Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Dit werk werd financieel ondersteund door JSPS KAKENHI (18H 04765) en het programma te verspreiden Tenure Track systeem, MEXT, Japan.

1. fabricage van hybride gel kubus apparaat
<ol><li>Een polycarbonaat (PC) kubieke frame te bereiden met een machinale bewerking proces of een 3D-printer. De grootte van het frame van de PC is afhankelijk van de grootte van de steekproef. In deze studie gebruikten we een frame van 5 mm aan elke kant, zodat de takken had voldoende ruimte om te rekken tijdens het kweken.</li>
	<li>Plaats het frame van de PC op een dia vooraf gekoeld glas of een ander glad oppervlak in een koelbox (< 0 ° C) (figuur 1...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

De methode die in dit document gepresenteerd is eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder hoogtechnologische apparatuur. Gelijktijdig, kan een precieze cel cluster vorm controleresultaat in de 3D-ruimte hydrogel worden verkregen. Na de eerste controle, kunnen de cellen groeien in de HGC zo veel als ze gekweekt op een schotel zijn. De verschillende richtingen beeldvorming wordt uitgevoerd door het draaien van het monster met de HGC met behulp van een systeem van microscopie, en het verbetert aanzienlijk de kwaliteit van d...

Het belang van een 3D-cultuur, die beter biologische omgevingen bootst dan een 2D cultuur doet, is aanzienlijk benadrukt in cel/weefsel cultuur1,2,3. De interactie tussen de cellen en de extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke signalen met betrekking tot voedselproductie4,5. Veel weefsel formaties kunnen komen alleen onder 3D omgevingen, zoals vouwen proces6,7, invagination8en tubulaire vorming9,10. Echter talrijke moeilijkheden te voorkomen dat onderzoekers verschuiven naar 3D experimenten uit 2D experimenten op een schotel. Een van de grootste problemen in 3D experimenten is de kwestie van imaging 3D monsters. Vergeleken met vlakke experimenten, is verwerving van passende 3D-beelden nog uitdagend in veel gevallen. In het bijzonder, is het verkrijgen van een passende 3D beeld een moeilijke taak, wanneer de grootte van de steekproef het bereik van de millimeter als gevolg van de grote focale diepte van lage-vergroting lenzen bereikt. Bijvoorbeeld, bereikt de focal diepte meer dan 50 µm wanneer een 10 x vergroting lens wordt gebruikt terwijl de grootte van een enkele cel gewoonlijk minder dan 10 µm is. Ter verhoging van de kwaliteit van de beeldvorming, hoogtechnologische microscopie systemen worden ontwikkeld (bijvoorbeeld twee-foton microscopie11 en licht vel microscopie systeem12), maar de beschikbaarheid ervan is beperkt vanwege hun dure prijs. Als alternatief hebben we eerder een hybride gel kubus (HGC) apparaat13ontwikkeld. Het apparaat bestaat uit twee soorten hydrogels: agarose als een ondersteuning-gel en een ECM zoals collageen of Matrigel als een cultuur-gel. Het HGC laat ons toe om het monster te verzamelen tijdens het kweken en draai de kubus om verschillende richtingen imaging, dat zich richt op de focal diepte probleem14.
Een ander probleem in 3D experimenten is hun lage herhaalbaarheid vanwege de slechte controleerbaarheid van de 3D omgevingen. In tegenstelling tot een vlakke cultuur op een kunststof schotel optreden variaties in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur gemakkelijk in een 3D-ruimte omgeven door een zacht materiaal. Een aanzienlijke variatie in de experimentele resultaten verslechtert de volgende analyse en maskeert de onderliggende mechanismen. Vele engineering technologieën zijn ontwikkeld om het ruimtelijk uitlijnen afzonderlijke cellen, zoals de bioprinting15,16, vezel weven17, en steigers18, maar zij vereisen complexe voorbewerken of in het bijzonder ontworpen apparatuur. Wij hebben daarentegen een methodologie voor het bereiken van 3D Celuitlijning in een HGC19ontwikkeld.
In dit protocol geïllustreerd we een eenvoudige procedure met veel gebruikte apparatuur voor het beheersen van de 3D eerste cel cluster-vorm in een HGC. Ten eerste werd het fabricageproces van het HGC aangetoond. Vervolgens werden in de HGC voor de productie van een zakje met een willekeurige vorm in een ECM micromolds vervaardigd door fotolithografie of een machinale bewerking proces geplaatst. Zeer dichte cellen na het centrifugeren werden vervolgens geïnjecteerd in de zak om de eerste cel cluster vorm in de HGC te bepalen. Het cluster precies gecontroleerde cel kon worden beeld uit de vele richtingen vanwege de HGC. Normale cellen voor menselijke epitheliale bronchiale (NHBE) werden gebruikt om aan te tonen van de controle op de eerste cel cluster vorm en beeldvorming van de takken vanuit meerdere richtingen voor het verbeteren van de kwaliteit van de beeldvorming.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

Het belang van in vitro culturen van 3D is aanzienlijk benadrukt in cel/weefselkweek. Echter behoort het gebrek aan experimentele herhaalbaarheid tot haar beperkingen. De analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de zelf-organisatie verslechtert produceren weinig herhaalbare resultaten van patroonformatie. Vermindering van de variatie in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur, zoals de celdichtheid en distributie in de extracellulaire matrix (ECM), is cruciaal voor het verbeteren van de herhaalbaarheid van een 3D-cultuur. In dit artikel tonen we een eenvoudige, maar robuuste procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen zeer herhaalbare patroon formaties. Een micromold met een gewenste vorm werd vervaardigd met behulp van fotolithografie of een machinale bewerking proces, en het een 3D zak gevormd in de ECM vervat in een hybride gel kubus (HGC). Sterk geconcentreerde cellen werden vervolgens geïnjecteerd in de zak zodat de cel cluster vorm gekoppeld aan de shape verzonnen schimmel. De werknemer HGC toegestaan verschillende richtingen scannen door de rotatie, waardoor hoge resolutie beeldvorming en de verovering van de hele weefsel structuur ook al een laag-vergroting lens werd gebruikt. Normale menselijke bronchiale epitheliale cellen werden gebruikt om aan te tonen van de methodologie.

