Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Dette arbejde blev økonomisk støttet af JSPS KAKENHI (18H 04765) og programmet for at udbrede Tenure Track System, MEXT, Japan.

1. fabrikation af hybrid gel cube enhed
<ol><li>Forberede en polycarbonat (PC) cubic ramme enten ved hjælp af en spåntagende proces eller en 3D-printer. Størrelsen på rammen PC afhænger af stikprøvestørrelse. I denne undersøgelse brugte vi en ramme på 5 mm på hver side så at grenene havde tilstrækkelig plads til aflang under dyrkning.</li>
	<li>Placere rammen PC på en pre afkølet glas dias eller en anden glat overflade i en ice box (< 0 ° C) (figur 1A).</li>
	<li>Tilføj 12 ...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

Metoden fremlægges i dette papir er enkel og kan udføres uden højteknologisk udstyr. Samtidigt, kan en præcis celle klynge form kontrol resultat i 3D-rum af hydrogel opnås. Efter den indledende kontrol, kan cellerne vokse i HGC så meget som de er kulturperler på et fad. Den multi-retningsbestemt imaging udføres ved at dreje prøven med HGC ved hjælp af enhver mikroskopi system, og det betydeligt forbedrer den billeddiagnostiske kvalitet. Valget af materialer til HGC ramme og micromold er fleksibel, så længe de...

Betydningen af en 3D kultur, der bedre efterligner biologiske miljøer end en 2D kultur, fremhæves betydeligt i celle/væv kultur1,2,3. Samspillet mellem celler og ekstracellulære matrix (ECM) giver vigtigt stikord om morfogenese4,5. Mange væv formationer kan dukke op kun under 3D-miljøer, såsom folde proces6,7, invagination8og rørformede dannelse9,10. Talrige vanskeligheder forhindrer dog forskere Vindretning 3D eksperimenter fra 2D eksperimenter på et fad. En af de store vanskeligheder i 3D eksperimenter er spørgsmålet om billedbehandling 3D prøver. Sammenlignet med planar eksperimenter, er erhvervelse af relevante 3D billeder stadig udfordrende i mange tilfælde. Især er at opnå et passende 3D billede en vanskelig opgave, når stikprøvestørrelsen når rækken millimeter på grund af den store fokale dybde af lav forstørrelse objektiver. For eksempel, bliver fokale dybden mere end 50 µm, når en 10 x forstørrelse linsen bruges mens størrelsen på det enkelt celle er normalt mindre end 10 µm. For at forbedre den billeddiagnostiske kvalitet, udvikles højteknologi mikroskopi systemer (f.eks. to-foton mikroskopi11 og lys-ark mikroskopi system12), men deres anvendelighed er begrænset på grund af deres dyre pris. Som et alternativ, har vi tidligere udviklet en hybrid gel cube (HGC) enhed13. Enheden består af to typer af hydrogels: Agarosen som en støtte gel og en ECM såsom kollagen eller Matrigel som en kultur gel. HGC tillader os at indsamle prøven under dyrkning og rotere kuben for at opnå multi-retningsbestemt billeddannelse, som omhandler fokale dybde problem14.
En anden vanskelighed i 3D eksperimenter er deres lave repeterbarhed på grund af dårlig kontrollerbarhed af 3D-miljøer. I modsætning til en planar kultur på en plastik skål forekomme variationer i de indledende dyrkningsbetingelser nemt i et 3D-rum omgivet af et blødt materiale. En betydelig variation i de eksperimentelle resultater forringes den følgende analyse og masker de underliggende mekanismer. Mange engineering teknologier har udviklet for rumligt justere indre celler, såsom bioprinting15,16, fiber vævning17og stilladser18, men de kræver komplekse forbehandling eller specifikt specialdesignet udstyr. I modsætning hertil har vi udviklet en metode til at opnå 3D cellejustering i en HGC19.
I denne protokol illustreret vi en enkel procedure med almindeligt anvendte udstyr til at kontrollere figuren 3D oprindelige celle klynge i en HGC. Først, HGC fabrikationsproces blev demonstreret. Derefter, micromolds fabrikeret af fotolitografi eller en spåntagende proces blev placeret i HGC til at producere en lomme med en vilkårlig figur i en ECM. Efterfølgende, blev meget tætte celler efter centrifugering sprøjtet ind i lommen til at styre den oprindelige celle klynge figur i HGC. Netop kontrollerede celle klyngen kunne være afbildet fra mange retninger på grund af HGC. Normale menneskelige bronchiale epitel (NHBE) celler blev brugt til at vise kontrol af den oprindelige celle klynge figur og billeddannelse af grene fra flere retninger for at øge den billeddiagnostiske kvalitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

