta e utilizzare una pipetta ripetuta automatica per aliquota 50 microlitri di spermatozoi macchiati di fluoroforo a 24 pozzi di una fila di una piastra di pozzo da 384 micro. Posizionare la micro piastra del pozzo nel lettore di piastre a fluorescenza a 30 gradi Celsius e selezionare il protocollo appropriato per il fluorofore.Selezionare un pozzo nella fila di spermatozoi e regolare il guadagno su un valore target del 20%Quindi iniziare la misurazione. Dopo 10 cicli di base, sospendere l'esperimento ed espellere il cassetto con la micro piastra del pozzo. Utilizzando una pipetta a 12 canali, aggiungere rapidamente 25 microlitri delle soluzioni preparate di composti e controlli di interesse nei 12 pozzi duplicati nella fila e restituire immediatamente la piastra al lettore per continuare la misurazione il più rapidamente possibile.Eventuali cambiamenti nella fluorescenza in risposta all'aggiunta dei composti o dei controlli saranno catturati dallo strumento. Per l'analisi della reazione acrosoma, dopo aver incubato le cellule spermatiche condensate con i coloranti, i composti o i controlli fluorescenti appropriati, mescolare i campioni con pipettazione e aggiungere 50 microlitri di ciascun campione di prova a 100 microlitri di soluzione immobilizzante. Mescolare nuovamente i campioni e caricare le camere di un vetrino A2 per campione con circa 30 microlitri di campione per camera.Quindi posizionare la prima diapositiva caricata sul vassoio del citometro dell'immagine. Selezionare il protocollo FlexiCyte e premere Esegui. Qui si possono osservare risultati rappresentativi di un esperimento che testa l'effetto di quattro composti, un controllo positivo del progesterone e un controllo tampone negativo utilizzando il saggio di segnalazione del calcio a velocità media come dimostrato.In questo grafico viene mostrata una curva di risposta alla dose del progesterone derivata dalle variazioni percentuali di picco nella concentrazione di calcio libero intracellulare indotta dalla concentrazione diluita serialmente di progesterone. Questi dati illustrano gli effetti di uno o uno dei due controlli positivi sull'induzione di una reazione acrosoma negli spermatozoi umani condensati in un saggio di reazione acrosoma acrosoma a media produttività. Per evitare di perdere i picchi dei segnali indotti, è fondamentale aggiungere rapidamente le sostanze chimiche ai pozzi di replicazione e continuare immediatamente la misurazione in seguito.Cambiando il tipo di fluorofori e coloranti, i nostri test possono essere facilmente modificati per rispondere a diverse domande scientifiche. Questi saggi sono già stati utilizzati in diversi studi per testare grandi gruppi di composti per i loro effetti sulla funzione spermatica umana.

Research

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