Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها ماليا JSPS كاكينهي (ح 18 04765) وبرنامج لنشر نظام المسار الحيازة، يأمرون، واليابان.

1-تصنيع الجهاز المكعب هلام المختلطة
<ol><li>إعداد إطار مكعب البولي (PC) أما باستخدام عملية القطع أو طابعة 3D. حجم الإطار جهاز الكمبيوتر يعتمد على حجم العينة. في هذه الدراسة، استخدمنا إطار 5 مم على كل جانب حتى أن كانت الفروع مساحة كافية تمديد خلال استزراع.</li>
	<li>وضع إطار الكمبيوتر على شريحة زجاجية ...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

الطريقة المعروضة في هذه الورقة هو بسيط ويمكن أن يؤديها دون معدات التكنولوجيا العالية. وفي الوقت نفسه، يمكن الحصول على نتيجة عنصر تحكم شكل كتلة خلية دقيقة في الفضاء ثلاثي الأبعاد للمائية. بعد مراقبة أولية، يمكن أن تنمو الخلايا في الوراثة قدر ما هم مثقف على طبق. يتم إجراء تصوير متعددة الاتجا...

إلى حد كبير هو التأكيد على أهمية ثقافة 3D، الذي يحاكي البيئات البيولوجية أفضل من لا ثقافة 2D، في خلية/الأنسجة الثقافة1،،من23. التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) يوفر إشارات هامة بخصوص morphogenesis4،5. يمكن أن تظهر العديد من تشكيلات الأنسجة إلا في ظل بيئات ثلاثية الأبعاد، مثل عملية قابلة للطي6،7، إينفاجينيشن8، وتشكيل أنبوبي9،10. ومع ذلك، منع العديد من المصاعب الباحثين من التحول إلى تجارب 3D من تجارب 2D على طبق. واحدة من الصعوبات الرئيسية في تجارب 3D هو مسألة التصوير عينات ثلاثية الأبعاد. بالمقارنة مع تجارب مستو، الحصول على صور ثلاثية الأبعاد المناسبة لا تزال صعبة في كثير من الحالات. على وجه الخصوص، الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد مناسبة مهمة صعبة عندما يصل حجم العينة مجموعة ملليمتر نظراً لعمق تركيز كبير من عدسات التكبير المنخفض. على سبيل المثال، يصل عمق التنسيق إلى أكثر من 50 ميكرومتر عندما يستخدم من 10 x عدسة التكبير بينما حجم الخلية واحد هو عادة أقل من 10 ميكرون. لتحسين نوعية التصوير، يجري تطوير نظم الفحص المجهري التكنولوجيا العالية (مثلاً، مجهرية اثنين-فوتون11 و نظام الفحص المجهري الضوء-ورقة12)، ولكن محدودة بسبب أسعارها غالية الإتاحة الخاصة بهم. وكبديل لذلك، قد سبق أن وضعت مختلطة هلام مكعب (الوراثة) جهاز13. الجهاز يتكون من نوعين من الهلاميات المائية: [اغروس] هلام دعم وإدارة المحتوى في المؤسسة مثل الكولاجين أو ماتريجيل كهلام ثقافة. الوراثة يسمح لنا بجمع العينة خلال استزراع وتدوير المكعب لتحقيق تصوير متعددة الاتجاهات، الذي يعالج مشكلة العمق البؤري14.
وهناك صعوبة أخرى في تجارب 3D هو على التكرار المنخفض نظراً لقابلية التحكم الفقراء من بيئات 3D. خلافا لثقافة المستوية في طبق بلاستيك، تحدث الاختلافات في الظروف الأولية الثقافة بسهولة في الفضاء 3D محاطة بمادة ناعمة. تباين كبير في النتائج التجريبية تتدهور التحليل التالي وأقنعة الآليات الكامنة. وقد وضعت العديد من التقنيات الهندسية مكانياً محاذاة الخلايا المفردة، مثل بيوبرينتينج،من1516، ألياف النسيج17و18من السقالات، ولكنها تتطلب تجهيزها معقدة أو على وجه التحديد معدات مصممة. وفي المقابل، قمنا بتطوير منهجية لتحقيق المحاذاة لخلية ثلاثية الأبعاد في الوراثة19.
في هذا البروتوكول، يتضح أننا إجراء بسيط مع المعدات المستخدمة عادة للتحكم في الشكل الكتلة الخلية الأولى ثلاثية الأبعاد في الوراثة. أولاً، قد أظهرت عملية التصنيع الوراثة. ثم وضعت ميكرومولدس ملفقة بالطباعة الحجرية التصويرية أو عملية القطع في الوراثة لإنتاج جيب بشكل تعسفي في إدارة المحتوى في المؤسسة. لاحقاً، تم حقن الخلايا عالية الكثافة بعد الطرد المركزي في الجيب للتحكم في شكل الكتلة الخلية الأولى في الوراثة. يمكن تصويرها الكتلة الخلية التي تسيطر عليها تحديداً من اتجاهات عديدة بسبب الوراثة. واستخدمت العادي البشرية الشعب الهوائية (نهبي) الخلايا الظهارية لإثبات السيطرة على شكل كتلة الخلية الأولى والتصوير من الفروع من اتجاهات متعددة لتعزيز نوعية التصوير.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

