Name: medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm at JoVE.com

Författarna vill erkänna labbet av Timo Strünker för övervakning av AR och DLE under sina vistelser på hans labb. Dessutom vill vi tacka våra kolleger på avdelningen för tillväxt och reproduktion, Köpenhamn universitetssjukhus, Rigshospitalet för deras hjälp med att sätta upp dessa två analyser. Detta arbete stöds av bidrag från Innovationsfonden Danmark (grant nummer 005-2010-3 och 14-2013-4).

Insamling och analys av human sädesvätska prover i protokollen följer riktlinjerna i den forskningsetisk kommitté av Danmarks huvudstad regionen. Alla sperma prov har erhållits efter informerat samtycke från frivilliga givare. Efter leverans, var proverna helt anonymiserade. Varje givare fått en avgift på 500 DKK (ca $75 US-dollar) per prov för sina besvär. Proverna analyseras samma dag som leverans och sedan förstöras omedelbart efter laboratorieförsök.
Obs: Medium genomströmni...

Den medelstora genomströmning Ca2 + signalering analysen baseras på mätningar av fluorescens från enda mikrobrunnar varje innehållande omkring 250.000 sädesceller. Fångade signalen är i genomsnitt från alla enskilda sädesceller i brunnen. Analysen ger således ingen rumslig information om var specifikt i den spermie [Ca2 +]jag har ändrats, i hur stor andel av de spermier som en förändring i [Ca2 +]jag äger rum, eller hur heterogena svar är mellan de en...

