Name: medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm at JoVE.com

Авторы хотели бы признать лаборатории Timo Strünker по надзору за AR и DLE во время их пребывания в его лаборатории. Кроме того мы хотели бы поблагодарить наших коллег в Департаменте рост и размножение, Копенгагенской университетской больницы, Rigshospitalet за их помощь в создании этих двух анализов. Эта работа была поддержана субсидии от Дании инновационный фонд (Грант № 005-2010-3 и 14-2013-4).

Сбор и анализ образцов человеческой спермы в протоколах соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований столицы региона Дании. Все образцы спермы были получены после информированного согласия от безвозмездных доноров. После родов образцы были полностью анонимным...

Средняя пропускная способность Ca2 + сигнализации что проба основана на измерениях флуоресценции от одного microwells содержит около 250.000 клеток спермы. В среднем захваченного сигнала от всех отдельных клеток спермы в колодец. Assay таким образом обеспечивает что никакой пространственно...

Цель двух анализов, описанные здесь является изучить воздействие на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы, как уже было показано для нескольких соединений в ряде публикаций, используя эти assays1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-сигнализации и Акросома реакции являются жизненно важное значение для нормального человека сперматозоид функцию и плодовитость мужчины.
Общая цель клетки спермы человека заключается в том, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Чтобы иметь возможность успешно и естественно оплодотворить яйцеклетку, функции клетки спермы должно регулироваться плотно во время путешествия сперматозоид через женского репродуктивного тракта8,9. Многие из функций клеток спермы регулируются через внутриклеточные Ca2 +-концентрация [Ca2 +]я (например, спермы моторики, хемотаксис и Акросома реакции)10. Кроме того процесс созревания, называется капацитации, который оказывает сперматозоид способен подкормки яйцо, это частично регулируется [Ca2 +],я10. CA2 +-экструзия Ca2 +-АТФазы насосы11 поддерживать приблизительно 20.000 раза Ca2 +-градиента над человеческой спермы клеточной мембраны, с отдыха [Ca2 +]я 50-100 Нм. Если Ca2 + разрешается пересекать клеточной мембраны (например, путем открытия Ca2 +-каналы), значительный приток Ca2 + происходит, что приводит к высоте [Ca2 +]я. Однако, также носит сперматозоид внутриклеточных Ca2 +-магазины, которые могут освободить Ca2 + и, таким образом, также дать подняться над уровнем моря [Ca2 +]я12. Интересно, что все канал опосредованной Ca2 +-приток в клетках человека спермы до настоящего времени были найдены происходят через CatSper (Catионный канал Sperm), который только выражается в сперматозоиды11. В клетках человека спермы, CatSper активируется эндогенные лиганды прогестерона и простагландинов через собственный лигандом привязки сайтов13,14,15, приводит к быстрому Ca2 +-приток в сперматозоид. Два основных источника возле яйца обеспечивают высокий уровень эти эндогенные лиганды. Один является фолликулярная жидкость, которая содержит высокий уровень прогестерона16. Фолликулярная жидкость освобождается от зрелых фолликулов вместе с яйцо в овуляции и смешивается с жидкостью в пределах яйцеводов17. Другим основным источником является кучевые клетки, которые окружают яйцо и освободить высокий уровень прогестерона и простагландинов. Прогестерон индуцированной Ca2 +-приток в клетки спермы было показано посредником хемотаксис к яйцо9,18, контролировать19,подвижности сперматозоидов20 и стимулировать Акросома 21реакция. Срабатывание этих отдельных [Ca2 +]я-регулируемые спермы функций в правильном порядке и в нужное время имеет решающее значение для оплодотворения яйцеклетки8. В соответствии с этим, субоптимальный прогестерон индуцированной Ca2 +-приток был найден ассоциируется с снижением мужской фертильности22,23,24,25,26 ,27,,2829 и функциональных CatSper имеет важное значение для мужской плодовитости26,30,,3132, 33,34,35,36.
Как сперматозоиды достигают яйцо, последовательность событий должны иметь место для оплодотворение происходит: 1 клетки спермы должны проникнуть окружающие отель cumulus слоя клеток, 2) привязки к zona pellucida, 3) exocytose акросомной содержание, так называемый Акросома реакции 37, 4) проникают zona pellucida и 5) предохранитель с яйцо мембраны для завершения оплодотворение38. Чтобы иметь возможность пройти через эти шаги и оплодотворить яйцеклетку, сперматозоид должны сначала пройти капацитации11, которая начинается как клетки спермы оставить семенной жидкости, содержащие «decapacitating» факторов39 и плавать в жидкости самка репродуктивного тракта с высоким уровнем бикарбоната и альбумина37. Капацитации выносит сперматозоиды могут пройти гиперактивацию, форма подвижности с энергичной избиение жгутика, и Акросома реакции37. Гиперактивными подвижности требуется для проникновения в zona pellucida40, и Акросома содержит различные гидролитических ферментов, которые помогают этот процесс проникновения41. Кроме того реакция Акросома отрисовывает клетки спермы, способных слияния с яйцом, подвергая конкретных мембранных белков на поверхности сперматозоидов необходимых для спермы яйцо фьюжн42. Следовательно, возможность пройти гиперактивацию и Акросома реакции, так необходимых для успешного оплодотворения яйцеклетки40,42. Вопреки тому, что видел для мыши сперматозоиды43,,4445только человеческие сперматозоиды, которые сохранились Акросома можно привязать к zona pellucida46. Когда человека клетки спермы привязаны к zona pellucida, они должны пройти Акросома реакции как проникнуть вителлинового41 , так и для предоставления конкретных мембранных белков, которые необходимы для синтеза с яйцо38. Таким образом, время реакции Акросома в человеческой спермы имеет решающее значение для оплодотворение произойти.
Как описано выше, Ca2 +-сигнализации имеет жизненно важное значение для нормальной спермы функция8, и это, следовательно, большой интерес для экрана большого числа соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческих клеток спермы. Точно так же как только человеческие сперматозоиды, которые проходят Акросома реакции в нужное время и место может проникнуть вителлинового и оплодотворить яйца46,47, это также большой интерес, чтобы иметь возможность проверить соединения на их способность влияет на Акросома реакции в человеческой спермы. С этой целью, описаны два скрининга средне-пропускная способность анализов: 1) assay для воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческие сперматозоиды и 2) assay для получения возможности побудить Акросома реакции в человеческих клеток спермы.
Проба 1 является средне-пропускная способность Ca2 +-сигнализации assay. Этот метод на основе чтения флуоресценции пластины отслеживает изменения в флуоресцировании как функцию от времени одновременно в нескольких скважин. Ca2 +-чувствительных Люминесцентную краску, Fluo-4 имеет Kd для Ca2 +≈ 335 Нм и клеток permeant в форме Эстер AM (acetoxymethyl). С помощью флуоресцентного-4, это можно измерить изменения в [Ca2 +]я со временем и после добавления соединений, представляющих интерес для клеток спермы. Проба была разработана лабораторией Timo Strünker в 201113 и с тех пор был использован в нескольких исследованиях на экране соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческой спермы1,2,3, 4,5. Также подобный метод использовался для экран несколько наркотиков кандидатов48. Кроме того этот assay также полезна для оценки режима фармакологических действий1,2,3,4,5,, доза реакция кривых1 2,3,4,5, конкурентного ингибирования1,2, аддитивности1,2и3 синергизм соединений, представляющих интерес.
Проба 2 относится средне-пропускная способность Акросома реакции. Этот метод на основе цитометр изображения измеряет количество жизнеспособных отреагировали Акросома сперматозоидов в выборке, используя три Краски люминесцентные, флуоресцентные: пропидий йодидом (PI), FITC-сочетании Лектин Pisum sativum (FITC-PSA) и Hoechst 33342. Проба была изменена от аналогичного метода на основе цитометрии потока Zoppino et al.49 и был использован в нескольких исследованиях6,7. Что касается Ca2 +-сигнализации пробирного, этот assay Акросома реакция может также использоваться для оценки доза реакция кривых, ингибирование, аддитивности и синергизм соединений, представляющих интерес.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m pore filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>296-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L measuring cylinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>3662-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4 and 2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>30120086 and 0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4861000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Germany</td>
			<td>781096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 and 50 mL platic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>0030122151 and 30122178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2-slide</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>942-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4987000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean wide-mouthed plastic container for semen sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>For addition to HTF+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-3000 image cytometer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>970-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and piptting tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45&#176; angle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100 buffer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP1-cassette</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>941-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks of appropriate sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm

CA2 +-сигнализации имеет важное значение для функции нормальных клеток спермы и мужской фертильности. Аналогично реакция Акросома имеет жизненно важное значение для способности человека сперматозоид проникает вителлинового и оплодотворить яйцеклетку. Именно поэтому представляет большой интерес для проверки соединений (например, экологические химических веществ или наркотиков кандидатов) за их влияние на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы либо для изучения потенциального неблагоприятного воздействия на человека сперматозоид функции или для изучения возможной роли в качестве средства контрацепции. Здесь описаны два анализов средне-пропускная способность: 1) на основе флуоресценции assay для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческой спермы и 2) изображения гранулярных assay для оценки реакции Акросома в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экран большое количество соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Кроме того анализов может использоваться для создания узкоспециализированных доза реакция кривых индивидуальных соединений, определить потенциальные аддитивности/синергизм для соединения двух или более и для изучения режима фармакологических действий путем конкурентного ингибирования эксперименты с ингибиторами CatSper.

Представитель результаты эксперимента, тестирование эффект 4 соединений (A, B, C и D) вместе с положительным (Прогестерон) и отрицательной (буфер) управления на [Ca2 +]я в человеческой спермы с использованием средне-пропускная способность Ca2 +-сигнализации п...

Watch this Scientific Journal Video about Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm at JoVE.com

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Средне-пропускная способность, отбор проб для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы

Здесь, две средних-пропускная способность анализов для оценки воздействия на Ca2 +-описаны сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экрана быстро и легко большое количество соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы.