Normale cellen voor menselijke epitheliale bronchiale (NHBE) werden gebruikt om te tonen de geïllustreerde methodologie en controle van de geometrie van de eerste collectieve cel om een cilinder vorm en de vorm van een prisma, respectievelijk in een ECM-omgeving te bereiken. De verschillende richtingen imaging resultaten verkregen door fase contrast, alsmede het phalloidin kleuring van een cilinder vorm (figuur 4AB) en de vorm van de prisma ...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige methode voor het verbeteren van de betrouwbaarheid van een 3D-cel cultuurmodel zonder het gebruik van speciale apparatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we het herhaalbare 3D-cultuurexperiment kunnen uitvoeren door de initiële cultuurconditie binnen het kubieke apparaat te controleren. Na het voorbereiden van een vijf bij vijf millimeter polycarbonaat kubieke frame, plaats het frame op een voorgekoelde glijbaan en een ijsdoos en gebruik een pipet om 12 microliters van voorverwarmde 1,5% agarose toe te voegen van de bovenkant van het kubieke frame naar het onderste oppervlak.Spreid de agarose om een vlakke ondergrond te verkrijgen en laat het polymeer te genezen. Gebruik een pincet om het frame naar de rand van het glas te schuiven en het frame te draaien, zodat de open zijde naar beneden wordt gericht voordat het frame terug op de dia wordt geplaatst. Na het vullen van de volgende twee oppervlakken van het frame met meer agarose, zoals net aangetoond, drop de agarose in een container van een open gezicht om een agarose muur te vormen aan de vierde en vijfde zijden.Het opzetten van een initiële celclustervorm injecteer een geschikte extracellulaire matrix voor de celcultuur van belang in de hybride gelkubuscultuurruimte en stel een gefabriceerde micromal op de kubus. Plaats de kubus vervolgens 25 minuten in een koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Wanneer de extracellulaire matrix is uitgehard, voorzichtig til de micro-mal, zodat de matrix niet verslechtert.Een zak in de gewenste vorm van de vorm zal worden vervaardigd in de extracellulaire matrix. Om de cellen te laden concentreert de experimentele celsuspensie na centrifugatie in het aangewezen experimentele celkweekmiddel en injecteer de cellen in de zak binnen de extracellulaire matrijs. Plaats de kubus in de koolstofdioxide incubator gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius om de cellen te vallen in de extracellulaire matrix zak, het vullen van de ruimte gecreëerd door de micro-mal.Plaats de kubus aan het einde van de incubatie in een put van een 24 putplaat en voeg 100 microliter van het juiste celkweekmedium toe aan de put. Injecteer extracellulaire matrix om de zak te sluiten en breng de kubus 25 minuten terug naar de couveuse. Wanneer de extracellulaire matrix is uitgehard daling ongeveer 10 microliter van 20 graden Celsius agarose op het bovenste oppervlak van de kubus om het oppervlak te sluiten en de daling te genezen gedurende 10 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius.Bedek vervolgens de gehele kubus met vers medium om osmotische druk te bevorderen voor het vergemakkelijken van de overdracht van voeding naar de cellen in de kubus. Voor niet-invasieve 3D-vormherkenning door multidirectionele observatie plaatst u de plaat op een microscooppodium en verkrijgt u beelden van elke zijde van de kubus door een helder veld- of fasecontrastmicroscopie, met behulp van een pincet om de kubusservice te draaien die tussen vangt moet worden afgebeeld. Voor immunofluorescente beeldvorming door multidirectionele observatie, eerst de supernatant uit de put met de kubus aanzuigen en de kubus 20 minuten bij kamertemperatuur in 4%paraformaldehyde bevestigen.Aan het einde van de fixatie, was de kubus twee keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Ondoordring de kubus met 0,5%triton x-100 en PBS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens de kubus drie keer in PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt, voordat u een niet-specifieke binding met geitenserum en immunofluorescentiebuffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur blokkeert.Bevlek vervolgens de cellen met het juiste primaire antilichaam van belang volgens standaard antilichaam kleuring protocollen. Dan beeld alle zes zijden van de kubus op een laser of fluorescerende microscoop zoals net aangetoond. In dit representatieve experiment toont multidirectionele beeldvorming van hybride gelkubussen, gekweekt met normale menselijke bronchiale epitheelcellen, de generatie van een eerste cilindrische of prismavormige celkweek aan door fasecontrast en immunofluorescente beeldvorming van de culturen.Hier immuno kleuring van normale menselijke epitheelcellen die aanvankelijk aan een cilindrische vorm in de hybride gelkubus worden gecontroleerd, na generatie van de bronchiale boom wordt getoond. De takken tonen de loodrecht op de cilindrische as, zoals blijkt uit multidimensionale beeldvorming. Het is belangrijk om een hoge dichtheid van cellen in de extracellulaire matrixzak te injecteren, omdat een lage dichtheid van cellen kan leiden tot verslechtering van die celkwaliteit na incubatie.Deze methode patroon is de herhaalbare vorming van een 3D cellulair patroon met een kwantitatieve meting door multidirectionele beeldvorming om het mechanisme van schotel ontwikkeling te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning en montage van 3D microvaten

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Een Microcontroller beheerd apparaat voor de generatie van vloeibare extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...