Betydningen af in vitro-3D kulturer fremhæves betydeligt i celle/vævskultur. Men manglen på eksperimentelle repeterbarhed er en af dens begrænsninger. Få repeterbare resultater af mønster dannelse forringes analyse af de underliggende selv-organisering mekanismer. At reducere variation i indledende kultur betingelser, såsom celle tæthed og distribution i den ekstracellulære matrix (ECM), er afgørende for at forbedre repeterbarhed af en 3D kultur. I denne artikel viser vi en simpel men robust procedure til kontrol af den oprindelige celle klynge figur i en 3D ekstracellulære matrix at opnå meget repeterbare mønster formationer. En micromold med en ønskede figur blev fabrikeret ved hjælp af fotolitografi eller en spåntagende proces, og det dannede en 3D lomme i ECM indeholdt i en hybrid gel cube (HGC). Højkoncentreret celler blev derefter injiceres i lommen så at figuren celle klynge matches med figuren fabrikerede skimmel. Den erhvervsdrivende HGC tilladt multi-retningsbestemt scanning af dens rotation, som aktiveret høj opløsning imaging og erobringen af hele væv struktur, selv om en lav forstørrelse linsen blev brugt. Normale menneskelige bronchiale epitel celler blev brugt til at vise metoden.

Normale menneskelige bronchiale epitel (NHBE) celler blev brugt til at vise den illustrerede metode og styre den oprindelige kollektive celle geometri for at opnå en cylinder form og en prisme form, henholdsvis i en ECM miljø. Multi-retningsbestemt imaging resultaterne af fasekontrast samt phalloidin farvning af en cylinder form (figur 4AB) og prisme form (figur 4 cD) er præsenteret. Cellerne ...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Indledende 3D celle klynge kontrol i en Hybrid Gel Cube enhed for gentagelig mønster formationer