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Наши анализы могут быть использованы для проверки соединений на их влияние на функцию сперматозоидов человека. В частности, эти методы могут быть использованы для быстрого и легкого проверки большого количества соединений для их воздействия на сигнализацию кальция и акросомную реакцию в клетках спермы человека. Визуальные демонстрации этого метода упростит другим проведение подобных экспериментов в собственных лабораториях.Начните с размещения одной 50 миллилитров трубки на один миллилитр сырой образец спермы в трубку стойку под углом 45 градусов и добавить четыре миллилитров 37 градусов по Цельсию человеческой тубали жидкости или HTF положительной среде каждой трубки. Далее, тщательно пипетка один миллилитр ликуется образца спермы на дно каждой трубки и место труб при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. В конце инкубации используйте модифицированный наконечник пипетки, удерживаемый под углом 45 градусов, чтобы аккуратно перенести как можно большую часть верхней доли подвижной сперматозоидов, содержащей положительную среду HTF, в новую пластиковую трубку объемом 15 миллилитров.Чтобы подсчитать собранные сперматозоиды, разбавить 20 микролитр aliquot в 10, 20, 30, 50 или 90 в буфере S100 в круглой нижней два миллилитров трубки в соответствии с ожидаемой концентрацией. Вихрь разбавленных сперматозоидов в течение 10 секунд при 700 вращениях в минуту. Затем погрузите кассету SP1 в образец и полностью угнетайте белый поршень, чтобы аспирировать алицит образца в кассету.Затем поместите кассету в лоток цитометра изображения и запустите анализ окрашенных клеток спермы ИП в соответствии с применяемым фактором разбавления. Для измерения изменений в свободной внутриклеточной концентрации кальция, мягко пипетки образца спермы вверх и вниз один раз и использовать автоматический ретранслятор пипетки для aliquot 50 микролитров флюорофора окрашенных сперматозоидов до 24 скважин одного ряда 384 микро пластины скважины. Поместите микро-пластину в считыватель пластин флуоресценции при 30 градусах по Цельсию и выберите соответствующий протокол для флюорофора.Выберите колодец в ряду сперматозоидов и отрегулируйте выигрыш до целевого значения 20%Затем начните измерение. После 10 базовых циклов, приостановить эксперимент и извлечь ящик с микро пластины хорошо. Используя трубу из 12 каналов, быстро добавьте 25 микролитров подготовленных растворов соединений и элементов управления, представляющих интерес, в 12 дублирующих скважин в ряду и немедленно верните пластину читателю, чтобы продолжить измерение как можно быстрее.Любые изменения флуоресценции в ответ на добавление соединений или элементов управления будут захвачены прибором. Для анализа акросомной реакции, после инкубации емкости сперматозоидов с соответствующими флуоресцентными красителями, соединениями или элементами управления, смешайте образцы с помощью пипетки и добавьте 50 микролитров каждого тестового образца в 100 микролитров иммобилизирующего раствора. Смешайте образцы снова и загрузить камеры одного слайда A2 на образец с примерно 30 микролитров образца на камеру.Затем поместите первый загруженный слайд на лоток цитометра изображения. Выберите протокол FlexiCyte и нажмите Run. Здесь репрезентативные результаты эксперимента тестирования эффекта четырех соединений, положительный контроль прогестерона и отрицательный контроль буфера с использованием средней пропускной способности кальция сигнализации анализ, как попродемонстрировано, можно наблюдать.На этом графике показана кривая реакции дозы прогестерона, полученная из пиковых процентных изменений внутриклеточной свободной концентрации кальция, вызванных последовательно разбавленной концентрацией прогестерона. Эти данные иллюстрируют влияние одного отрицательного или одного из двух положительных элементов управления на индукцию акросомной реакции в емкости клеток спермы человека в средней пропускной способности акросомной реакции анализа. Чтобы не пропустить пики индуцированных сигналов, крайне важно быстро добавить химические вещества в реплику скважин и немедленно продолжить измерение после этого.Изменяя тип фторфоров и красителей, наши анализы могут быть легко изменены, чтобы ответить на различные научные вопросы. Эти анализы уже были использованы в нескольких исследованиях, чтобы проверить большие группы соединений для их воздействия на функцию спермы человека.

Research

JoVE Journal

Biology

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Мониторинг Акупунктура Влияние на Мозга человека на МРТ

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Методы для работы с изображениями Ca 2 + Сигнализация в человеческой спермы

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Два типа Анализы для обнаружения Chemoattraction спермы лягушки

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Визуализация сосудистой Са 2 + Сигнализация Срабатывание паракринной Производные ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Сопоставление После эффектов Theta всплеск раздражения на человека слуховой коры с функциональной визуализации

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Токсикологические анализы для тестирования воздействию эпигенетические препарата на развития, плодовитость и выживаемость малярийных комаров

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Метод оценки воздействия диапазоне длин волн и интенсивностей красный / ближней инфракрасной световой терапии на окислительного стресса<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Количественное эндотелиальных клеток адгезивностью<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...