Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
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Ce travail a été soutenu financièrement par JSPS KAKENHI (18H 04765) et le programme à diffuser Tenure Track System, MEXT, Japon.

1. fabrication de dispositif de cube pour le gel hybride
<ol><li>Préparer un cadre de cubes en polycarbonate (PC) à l’aide d’un procédé d’usinage ou une imprimante 3D. La taille de la trame de la PC dépend de la taille de l’échantillon. Dans cette étude, nous avons utilisé un cadre de 5 mm de chaque côté afin que les branches avaient suffisamment d’espace pour s’allonger au cours de la mise en culture.</li>
	<li>Poser le cadre de la PC sur une lame de verre préalablement refroidi ou une autre sur...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. 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M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. 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B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

La méthode présentée dans cet article est simple et peut s’effectuer sans le matériel de haute technologie. Parallèlement, un résultat de contrôle précis cell cluster forme dans l’espace 3D d’hydrogel peut être obtenu. Après le contrôle initial, les cellules peuvent croître dans la HGC autant qu’ils sont cultivés sur un plat. L’imagerie multidirectionnelle s’effectue en faisant tourner l’échantillon avec la HGC en utilisant n’importe quel système de microscopie, et il améliore considérabl...

L’importance d’une culture 3D, qui mieux imite des milieux biologiques que ne le fait une culture 2D, est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus1,2,3. L’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices importants au sujet de la morphogenèse4,5. Nombreuses formations tissulaires peuvent apparaître uniquement dans des environnements 3D, comme le pliage processus6,7, invagination8et formation tubulaire9,10. Toutefois, nombreuses difficultés empêchent les chercheurs de se déplacer à des expériences 3D d’expériences 2D sur un plat. Une des difficultés majeures dans les expériences 3D est celui de l’imagerie 3D échantillons. Par rapport aux expériences planaires, acquisition d’images 3D appropriés est toujours difficile dans de nombreux cas. En particulier, l’obtention d’une image 3D appropriée est une tâche difficile lorsque la taille de l’échantillon atteint la plage de millimètre en raison de la grande profondeur focale des lentilles de grossissement faible. Par exemple, la profondeur focale atteint plus de 50 µm lorsqu’un 10 x grossissement objectif est utilisé alors que la taille de la cellule unique est normalement inférieur à 10 µm. Afin d’améliorer la qualité d’imagerie, systèmes de microscopie de haute technologie sont développées (p. ex., microscopie biphotonique11 et système de microscopie de lumière-fiche12), mais leur disponibilité est limitée en raison de leur prix élevé. Comme alternative, nous avons déjà développé un hybride gel cube (HGC) dispositif13. Le dispositif se compose de deux types d’hydrogels : gel d’agarose comme un gel de l’aide et un ECM comme le collagène ou Matrigel comme un gel de la culture. Le HGC permet de recueillir les échantillons au cours de la mise en culture et faire pivoter le cube pour atteindre l’imagerie multidirectionnel, qui aborde le problème de profondeur focale14.
Une autre difficulté dans des expériences 3D est leur faible répétabilité en raison de la piètre contrôlabilité des environnements 3D. Contrairement à une culture plane sur un plat en plastique, des variations dans les conditions de culture initiale se produisent facilement dans un espace 3D, entouré d’un matériau doux. Une variation significative dans les résultats expérimentaux détériore l’analyse qui suit et qui masque les mécanismes sous-jacents. Ingénierie de nombreuses technologies ont été développées pour aligner dans l’espace des cellules individuelles, par exemple bioprinting15,16,17et18d’échafaudage, de tissage de fibres, mais elles nécessitent un prétraitement complexes ou spécifiquement matériel conçu. En revanche, nous avons développé une méthodologie pour réaliser l’alignement de cellule 3D dans un HGC19.
Dans ce protocole, nous montre une procédure simple avec équipement couramment utilisé pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale 3D dans un HGC. Tout d’abord, le processus de fabrication de la HGC a été démontré. Puis, micromolds fabriquées par photolithographie ou un processus d’usinage ont été placés dans la HGC pour produire une poche avec une forme arbitraire dans un ECM. Par la suite, des cellules très denses après centrifugation ont été injectées dans la poche pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans la HGC. L’amas de cellule contrôlée avec précision pourrait être photographié de nombreuses directions en raison de la HGC. Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisées pour démontrer le contrôle de la forme de grappe de cellule initiale et l’imagerie des branches dans des directions multiples, pour améliorer la qualité d’imagerie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

L’importance des cultures in vitro de 3D est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus. Toutefois, l’absence de répétabilité expérimentale est l’un des ses restrictions. Quelques résultats reproductibles de la formation détériore l’analyse les mécanismes sous-jacents à l’auto-organisation. Réduire la variation dans des conditions de culture initiale, comme la densité cellulaire et la distribution de la matrice extracellulaire (ECM), est cruciale pour améliorer la répétabilité d’une culture 3D. Dans cet article, nous démontrons une procédure simple mais robuste pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir des formations modèle hautement reproductible. Un micromold avec une forme désirée a été fabriqué à l’aide de la photolithographie ou un processus d’usinage, et il forma une poche 3D dans l’ECM contenue dans un cube de gel hybride (HGC). Très concentrée de cellules ont été ensuite injectés dans la poche pour que la forme des cellules cluster mis en correspondance avec la forme du moule fabriqué. Le HGC indépendant autorisés multidirectionnel le balayage par sa rotation, qui a permis d’imagerie à haute résolution et la capture de la structure du tissu entier même si une lentille de grossissement faible a été utilisée. Les cellules épithéliales bronchiques humaines normales ont été utilisés pour démontrer la méthodologie.

Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisés pour démontrer la méthode illustrée et contrôler la géométrie de la cellule collective initiale pour obtenir la forme d’un cylindre et une forme de prisme, respectivement dans un environnement ECM. Les résultats d’imagerie multidirectionnels obtenus par contraste de phase comme phalloïdine coloration d’une forme de cylindre (Figure 4 aB) et la forme...

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Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Ce protocole utilise une méthode simple pour améliorer la fiabilité d’un modèle de culture cellulaire 3D sans l’utilisation d’un équipement spécial. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons mener l’expérience de culture 3D reproductible en contrôlant l’état de culture initial dans le dispositif cubique. Après avoir préparé un cadre cubique en polycarbonate de cinq par cinq millimètres, placez le cadre sur une glissière pré-refroidie et une boîte à glace et utilisez une pipette pour ajouter 12 microlitres de 1,5 % préchauffé s’est levé de la face supérieure du cadre cubique à la surface inférieure.Étendre l’agarose pour obtenir une surface plane et permettre au polymère de guérir. Utilisez des pinces à épiler pour faire glisser le cadre jusqu’au bord du verre et faire pivoter le cadre de sorte que le côté ouvert soit orienté vers le bas avant de remettre le cadre sur la glissière. Après avoir rempli les deux surfaces suivantes du cadre avec plus d’agarose, comme nous venons de le démontrer, déposez l’agarose dans un récipient d’une face ouverte pour former un mur agarose sur les quatrième et cinquième côtés.Pour mettre en place une forme initiale de cluster cellulaire injecter une matrice extracellulaire appropriée pour la culture cellulaire d’intérêt dans l’espace hybride de culture cube gel et mettre un moule micro fabriqué sur le cube. Ensuite, placez le cube dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque la matrice extracellulaire est guérie, soulevez soigneusement le moule micro afin que la matrice ne se détériore pas.Une poche dans la forme désirée de moule sera fabriquée dans la matrice extracellulaire. Pour charger les cellules concentrer la suspension cellulaire expérimentale après centrifugation dans le milieu de culture cellulaire expérimentale approprié et injecter les cellules dans la poche dans la matrice extracellulaire. Placez le cube dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules de tomber dans la poche de matrice extracellulaire, remplissant l’espace créé par le moule micro.À la fin de l’incubation, placer le cube dans un puits d’une plaque de puits de 24 puits et ajouter 100 microlitres du milieu de culture cellulaire approprié au puits. Injectez une matrice extracellulaire supplémentaire pour fermer la poche et remettre le cube à l’incubateur pendant 25 minutes. Lorsque la matrice extracellulaire est guérie, une chute d’environ 10 microlitres de 20 degrés Celsius s’est élevée sur la surface supérieure jusqu’au cube pour fermer la surface et guérir la chute pendant 10 à 20 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, couvrez le cube entier avec un milieu frais pour favoriser la pression osmotique pour faciliter le transfert de la nutrition vers les cellules à l’intérieur du cube. Pour la reconnaissance de la forme 3D non invasive par observation multidirectionnelle, placez la plaque sur une scène de microscope et obtenez des images de chaque côté du cube par microscopie de champ lumineux ou de contraste de phase, à l’aide d’une pince à épiler pour faire pivoter le service cube à image entre les captures. Pour l’imagerie immunofluorescente par observation multidirectionnelle, aspirez d’abord le supernatant du puits contenant le cube et fixez le cube en paraformaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante.À la fin de la fixation, laver le cube deux fois avec du PBS pendant 10 minutes par lavage. Impermeabilize le cube avec 0,5%triton x-100 et PBS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez le cube trois fois en PBS pendant 10 minutes par lavage, avant de bloquer toute liaison non spécifique avec le sérum de chèvre et tampon d’immunofluorescence pendant 60 minutes à température ambiante.Puis tacher les cellules avec l’anticorps primaire approprié d’intérêt selon les protocoles standard de coloration des anticorps. Puis l’image des six côtés du cube sur un microscope laser ou fluorescent comme vient de le démontrer. Dans cette expérience représentative, l’imagerie multidirectionnelle des cubes de gel hybrides, cultivés avec des cellules épithéliales bronchiques humaines normales, démontre la génération d’une culture cellulaire cylindrique ou prisme initiale par contraste de phase et imagerie immunofluorescente des cultures.Ici, la coloration immuno des cellules épithéliales humaines normales initialement contrôlées à une forme cylindrique dans le cube de gel hybride, après génération de l’arbre bronchique est montrée. Les branches démontrent le perpendiculaire à l’axe cylindrique, comme indiqué par la formation image multidimensionnelle. Il est important d’injecter une forte densité de cellules dans la poche de matrice extracellulaire, car une faible densité de cellules peut entraîner une détérioration de cette qualité cellulaire après l’incubation.Ce modèle de méthode est la formation reproductible d’un modèle cellulaire 3D avec une mesure quantitative par imagerie multidirectionnelle pour étudier le mécanisme du développement de plat.

Research

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Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Un microcontrôleur exploité le dispositif pour la génération d’extraits liquides d’aérosol de Cigarette fumée et électronique de Cigarette classique

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...