Syftet med de två analyser som beskrivs här är att undersöka påverkan på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänsklig sperma, som har visats för flera föreningar i flera publikationer anställa dessa analyser1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalering och akrosomen reaktionen är både viktigt att normala mänskliga spermie funktion och manlig fertilitet.
Det övergripande målet för en mänsklig spermie är att befrukta ägget. För att kunna framgångsrikt och naturligt befrukta ägget, måste funktioner i cellen spermier regleras ordentligt under resan av spermier cellen genom den kvinnliga genitalia8,9. Många av funktionerna spermie regleras via den intracellulära Ca2 +-koncentration [Ca2 +]jag (t.ex. spermier motilitet, Kemotaxis och akrosomen reaktion)10. En mognadsprocess som kallas capacitation, som återger spermie som gödning ägget, är också delvis reglerat av [Ca2 +]jag10. Ca2 +-strängpressning Ca2 +-ATPas pumpar11 upprätthålla ett ungefärligt 20.000 gånger Ca2 +-gradient över mänskliga spermier cellmembranet, med en vilande [Ca2 +]jag 50-100 Nm. Om Ca2 + tillåts korsa cellmembranet (t.ex. genom öppnandet av Ca2 +-kanaler), ett betydande inflöde av Ca2 + uppstår, ger upphov till en höjd av [Ca2 +]jag. Dock spermie också bär intracellulära Ca2 +-butiker, som kan frigöra Ca2 + och, därför, också ger upphov en höjd av [Ca2 +]i12. Intressant, alla kanal-medierad Ca2 +-inflöde i mänskliga spermaceller har hittills konstaterats för att ske via CatSper (CatJoniska kanal SpeRM), som uttrycks endast i spermierna11. I mänskliga spermaceller, CatSper aktiveras av endogena ligander progesteron och prostaglandiner genom distinkta ligand bindande platser13,14,15, leder till en snabb Ca2 +-inflöde till cellen spermier. Två huvudsakliga källor nära ägget ger höga nivåer av dessa endogena ligander. En är den follikulära vätska som innehåller höga halter av progesteron16. Den follikulära vätskan frigörs från mogna folliklar tillsammans med ägget vid ägglossningen och mixar med vätska inom den oviducts17. Andra huvudkällan är den cumulus celler som omger ägget och släppa höga nivåer av progesteron och prostaglandiner. Progesteron-inducerad Ca2 +-inflöde i spermacellerna har visat att medla chemotaxis mot ägg9,18, kontrollera spermier motilitet19,20 och stimulera akrosomen reaktion21. Utlösning av dessa enskilda [Ca2 +]jag-reglerade spermier funktioner i rätt ordning och vid rätt tidpunkt är avgörande för befruktning av ägg8. I linje med detta, en suboptimal progesteron-inducerad Ca2 +-inflöde har hittats ska associeras med minskad fertilitet22,23,24,25,26 ,27,28,29 och funktionella CatSper är avgörande för manlig fertilitet26,30,31,32, 33,34,35,36.
Som spermacellerna nå ägget, ett händelseförlopp måste äga rum för befruktning att inträffa: (1) spermacellerna måste penetrera det omgivande cumulus celllagrar, 2) binder till zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innehåll, så kallade akrosomen reaktionen 37, 4) penetrera zona pellucida och 5) säkring med ägg membranet att slutföra befruktning38. För att kunna gå igenom dessa steg och befrukta ägget, måste spermie först genomgå capacitation11, som börjar som spermacellerna lämnar sädesvätskan som innehåller ”decapacitating” faktorer39 och simma in i vätskorna av kvinnliga fortplantningsorganen med höga nivåer av bikarbonat och albumin37. Capacitation återger spermacellerna kan genomgå en överaktivering, en form av motilitet med kraftig stryk av Flagellen och akrosomen reaktion37. Hyperactivated motilitet krävs för genomträngningen av zona pellucida40, och akrosomen innehåller olika Hydrolytiska enzymer som stöd denna penetration processen41. Dessutom återger akrosomen reaktionen spermacellerna kan fusing med ägg genom att exponera specifika membranproteiner på spermier ytan krävs för sperma-ägg fusion42. Möjligheten att genomgå överaktivering och akrosomen reaktion är följaktligen båda krävs för framgångsrik befruktning av ägg40,42. Tvärtemot vad har setts för mus sädesceller43,44,45, kan endast mänskliga spermaceller som är akrosomen-intakt binda till de zona pellucida46. När de mänskliga spermacellerna är bundna till zona pellucida måste de genomgå akrosomen reaktionen både penetrera zona pellucida41 och att exponera specifika membranproteiner som behövs för att fusionen med det ägg38. Tidpunkten för akrosomen reaktionen i mänskliga spermier är således avgörande för befruktning ska ske.
Som beskrivits ovan, Ca2 +-signalering är avgörande för normala spermier cell funktion8, och det är därför av stort intresse att kunna skärmen ett stort antal föreningar för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermaceller. På samma sätt som bara mänskliga spermaceller som genomgår akrosomen reaktion vid rätt tid och plats kan penetrera zona pellucida och gödsla den ägg46,47, är det också av stort intresse för att kunna testa föreningar för sin förmåga att påverka akrosomen reaktionen i mänskliga spermier. I detta syfte beskrivs två medium-throughput screening analyser: 1) test för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermaceller, och 2) test för förmågan att inducera akrosomen reaktion i mänskliga spermaceller.
Analys 1 är en medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay. Denna fluorescens plate reader-baserad teknik övervakar ändringar i fluorescens som funktion av tiden samtidigt i flera brunnar. Den Ca2 +-känsliga fluorescerande färgämne, Fluo-4 har en K-d för Ca2 +≈ 335 nM och är cell-diffusionskoefficient i AM (acetoximetyl) ester form. Med Fluo-4, är det möjligt att mäta förändringar i [Ca2 +]i över tid och efter tillsats av föreningar av intresse för spermacellerna. Analysen har utvecklats av labbet av Timo Strünker 201113 och har sedan använts i flera studier att skärmen föreningar för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermier1,2,3, 4,5. En liknande metod har också använts till skärmen flera drog kandidater48. Dessutom är denna analys också användbart för att bedöma på farmakologiska verkningssätt åtgärd1,2,3,4,5, DOS-respons kurvor1, 2,3,4,5, kompetitiv hämning1,2, additivitet1,2och synergism3 av föreningar av intresse.
Analysen 2 är en medium-genomströmning akrosomen reaktion analysen. Denna bild cytometer-baserad teknik mäter mängden livskraftig akrosomen reagerade sädesceller i ett prov, med tre fluorescerande färger: propidium jodid (PI), FITC-kopplade lektin Pisum sativum (FITC-PSA) och Hoechst-33342. Analysens ändrades från ett liknande flöde flödescytometri-baserade metoden av Zoppino et al.49 och har använts i flera studier6,7. När det gäller de Ca2 +-signalering assay, denna akrosomen reaktion analys kunde också användas för att bedöma dos-responskurvor, hämning, additivitet och synergier av föreningar av intresse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m pore filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>296-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L measuring cylinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>3662-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4 and 2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>30120086 and 0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4861000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Germany</td>
			<td>781096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 and 50 mL platic tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>0030122151 and 30122178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2-slide</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>942-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>4987000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean wide-mouthed plastic container for semen sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>For addition to HTF+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-3000 image cytometer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>970-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and piptting tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45&#176; angle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100 buffer</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>910-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP1-cassette</td>
			<td>ChemoMetec, Denmark</td>
			<td>941-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks of appropriate sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-throughput screening assays for assessment of effects on ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm

Ca2 +-signalering är nödvändig för normal spermie funktion och manlig fertilitet. Likaså är akrosomen reaktionen avgörande för möjligheten för en mänsklig spermie att penetrera zona pellucida och befrukta ägget. Det är därför av stort intresse att testa föreningar (t.ex. miljö kemikalier eller läkemedelskandidater) för sin effekt på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier antingen att undersöka de potentiella negativa effekterna på människors spermie funktion eller att undersöka en möjlig roll som preventivmedel. Här beskrivs två medium-kapacitet idag: 1) en fluorescens-baserad analys för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering i mänsklig sperma och 2) en bild flödescytometrisk analys för bedömning av akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessa analyser kan användas för att screena ett stort antal föreningar för effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessutom kan analyserna användas för att generera mycket specifika dos-responskurvor för enskilda föreningar, bestämma potentiella additivitet/synergier för två eller flera föreningar, och att studera farmakologiska verkningsmekanism genom kompetitiv hämning experiment med CatSper-hämmare.

Representativa resultat från experiment testa effekten av 4 föreningar (A, B, C och D) tillsammans med en positiv (progesteron) och negativa (buffert) kontroll på [Ca2 +]jag i mänskliga spermier med hjälp av medium-genomströmning Ca2 +-signalering analysen kan ses i figur 4a. I figur 4bvisas en dos-responskurva av progesteron, som härrörde från peak ΔF/F0 (%) data som inducera...

Watch this Scientific Journal Video about Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm at JoVE.com

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier

Här, två medium-genomströmning analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier beskrivs. Dessa analyser kan användas för att snabbt och enkelt skärmen stora mängder föreningar för effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier.