إلى حد كبير هو التأكيد على أهمية الثقافات 3D في المختبر في زراعة الخلية/الأنسجة. ومع ذلك، عدم التكرار تجريبية واحدة من قيودها. نتائج قابلة للتكرار قليل من تشكيل نمط تتدهور تحليل الآليات الأساسية للتنظيم الذاتي. الحد من التفاوت في شروط الثقافة الأولية، مثل كثافة الخلية والتوزيع في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر حاسم لتعزيز التكرار ثقافة 3D. في هذه المقالة، نبدي إجراء بسيطة لكنها قوية للتحكم في شكل الكتلة الخلية الأولى في 3D مصفوفة خارج الخلية للحصول على تشكيلات نمط التكرار عالية. كانت مختلقة من ميكرومولد بشكل المطلوب باستخدام الطباعة الحجرية التصويرية أو عملية القطع، وأنها شكلت جيب 3D في المحتوى الوارد في مكعب هلام مختلطة (الوراثة). ثم تم حقن الخلايا مركزة للغاية في الجيب حيث أن الشكل الكتلة الخلية المتطابقة مع الشكل العفن ملفقة. الوراثة حسابهم يسمح متعددة الاتجاهات المسح بها التناوب، مما مكن تصوير عالي الدقة والقبض على هيكل الأنسجة كاملة حتى ولو كان يستخدم عدسة التكبير المنخفض. واستخدمت الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان العادي لتبين المنهجية.

واستخدمت العادية البشرية الشعب الهوائية (نهبي) الخلايا الظهارية لتبين المنهجية مصورة والتحكم في هندسة الخلية الجماعية الأولى لتحقيق شكل اسطوانة وشكل المنشور، على التوالي في بيئة إدارة المحتوى في المؤسسة. وترد نتائج التصوير المتعدد الاتجاهات التي حصل عليها التباين الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

التحكم الكتلة الخلية الأولى 3D في جهاز مكعب جل هجين لتشكيلات نمط التكرار

نحن نقدم إجراءات للتحكم في شكل كتلة الخلية الأولى في مصفوفة 3D خارج الخلية للحصول على تشكيل نمط تكرار. ويستخدم جهاز مكعب الذي يحتوي على اثنين من الهلاميات المائية المختلفة تحقيقا للتصوير المتعدد الاتجاهات لتشكيل نمط الأنسجة.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

يستخدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتعزيز موثوقية نموذج ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد دون استخدام أي معدات خاصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا إجراء تجربة الثقافة ثلاثية الأبعاد القابلة للتكرار من خلال التحكم في حالة الثقافة الأولية داخل الجهاز المكعب. بعد إعداد خمسة من خمسة ملليمتر البولي الإطار مكعب، ووضع الإطار على شريحة المبردة مسبقا وصندوق الثلج واستخدام ماصة لإضافة 12 ميكروليتر من 1.5٪ أكاروز مسخ من الوجه العلوي للإطار مكعب إلى السطح السفلي.نشر agarose للحصول على سطح مستو والسماح للبوليمر لعلاج. استخدم الملاقط لشريحة الإطار إلى حافة الزجاج وتدوير الإطار بحيث يكون الجانب المفتوح مواجهًا لأسفل قبل إعادة وضع الإطار على الشريحة. بعد ملء السطحين التاليين من الإطار مع المزيد من agarose، كما أظهرت للتو، إسقاط agarose في وعاء من وجه مفتوح لتشكيل جدار agarose على الجانبين الرابع والخامس.لإعداد شكل كتلة خلية أولية حقن مصفوفة الخلية المناسبة لثقافة الخلية من الفائدة في الفضاء ثقافة مكعب هلام الهجين وتعيين قالب صغير ملفقة على المكعب. ثم ضع المكعب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. عندما يتم شفاء المصفوفة خارج الخلية، ورفع بعناية من العفن الصغير بحيث لا تتدهور المصفوفة.وسيتم ملفقة جيب في شكل القالب المطلوب في مصفوفة خارج الخلية. لتحميل الخلايا تركيز تعليق الخلية التجريبية بعد الطرد المركزي في خلية مناسبة المتوسطة ثقافة التجريبية وحقن الخلايا في الجيب داخل مصفوفة خارج الخلية. ضع المكعب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالوقوع في جيب المصفوفة خارج الخلية ، وملء المساحة التي تم إنشاؤها بواسطة القالب الصغير.في نهاية الحضانة، ضع المكعب في بئر واحد من 24 بئراً وأضف 100 ميكرولترات من خلية مناسبة متوسطة لثقافة البئر. حقن مصفوفة إضافية خارج الخلية لإغلاق الجيب والعودة المكعب إلى الحاضنة لمدة 25 دقيقة. عندما يتم الشفاء من المصفوفة خارج الخلية قطرة ما يقرب من 10 ميكرولترات من 20 درجة مئوية agarose على السطح العلوي إلى المكعب لإغلاق السطح وعلاج قطرة لمدة 10 إلى 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.ثم تغطية المكعب بأكمله مع المتوسطة الطازجة لتعزيز الضغط التناضح لتسهيل نقل التغذية إلى الخلايا داخل المكعب. بالنسبة للتعرف على الشكل ثلاثي الأبعاد غير الباضع بواسطة المراقبة متعددة الاتجاهات، ضع اللوحة على مرحلة المجهر واحصل على صور لكل جانب من المكعب بواسطة مجهري الحقول أو الطور الساطع، باستخدام ملاقط لتدوير خدمة المكعب ليتم تصويرها بين الالتقاطات. للتصوير المناعي من خلال المراقبة متعددة الاتجاهات، أولاً التبخر من البئر الذي يحتوي على المكعب وإصلاح المكعب في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية التثبيت، وغسل المكعب مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل. Impermeabilize المكعب مع 0.5٪ triton x-100 وBBS لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل المكعب ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق لكل غسيل ، قبل حظر أي ارتباط غير محدد بمصل الماعز ومخزن المناعة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ثم وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة وفقا لبروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة القياسية. ثم صورة جميع الاطراف الستة من المكعب على مجهر الليزر أو الفلورسنت كما أظهرت للتو. في هذه التجربة التمثيلية التصوير متعدد الاتجاهات من مكعبات هلام الهجين، المستزرعة مع الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية العادية، يوضح توليد الأولية أسطواني أو المنشور ثقافة الخلية على شكل المرحلة على النقيض من ذلك وتصوير المناعة الفلورية من الثقافات.هنا تلطيخ مناعي من الخلايا الظهارية البشرية العادية التي تسيطر عليها في البداية إلى شكل أسطواني في مكعب هلام الهجين، بعد أن يظهر جيل من شجرة الشعب الهوائية. تظهر الفروع العمودي على المحور الأسطواني ، كما يكشف عن ذلك التصوير متعدد الأبعاد. من المهم حقن كثافة عالية من الخلايا في جيب المصفوفة خارج الخلية ، حيث أن الكثافة المنخفضة للخلايا قد تؤدي إلى تدهور جودة الخلايا بعد الحضانة.هذا النمط الأسلوب هو تشكيل تكرار لنمط خلوي ثلاثي الأبعاد مع قياس كمي عن طريق التصوير متعدد الاتجاهات لدراسة آلية تطوير الطبق.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم<em&gt; في المختبر</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

متحكم يعمل الجهاز لتوليد السائل مقتطفات من الهباء الجوي السجائر الإلكترونية ودخان السجائر التقليدية

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...