Vi præsenterer en procedure til kontrol af den oprindelige celle klynge figur i en 3D ekstracellulære matrix til at opnå en gentagelig mønster dannelse. En kubisk enhed indeholder to forskellige hydrogels er ansat til at opnå multi-retningsbestemt tænkelig nemlig væv mønster dannelse.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Denne protokol bruger en enkel metode til at forbedre pålideligheden af en 3D-celle kultur model uden brug af specialudstyr. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan gennemføre det repeterbare 3D-kultureksperiment ved at kontrollere den oprindelige kulturtilstand i den kubiske enhed. Efter at have forberedt en fem gange fem millimeter polycarbonat kubikramme, placere rammen på en forkølet dias og en isboks og bruge en pipette til at tilføje 12 mikroliter af forvarmet 1,5% agarose fra den øverste side af kubikrammen til den nederste overflade.Spred agarose for at opnå en flad overflade og lad polymeren at helbrede. Brug en pincet til at skubbe rammen til kanten af glasset og drej rammen, så den åbne side vender nedad, før rammen sættes tilbage på sliden. Efter påfyldning af de næste to overflader af rammen med mere agarose, som netop vist, drop agarose i en beholder fra et åbent ansigt til at danne en agarose væg på den fjerde og femte side.For at oprette en indledende celle klynge form injicere en passende ekstracellulær matrix for celle kultur interesse i hybrid gel terning kultur plads og sæt en fabrikeret mikro skimmel på terningen. Derefter placere terningen i en kuldioxid inkubator i 25 minutter ved 37 grader Celsius. Når den ekstracellulære matrix er hærdet, skal du forsigtigt løfte mikroformen ud, så matrixen ikke forringes.En lomme i den ønskede form form vil blive fremstillet i den ekstracellulære matrix. Cellerne skal koncentrere den eksperimentelle celleaffjedring efter centrifugering i det relevante eksperimentelle cellekulturmedium og indsprøjte cellerne i lommen i den ekstracellulære matrix. Placer terningen i kuldioxid inkubatoren i 20 minutter ved 37 grader Celsius for at tillade cellerne at falde i den ekstracellulære matrix lomme, fylde rummet skabt af mikro skimmel.I slutningen af inkubationen, placere terningen i en brønd af en 24 brønd plade og tilsæt 100 mikroliter af den relevante cellekultur medium til brønden. Indsprøjt yderligere ekstracellulær matrix for at lukke lommen og returnere terningen til inkubatoren i 25 minutter. Når den ekstracellulære matrix er hærdet drop ca 10 mikroliter af 20 grader Celsius agarose på den øverste overflade til terningen for at lukke overfladen og helbrede faldet i 10 til 20 minutter ved 37 grader Celsius.Derefter dække hele terningen med frisk medium for at fremme osmotisk tryk for at lette overførslen af ernæring til cellerne i terningen. For noninvasive 3D form anerkendelse ved multidirectional observation, placere pladen på et mikroskop fase og få billeder af hver side af terningen ved lyse felt eller fase kontrast mikroskopi, ved hjælp af pincet til at rotere terning service, der skal afbildes mellem fanger. For immunfluorescerende billeddannelse ved multidirectional observation, først aspirere supernatant fra brønden indeholder terningen og fastgør terningen i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur.Ved afslutningen af fikseringen vaskes terningen to gange med PBS i 10 minutter pr. vask. Impermeabilize terningen med 0,5% triton x-100 og PBS i 10 minutter ved fire grader Celsius. Dernæst vaskes terningen tre gange i PBS i 10 minutter pr. vask, før du blokerer for uspecifikke bindinger med gedeserum og immunfluorescensbuffer i 60 minutter ved stuetemperatur.Derefter plette cellerne med passende primære antistof af interesse i henhold til standard antistof farvning protokoller. Derefter billede alle seks sider af terningen på en laser eller fluorescerende mikroskop som netop vist. I dette repræsentative eksperiment multidirectional imaging af hybrid gel terninger, dyrket med normale menneskelige bronkiale epitelceller, viser generation af en indledende cylindrisk eller prisme formet cellekultur ved fase kontrast og immunfluorescerende billeddannelse af kulturerne.Her immunfarvning af normale menneskelige epitelceller oprindeligt kontrolleret til en cylindrisk form i hybrid gel terningen, efter generation af bronkiale træ er vist. Grenene demonstrerer vinkelret på den cylindriske akse, som det er afsløret ved flerdimensional billeddannelse. Det er vigtigt at indsprøjte en høj celletæthed i den ekstracellulære matrixlomme, da en lav celletæthed kan resultere i forringelse af denne cellekvalitet efter inkubation.Denne metode mønster er den repeterbare dannelse af en 3D cellulære mønster med en kvantitativ måling ved multidirectional billeddannelse at studere mekanismen af parabol udvikling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling enkelte celler og Single Embryoner i 3D Indespærring: En ny enhed for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Udarbejdelse af 3D Kollagen Gels og mikrokanalerne for Studiet af 3D Interactions<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og Samling af 3D mikrokar

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Ligand Nano-klynge Arrays i et understøttet lipid-dobbeltlag

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogeler fra Pulmonal ekstracellulære matrix for 3D cellekultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En Microcontroller drives enhed for Generation af flydende ekstrakter fra konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En menneskelig 3D ekstracellulær matrix-Adipocyte kultur model for at studere matrix-celle metaboliske Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering af dynamiske miljøforhold ved hjælp af en mikrofluidisk højoverførselsenhed

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...