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Våra analyser kan användas för att testa föreningar för deras effekter på mänskliga spermier cell funktion. Specifikt, dessa metoder kan användas för att snabbt och enkelt skärmen stort antal föreningar för deras effekter på kalcium signalering och acrosome reaktion i mänskliga spermier. Visuella demonstrationer av denna metod kommer att göra det lättare för andra att ställa in liknande experiment i sina egna laboratorier.Börja med att placera ett 50 milliliterrör per en milliliter rå spermaprov i ett rörställ i 45 graders vinkel och tillsätt fyra milliliter med 37 grader Celsius Human Tubal Fluid eller HTF-positivt medium till varje rör. Därefter försiktigt pipettera en milliliter liquified spermaprov till botten av varje rör och placera rören på 37 grader Celsius i en timme. I slutet av inkubationen, använd en modifierad pipettspets som hålls i 45 graders vinkel för att försiktigt överföra så mycket av den övre fraktionen av motilspermicell som innehåller HTF-positivt medium som möjligt till ett nytt 15 milliliter plaströr.För att räkna de insamlade spermierna, späd en 20 microliter alikvot till en faktor 10, 20, 30, 50, eller 90 i S100 buffert i en rund botten två milliliter rör enligt den förväntade koncentrationen. Vortexa de utspädda spermacellerna i 10 sekunder vid 700 rotationer per minut. Därefter, sänk ner en SP1-kassett i provet och helt tryck ned den vita kolven för att aspirera en alikvot av provet i kassetten.Placera sedan kassetten i bildcytmeterbrickan och kör PI-fläckad spermiecellsanalys för människa enligt den tillämpade utspädningsfaktorn. För att mäta förändringar i den fria intracellulära kalciumkoncentrationen, försiktigt pipettera spermieprovet upp och ner en gång och använd en automatisk repeaterpipett till alikvoter 50 mikroliter av fluorofafärgade spermier till 24 brunnar av en rad av en 384 mikro brunnsplatta. Placera mikro brunnsplattan i fluorescensplattans läsare vid 30 grader Celsius och välj lämpligt protokoll för fluorofor.Välj en brunn i raden med spermier och justera förstärkningen till ett målvärde på 20%Starta sedan mätningen. Efter 10 baslinje cykler, pausa experimentet och mata ut låda med mikro väl plattan. Med hjälp av en 12 kanals pipett, snabbt lägga till 25 mikroliter av de beredda lösningar av föreningar och kontroller av intresse i de 12 duplicera brunnarna i raden och omedelbart tillbaka plattan till läsaren för att fortsätta mätningen så snabbt som möjligt.Eventuella förändringar i fluorescens som svar på tillsats av föreningarna eller kontrollerna kommer att fångas upp av instrumentet. För acrosome reaktionsanalys, efter inkubering av de kapaciterade spermierna med lämpliga fluorescerande färgämnen, föreningar eller kontroller, blanda proverna genom pipettering och tillsätt 50 mikroliter av varje testprov till 100 mikroliters av immobiliserande lösning. Blanda proverna igen och ladda kamrarna i en A2-glid per prov med cirka 30 mikroliter prov per kammare.Placera sedan den först laddade bilden på brickan på bildcytometern. Välj FlexiCyte-protokollet och tryck på Kör. Här representativa resultat från ett experiment testa effekten av fyra föreningar, en positiv progesteron kontroll och en negativ buffert kontroll med hjälp av medium genomströmning kalcium signalering assay som visat kan observeras.I detta diagram visas en dosresponskurva av progesteron som härletts från toppprocentförändringar i den intracellulära fria kalciumkoncentrationen som induceras av seriellt utspädd koncentration av progesteron. Dessa data illustrerar effekterna av en negativ eller en av två positiva kontroller på induktion av en acrosome reaktion i kapaciterade mänskliga spermier i ett medium genomströmning acrosome reaktion assay. För att undvika att missa topparna på de inducerade signalerna är det viktigt att snabbt lägga till kemikalierna i de replika brunnarna och att omedelbart fortsätta mätningen därefter.Genom att ändra typ av fluoroforer och färgämnen kan våra analyser enkelt modifieras för att besvara olika vetenskapliga frågor. Dessa analyser har redan använts i flera studier för att testa stora grupper av föreningar för deras effekter på människors spermier funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Övervakning Akupunktur Effekter på Human Brain av fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Tekniker för Imaging Ca 2 + Signalering i mänskliga spermier

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Två typer av analyser för att upptäcka Frog spermier Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering av Vascular Ca 2 + Signalering Triggade av parakrina Härledda ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Kartläggning av efterverkningarna av Theta skurstimuleringen om den mänskliga hörselbarken med funktionella Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Toxikologiska Analyser för Testing Effekter av en epigenetisk Drug för utveckling, Fruktsamhet och Survivor av malariamyggor

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Metod för bedömning av effekterna av ett intervall av våglängder och intensiteter från Red / nära infraröda Ljusterapi på oxidativ stress<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifiering av endotelceller Vidhäftnings<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Kanalförbindelse kommunikationen mellan: En funktionell Biomarker att bedöma biverkningar av gifter och toxiner, och hälsoeffekterna av naturliga produkter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...